全 文 ：大花蕙兰和墨兰花粉活力测定及贮藏研究
凌春英 1 , 肖 恩 1 , 严冬瑾1 , 霍丽丽 1 , 张启翔 1, 2＊　
(1.北京林业大学园林学院,北京 100083;2.国家花卉工程技术研究中心 ,北京 100083)
摘要　[目的 ] 快速测定大花蕙兰和墨兰花粉活力 ,保证人工杂交育种有效开展。[方法] 以大花蕙兰和墨兰花粉为材料 ,用离体培养法
和TTC染色法分别测定花粉活力 ,同时进行不同温度贮藏试验。 [结果] TTC染色法所测得的花粉活力均略高于离体培养法 , TTC对花
粉染色 12h即可达到较好的观察效果;-20和-80℃冷藏花粉 1年后仍保持较高活力。 [结论] TTC法操作简便 ,需时短 ,可作为大花
蕙兰和墨兰花粉活力测定便捷、有效的方法。 -20℃低温、干燥条件可作为大花蕙兰和墨兰花粉保存的简易方法。
关键词　花粉;离体培养法;TTC染色法;贮藏
中图分类号　S681.31　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)05-02312-03
StudyofPolenViabilityTestingonCymbidiumhybridumandCymbidiumsinenseandTheirPolenPreservation
LINGChun-yingetal　(DepartmentofLandscapeArchitecture, BeijingForestryUniversity, Beijing100083)
Abstract　[ Objective] Theresearchaimedtotestthepolenviabilitytoimprovetheprobabilityofcrossing.[ Method] ThepolenofCymbidium
hybridumandCymbidiumsinensecultivarswereusedasmaterials, andtwomethodswerecomparedinpolenviabilitytestingbetweeninvitroger-
minationandTTCdyeing.Thepolenwasstoredatdifferentconditions.[ Result] PolenviabilitybyTTCwashigherthanthatbyinvitrogermina-
tion, buttherewasnosignificancebetweenthem.Thepollencouldbeathighviabilityafterstoringattheenvironmentof-20℃or-80℃for
morethanoneyear.[ Conclusion] TTCdyeingcouldbeusedasanefectivemethodtotesttheorchidpolenviabilitybecauseofsavingtimeand
convenience.Storingat– 20℃whiledrycouldbechosenasafeasibleapproachfororchidpolenwhenpreparationforcrossbreeding.
Keywords　Polen;Germinationinvitro;TTCdyeing;Preservation
基金项目　国家林业局引进国际先进林业科学技术重大项目(2006-4-
C08);“十一五 ”国家科技支撑计划课题(2006BAD01A18)。
作者简介　凌春英(1984-),女 ,河北廊坊人 , 硕士研究生 ,研究方向:
园林植物资源与育种。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2009-11-03
　　大花蕙兰 (Cymbidiumhybridium)是以兰属(Cymbidium)
的一些大花型附生种为亲本经过多代杂交人工选择培育出
来的花朵大 、色彩鲜艳 、生长强健的优良品种群 [ 1] ,但大多数
