全 文 ：兰花育种技术研究进展
吴 根 良1 ,商世 能2 ,沈 国正1 ,孙 　瑶1
(1.浙江省杭州市农业科学研究院 ,杭州 310024;2.浙江省杭州万向职业技术学院 ,杭州 310023)
摘要:综述了兰花的种子离体萌发 、利用生化技术和分子标记进行兰花种质资源分类和种间品种间鉴
别。同时概述了调控花色素合成酶 、花器官形成 、子房发育和胚珠发育以及构成建兰花叶病毒(CyMV)等
特异基因分离克隆 ,以及转基因技术等研究进展 ,并对我国兰花育种进行了展望。
　　关键词:兰花;离体萌发;分子标记;基因分离;基因转化;育种
中图分类号:S682. 31 文献标识码:B 　　文章编号:1001 - 0009(2006)04 - 0115 - 03
　　兰花一般是指兰科植物(Orchidaceae),它是鲜花植物中
最大科之一 ,全世界约有 800 多属 , 25 000 多种 , 分布于世界
各地 ,大多数种类分布于东南亚 、澳大利亚 、中南美洲 、非洲
和马达加斯加。我国的野生兰科植物约有 173 属 , 1 240 多
种[ 1] ,在南北各地均有分布 , 但以云南 、台湾 、海南最为丰富。
兰花是珍贵的观赏花卉 ,此外还有作为药用的天麻(Gast ro-
dia elata)、白芨 、红门兰等和作香料的香子兰等 , 有极高的
经济价值。
　　具有观赏和药用价值的兰科植物目前在国际 、国内市场
上占有重要地位。保护和利用我国的野生兰科植物 ,并拥有
和选育新的种源 ,才能在世界各国兰花业竞争日益激烈的今
天占有一席之地。
1 兰花种子的离体萌发
　　远缘杂交和品种间杂交是兰花育种的重要方法之一。
兰花种子萌发是兰花杂交育种的重要环节 ,因为在自然条件
下兰花种子的萌发率很低。
1. 1 共生萌发
　　Bernard 在 1899 年首次分离出兰花的根菌 , 并用其感染
兰花的种子进行萌发试验 ,从而创立了兰花种子共生萌发的
方法。他指出:在自然条件下兰科植物种子萌发需要适宜的
真菌感染 ,它促进种子萌发就在于把胚和基质连接起来 , 形
成共生系统。在这个共生系统中真菌促进了种子的糖异生
及贮藏物质的利用 ,并在它开始光合作用前 , 持续提供营养
物质。我国兰科植物菌根菌研究发展很快 ,天麻菌根菌已经
应用于天麻种子萌发和人工栽培。徐锦堂等从天麻原球茎
中分离出紫萁小菇(Mycana o smudicola), 用天麻种子拌该
第一作者简介:吴根良 , 1963 年 10 月
生 ,本科 , 高级农艺师 ,主要从事蔬菜花
卉栽培技术研究和技术推广工作 , 主持
完成的相关重要科研项目有国家重大
科技产业工程《工厂化高效农业科技示
范工程》专题一项;省级重点项目“切花
月季高产 、优质栽培技术开发” , “主要
鲜切花新品种引种与优质高效栽培技术研究”等 , 曾荣获省
市各类科技进步奖五项 , 现主持浙江省科技厅重点项目“名
贵花卉卡特兰产业化关键技术研究”等项目。
*基金项目:杭州市科技发展计划(200462N08)。
收稿日期:2006 - 01 - 14
菌 ,播种后种子的萌发率可达 20%以上 , 为此促进了天麻的
人工栽培。郭顺星等对白芨种子的共生萌发进行了研究 , 拌
菌后的种子萌发率 、原球茎和营养器官生长速率显著高于对
照。郭顺星等对真菌在石斛(Dendrobium)种子萌发中的作
用进行了研究。在种子共生萌发研究中 ,尚有很多问题需要
进一步深入探讨 ,如兰科植物菌根菌的种类和特点 、兰科植
物与真菌的相互作用机制 、优良共生菌的筛选 、兰科菌剂的
研制等。
1. 2 非共生萌发
　　Bernard以眉兰(Ophry s)的块茎配制培养基 , 使卡德丽