花无香气 ,花期 2 ～ 4月。墨兰(C.sinense)叶片宽厚挺直 ,花
有香味 ,春节前开花。近年 ,美国 、日本 、新西兰等国兰花育
种者将大花蕙兰与建兰(C.ensifolium)、纹瓣兰(C.aloifoli-
um)等杂交 ,培育出一些早花(秋冬开花)、微香 、短叶型或垂
花型大花蕙兰品种 ,很受消费者的欢迎 [ 2] 。将墨兰或春兰等
与大花蕙兰杂交 ,也选育出一些杂交后代 [ 3-4] 。
在杂交育种工作中 ,花粉具有较高活力是保证有效杂交
的关键。关于兰科植物花粉活力的测定方法研究始于 20世
纪初 。早期的研究集中在萌发培养基成分的筛选方面 ,尤其
是蔗糖浓度的选择 [ 5] 。后来的研究除了对培养基化学成分
进行筛选外还涉及植物激素以及柱头粗提物或提取液等外
源添加物 [ 6] ,但蔗糖浓度仍是促进兰花花粉在人工培养基上
萌发的重要而且独立的因素。国内关于兰科植物花粉萌发
的研究较少。仅王利民等报道了大花蕙兰杂交品种花粉的
离体萌发特性 [ 7] 。对野生兰科植物花粉萌发的研究仅见对
海南原生的墨兰花粉进行离体培养萌发研究 [ 8] 。 TTC染色
法是测定花粉和种子活性的常规方法。该方法对许多植物
类群的花粉活力测定都很精确 [ 9] 。但是 ,对于采用 TTC法快
速测定兰科植物花粉活力 ,很少见有成功的报道。李枝林等
在采用 TTC法对新鲜花粉生活力进行测定时发现兰花花粉
不能被 TTC染色 [ 10] 。
花粉贮藏也是兰花杂交育种中必不可少的环节。在花
粉的贮藏过程中 ,应尽量保持较低的相对湿度 ,使其代谢受
到抑制 ,酶的活性减弱 ,呼吸作用降低 ,从而使花粉维持较长
时间的生活力。研究表明 ,花粉贮藏时期相对湿度与花粉寿
命呈负相关关系。低温能延长花粉的贮藏期限。对于大多
数物种的花粉 ,若先经干燥再降低温度 ,则更有利于生活力
的保持 [ 11] 。笔者采用 2种方法对大花蕙兰和墨兰花粉活力
进行测定 ,剔除花粉活力差和没有活力的花粉 ,以保证有效
杂交工作的开展。同时 ,探索了兰花花粉的有效保存方法 ,
以期能够有效 、快速地培育出具有墨兰易栽培特性和大花蕙
兰花大色艳特征的兰花新种质。
1　材料与方法
1.1　材料　以 5个大花蕙兰品种(代号分别为 `PN432 、
`JX606 、`QG356 、 `MF452和 `101-1 )和 5个墨兰品种
[ `企剑白墨 (简称 `白墨 )、`企剑黑墨 (简称`企黑 )、
小`香 、 桃`姬 和 金`华山 ]为试验材料 ,均种植 、保存于国
家花卉工程中心北林科技温室。常规养护管理 ,花期控制温
度 12 ～28℃、湿度 60%～ 80%。在盛花期 ,取花枝中下部当
天开放花朵 ,带回实验室 ,用镊子取出花粉块 ,去除药帽
备用。
1.2　生活力的测定
1.2.1　离体培养法。采用双凹载玻片悬滴法 [ 12]进行花粉培
养 ,培养温度为 25 ℃。墨兰花粉的离体培养液参考郭丽霞
等培养基配方 [ 8]并且加以改良 ,即浓度 10%蔗糖 +20 mg/L
硼酸 +10mg/LCaCl2(A);大花蕙兰花粉的离体培养液参考
王利民等培养液配方 [ 7]并且加以改良 ,即浓度 20%蔗糖 +20
mg/L硼酸 +10mg/LCaCl2 +50 mg/LGA3(B)。墨兰花粉培
养 2d和大花蕙兰花粉培养 4d后 ,在 LeicaBME光学显微镜
(10×20)下观察 6 ～ 8个视野 ,以花粉管突出萌发孔的长度
相当于花粉本身的直径时作为萌发的标志 ,统计萌发率 ,取
平均值 。
1.2.2　TTC染色法。参照胡适宜的方法 [ 13] 。取少许新鲜花
粉 ,将花粉捣碎于 1 ml离心管中 ,加入适量新鲜配制的浓度
责任编辑　刘月娟　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(5):2312-2314
0.5%TTC染色液染色 ,常温 、黑暗处理 , 12 h后用吸管取少
许花粉混合液于载玻片上 ,盖好盖玻片后在 LeicaBME光学