亚兰(Cattley a)与蕾丽亚兰(Laelia)杂交种的种子成功萌
发 ,开创了非共生萌发的先例。 随后 , Arditti用非共生萌发
对齿瓣兰(Odonto glossum)、蝴蝶兰(Phalaenopsis)、石斛
兰 、文心兰(Oncidium)等种子进行萌发研究 ,得到了正常的
种苗。
　　兰花中有些种类未成熟或接近成熟的种子比成熟种子
更容 易 萌 发。 仙 人 指 甲 兰 ( Aerides)、 白 拉 索 兰
(Brassavola)、布鲁通氏兰 、卡德丽亚兰 、厚杯兰 、树兰(Epi-
dendrum)、文心兰 、蝴蝶兰 、肾药兰和万代兰(Vanda)等 10
个属的 19 个种和 15 个杂交种的种子萌发试验证明 ,未成熟
种子能很好萌发 ,最短的是在授粉后 40 ～ 50d萌发。
　　对于萌发难度较大的地生兰 ,进行适当的种子预处理可
以提高萌发率。段金玉等对兰属(Cymbidium)10 种植物的
种子离体萌发研究表明 , 用 0. 1mo l / L 氢氧化钠浸泡种子
10 ～ 30min ,能使多花兰(C. f lo ribundun)、春兰(C. goeringii
)、双飞燕(C. goer. )、线叶春兰(C. goer. v ar. ser ratum)、
寒兰(C. kanran)、套叶兰(C. cype rifo lium)等种子的萌发
率提高 10 倍以上。
　　大部分兰花种子可通过无菌萌发方式发芽 , 而萌发率因
基因型而异。气生兰及其杂交后代的种子萌发力较强 , 地生
兰种子萌发率普遍较低。 即使同为蝴蝶兰不同杂交组合的
种子萌发率和幼苗生长发育也不同[ 2] 。一般在种子无菌萌
发过程中激素是培养基中不可缺少的成分 , 但有人认为卡德
丽亚兰种子萌发可采用不含激素的 MS 培养基[ 3] 。杨美纯
等认为在 MS 、KC 和花宝三种培养基中 , MS 最适合蝴蝶兰
种子的萌发 ,香蕉汁 150g / L 可明显提高种子萌发率并促
进幼苗生长[ 4] 。
2 兰花的分类鉴定
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　　兰花存在属间自然杂交种 、属内种间 , 变种间和品种间
的自然杂交种 ,人们常凭形态特征鉴定 ,如在云南新近发现
的变种岩地兜兰(Paphiopedilum t ranlienianum var . sax o-
sum)[ 5] 。研究者利用同工酶技术对国兰品种或变种进行鉴
定分类 ,得到的结果与传统的形态分类基本相似[ 6] 。国内外
应用分子标记术进行兰花的分类已有报道。学者在杂交中
观察到春兰与建兰 、寒兰和墨兰(C. sinense)具有较高的亲
和性;蕙兰(C. faberi)、纹瓣兰(C. aloifo lium)、鼓槌石斛
(D. chryso to xum)和蝴蝶兰杂交则无亲和性。经 RAPD 分
析 ,发现春兰与建兰 、寒兰和墨兰的亲缘关系较近 ,与蕙兰和
纹瓣兰亲缘关系较远 , 与石斛兰和蝴蝶兰更远 。文李利用
RAPD技术分析兰属 5个种 2个变种共 13 个品种间的亲缘
关系。从 55 种 10个碱基随机引物中筛选出 4种引物 ,扩增
出 93 条多态性带 , 多态率为 100%, 经聚类分析 , 表明:建
兰 、墨兰和春兰的亲缘关系较近 , 而春剑(C . long ibractea-
tum)、寒兰 、独占春(C. eburneum)和兔耳兰(C. lancifoli-
um)与建兰的关系较近[ 7] 。谭文澄等采用 LZF - 1 寡核苷
酸探针和限制性内切酶 Hinf 1 检测了兰属 23 个样株和石
斛兰属 1 个样株的 DNA 酶切片断 , 获得了清晰易读的由 6
～ 15 条带组成有特异性的遗传指纹图谱。各种植物谱带各
具特异性 ,可见其亲缘关系不同;相同种的植物谱带条数一
致 ,片断的分子量类似 , 此方法能获得特异的 DNA 图谱 , 可
进一步应用于兰属的分子遗传分析[ 8] 。在栽培品种的鉴定
上 ,梁红健等使用 10 种 20 个碱基引物对 19 个中国兰花品
种的基因组 DNA 进行扩增 ,共产生 83 条扩增带 , 其中80 条
为多态性带。每个兰花品种都有其特有的扩增带可与其它
品种区别开来。这种特异的条带可作为一个品种的分子标
记应用于品种鉴定 , RAPD对基因组的分析结果与传统分类
学的结果基本相似。
3　兰花特异基因的分离克隆
3. 1 花色基因
　　兰花的花色是重要的育种目标。近几年从兰花的不同
组织中获得了许多基因和基因相关片断。查尔酮合成酶(又
称苯基苯乙烯合成酶 cha lcone synthase , CHS)是花青素生
物合成的一个重要的关键酶。利用转基因共抑制的特点 , 将
查尔酮合成酶反义基因 DNA 转到花卉中 , 可以改变植物的
花色。 Liew 等利用同源探针的方法 , 从Bromheadia finlay-
soniana 的 cDNA 文库中克隆出 3 个 CHS 基因 OCHS3、
OCHS4 和 OCHS8 , 其序列长度分别为 1 445 bp、1 382 bp
和 1439 bp。三者同源性达 97%以上。为了探析控制蝴蝶
兰花色的机制 ,研究者以“白花红唇蝴蝶兰”和“红花朵丽蝶
兰”为材料 , 进行了 CHS cDNA 克隆分析 , 发现前者约有 11
个 CHS 基因 , 后者约有 7 个 CHS 基因 ,可见蝴蝶兰 CH S 基
因为多基因族。从“白花红唇蝴蝶兰”中选取出的 pOCHS01
克隆系 , DNA 序列长度为 1 498 bp , 可编码 390 个氨基酸。
利用 pOCHS01作探针 , 对以“粉红花蝴蝶兰” 为母本与“白
花蝴蝶兰”杂交后代的淡红花 、晕红花和白花 Southern 杂交
分析 ,考察到子代的杂交带与母本相似 , 而与父本完全不同。
因此认为“白花红唇蝴蝶兰”的 pOCHS01 克隆系 , 可能是负
责红花或喷点花花色表达的基因 , 而白花亲本可能无
pOCHS01 基因存在 , 它可能由其它 CHS 基因负责控制。韩
颖颖等利用逆转录—聚合酶链式反应(RT —PCR)得到在蝴
蝶兰花瓣中特异性表达的查尔酮合成酶 cDNA(pchs - 1)。
经 DNA 序列分析表明 , 该序列与已发表的查尔酮合成酶基
因有很高的同源性[9] 。查尔酮合成酶是次生代谢的关键酶 ,
编码该酶的基因发生抑制后 , 既会引起易于观察的表型变
化 ,又不会影响植物的生长。获得相关基因为深入开展改良
花色的基因工程 ,奠定了一定的基础。
3. 2 花发育基因
　　最近的研究表明 , 许多基因和基因片断与花的发育有
关。 Yu 等提取了石斛兰属品种‘M adame Thong - In’ 营养
期和花期的茎尖分生组织总 RNA ,利用 mRNA 差异显示方
法 ,发现营养期有 53个特异表达的 cDNA 克隆 , 而在花期有
16 个特异表达的 cDNA 克隆。通过 Northern blo t 分析 , 证
实在由营养生长向生殖生长的转变中 , 有 12 种 cDNA 克隆
表达降低 , 而 8 种 cDNA 克隆表达增加。序列分析表明 , 其
中 5 个基因可能是与花的转变有关的基因。他们进一步从
兰花转化期的茎尖分生组织得到 gene 7(o tg 7)并用其为探
针 ,分离出 3 个基因 DOMADS1、DOMADS2 和 DOMADS3 ,
它们与花器官的形成有关[ 10 ,11] 。
　　在兰科植物中子房的发育是由授粉启动的。目前已发
现和分离了一批控制兰花子房发育的特异基因。如蝴蝶兰
PH AL. 039基因 , 在子房发育的不同阶段都有表达 , 可能是
子房发育的重要调控基因。利用 PH AL. 039 作探针 , 在拟
南芥花芽的 cDNA 文库中发现了与其同源的基因 ATML 1。
　　张宪省等也对蝴蝶兰(P . ‘Gene ralku’ ho r. )在授粉后
的子房发育过程进行了研究。结果显示:在授粉后 12 、24 和
48h , 柱头和花柱中乙烯的产生和 ACC 氧化酶 mRNA 的积
累显著下降 ,而子房内却明显上升 , 表明授粉后雌蕊中乙烯
的产生与 ACC 氧化酶基因的表达密切相关。他们进一步分
析了生长素 、乙烯及去雄等与授粉有关因子调节下 ACC 合
成酶和 ACC 氧化酶基因在朵丽兰(Doritaenopsis hybrid
Ho r t. )花中的表达。结果表明 , 生长素和乙烯均可诱导
ACC 合成酶和 ACC 氧化酶的 mRNA 在花器官中积累 , 而
且积累模式相似。然而 ,去雄却不能诱导这两个基因在花器
官中表达。原位杂交结果表明 , 生长素和乙烯处理后 , ACC
氧化酶的 mRNA 在柱头的表皮和薄壁细胞中积累。 Bui和
O’ Neill发现 3 种 ACC 合成酶基因在蝴蝶兰授粉后的子房
中起着重要作用。在蝴蝶兰授粉后 1h 便可在柱头上检测到
PH AL– ACS 2 的表达 , 2h 后可在子房中检测到 PHAL –
ACS 3 的表达 ,而授粉后 6h 才可检测出 PHAL – ACS 1 表
达。利用外源生长素刺激 , 进行假授粉 , 也可在柱头和子房
中发现 PHAL – ACS 2 和 PH AL – ACS 3 的先表达。可
见这两种 ACC 合成酶基因的表达 , 是授粉的初始信号 , 而
PH AL – ACS 1 则是次级信号。
3. 3 胚珠发育基因
　　研究胚珠的发育可以揭示许多有关花发育的机制问题。
蝴蝶兰在胚珠成熟时期的 cDNA 文库已被构建 , 并已分离
出一批胚珠发育特异 cDNA 克隆。其中 cDNA 克隆 O108、
O126 、O129 等均为在成熟胚珠中表达或优势表达的特异基
因。 O138 是一个与成熟胚珠发育相关的基因 , 该基因的
mRNA 在成熟胚珠和根中大量积累 , 但在大孢子母细胞时
期的胚珠中和子房中积累水平很低。 DNA 序列分析表明 ,
该基因含一个编码 284 个氨基酸 , 分子量为 30kD 的开放阅
读框(ORF)[ 12] 。
3. 4　花叶病毒基因
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　　建兰花叶病毒(CyM V)和齿兰环斑病毒(ORSV)是危害
兰花的两种重要病毒 ,对兰花生产威胁巨大。目前基因组序
列已全部测定 , RNA 基因组为 6 227 bp , 3’ 端有 poly(A)加
尾 , 5’ 端有带帽结构 , 与马铃薯 X病毒类似[ 13] 。其基因组结
构包含 5 个 ORF , ORF 1 编码一个大小为 160 kDa 的依赖
RNA 的 RNA 聚合酶 , ORF 2 ～ 4 编码一个分子量为 26 kDa
/ 13 kDa / 10 kDa的三基因连锁结构 , ORF 5 编码 24 kDa
的外壳蛋白(coat pr otein , CP)。潘俊松等测出 CP 基因大
小为 666nt , 核苷酸顺序与国外文献报道序列同源性为
88. 8% ～ 96. 1%, 推算出氨基酸同源性为 75. 6% ～
91. 0%, 外壳蛋白亚基氨基酸顺序差异主要在近 C - 端部
分[ 13] 。 Barry 等通过比较不同来源的 CyMV 的运动蛋白
(emovement pro tein ,MP)基因及齿兰环斑病毒编码 54 kDa
蛋白基因序列的差异 , 发现新加坡 、日本 、韩国\德国和夏威
夷群岛的 CyMV 和 ORSV 的基因序列亲缘关系很近 , 核苷
酸序列的同源性达 91%～ 99%。刘志昕等从石斛兰中获得
CyMV 分离物中提取病毒 RNA , 用 RT - PCR 方法获得约
500 bp MP 基因片断。序列分析表明 , 该基因片断由 474 个
核苷酸组成 ,与夏威夷分离物 、新加坡分离物相应基因核苷
酸序列分别具有 97. 8%同源性。根据核苷酸序列推导该片
断含由个部分重叠的 ORF , 分别编码 14 kD、12 kD和 10kD
的多肽[ 14] 。
4　基因转化
　　目前进行基因转化研究的兰花种类有蝴蝶兰属 、兰属 、
石斛兰属 、文心兰属 、万代兰属 、五唇兰属(Doritaenopsis)、
卡德丽亚兰属和长萼兰属(Brassia)等[ 15 ～ 17] 。至今尚停留
在建立基因转化体系的水平 ,还未达到应用阶段。
　　在基因转化中 ,花粉管法较为简便。它是在蝴蝶兰的子
房受精时 ,将 DNA 从花粉管带入受精卵。经研究以授粉后
第 30d 前后注射 DNA 效果最好。
　　另一类的基因转化的方法是基因枪和农杆菌法。 Chia
等报道了通过微粒子轰炸 , 在万代兰的原球茎(pro toco rm)
上检测到萤火虫荧光素酶基因(LUX)瞬间表达。研究者以
卡那霉素为选择剂 , 将 NEO 基因转入石斛兰 , 21 个月后获
得稳定表达。有人将花色素苷合成调控基因导入五唇兰中 ,
获得瞬间表达 , 花瓣颜色发生变化。 柴明良等把蝴蝶兰
‘White Hika ru’ 类原球茎(pro toco rm - like body PLB)用针
刺后 ,与含绿色荧光蛋白基因(g fp)和潮霉素磷酸转移酶基
因(hpt)的根瘤农杆菌共培养 , 培育出了转基因的蝴蝶兰。
经绿色荧光蛋白检测和 Southern 印迹 , 证实了再生植株中
含有 gf p基因和 hpt[ 15] 。 从而初步建立了蝴蝶兰农杆菌转
基因体系。
　　Yang 等将带有 NPTⅡ和 GUS 标记基因的 pKH 200 质
粒 ,通过基因枪对大花蕙兰原球茎进行基因转化的研究 , 培
育出抗卡那霉素的原球茎和转基因植株。 经过 PCR 分析 ,
证明 NPT Ⅱ基因存在于转基因植株中[ 16] 。我国学者将
LFY 基因(拟南芥中分离出的具有促进植物提早开花的基
因)与单子叶植物的 UBI 启动子构建了一个适合在单子叶
植物中高效表达的含有 LFYcDNA 的表达载体(pBIL - 1),
应用基因枪转化法 ,将其导入文心兰的原球茎中 , 获得了一
些卡那霉素抗性克隆[17] 。
5 展望
　　有关国际条约禁止野生兰花国际贸易 , 国内也增强了对
野生资源保护意识。因此 , 加强兰花育种 ,拥有自主的知识
产权 ,才能立足于竞争日益激烈的兰花业 ,走向世界。
　　今后我国的育种方式 ,除了传统的杂交育种外 , 可与种
子离体萌发技术 、组织培养相结合 , 利用分子生物技术建立
兰花的分子标记图谱 ,对我国兰花资源进行分类和鉴别新品
种亲缘关系 ,为兰花育种提供早期的辅助选择指标。兰花特
异基因的分离克隆和转基因技术研究 ,可望将外来基因导入
兰花植株内 ,以改良株形 、花型 、花色 、花香和提高抗逆性 , 以
缩短兰花育种周期和增强育种的预见性 ,提高育种效率 , 从
而为兰花育种提供新途径。
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