显微镜下统计花粉生活力 。每个品种制片 3张 ,每张片子随
机计数 5个视野中染色率 。有活力的花粉被染成红色 ,没有
活力的花粉没被染色。
　　花粉生活力 =(有活力的花粉 /观察花粉总数)×100%
1.3　花粉贮藏　取新鲜花粉块 ,除去药帽 、杂质 ,用滤纸包
好 ,加少许硅胶颗粒 ,置于密封容器内 ,移至干燥器内 ,放入
冰箱中。分别于 4、 -20、 -80℃低温 、黑暗保存 1、3、6、12个
月后 ,取出花粉 ,采用 TTC染色法测定花粉生活力。
2　结果与分析
2.1　花粉活力的测定　兰花花粉多为四分体结构 ,由 4个
花粉粒组成 1个花粉团。离体培养试验表明 ,不同品种大花
蕙兰花粉离体萌发所需时间不同 ,最短为 60 h,最长为 96 h;
不同品种墨兰花粉离体萌发所需时间也不同 ,最短为 24 h,
最长的在 48h以上(图 1、2)。TTC染色法的最佳观察时间
是染色后 12h(图 3、4)。
图 1　大花蕙兰`101-1花粉离体培养 72h后染色情况
Fig.1　DyeingsituationofCymbidium` 101-1 after72hinvitro
　　由表 1、2可知 , TTC染色法所测定的结果均略高于离体
培养法所测定的活力 ,各个品种所测得的花粉活力表现基本
一致。花粉离体培养法操作繁琐复杂 ,所耗时间长 ,而 TTC
染色法操作简便 ,耗时短 。所以 , TTC染色法可作为兰花花
粉活力测定快速 、有效的方法。
图 2　墨兰 小`香 花粉离体培养 72h后染色情况
Fig.2　DyeingsituationofCymbidiumsinense`Xiaoxiang after
72hinvitro
图 3　大花蕙兰` 101-1花粉TTC处理 12h后染色情况
Fig.3　DyeingsituationofCymbidium `101-1 afterTTCdye-
ing12h
图 4　墨兰 小`香 花粉 TTC处理 12h后染色情况
Fig.4　DyeingsituationofCymbidiumsinense`Xiaoxiang after
TTCdyeing12h
表 1　墨兰品种花粉离体培养法、TTC染色法活力测定结果
Table1　ThedeterminationresultsofCymbidiumsinensecultivarspolenviabilityinvitroculturemethodandTTCdyingassay %
方法 Method 白墨 Baimo 企黑 Qihei 小香 Xiaoxiang 桃姬 Taoji 金华山 Jinhuashan
离体培养法 Vitroculturemethod 85.03±1.56 88.74±1.26 42.85±1.54 23.46±2.19 67.92±1.28
TTC染色法 TTCdyeingassay 88.78±1.68 92.16±1.64 55.41±1.07 40.23±1.19 87.29±1.83
表 2　大花蕙兰品种花粉离体培养法、TTC染色法活力测定结果
Table2　ThedeterminationresultsofhybridCymbidiumcultivarspolenviabilityinvitroculturemethodandTTCdyingassay %
方法 Method PN432 JX606 QG356 MF452 101-1
离体培养法 Vitroculturemethod 20.17±1.39 35.02±1.10 35.26±3.61 36.87±2.52 63.24±2.06
TTC染色法 TTCdyeingassay 25.61±1.93 43.03±1.73 41.84±2.17 48.05±3.09 72.36±2.86
2.2　不同温度条件下贮藏花粉活力的变化　经过 4、 -20、
-80℃低温 、黑暗保存 , 1、3、6、12个月后取出 ,用 TTC法色
测定花粉活力。由图 5、6可知 ,以墨兰`金华山 和大花蕙兰
`QG356花粉保存为例 ,在 4 ℃冷藏条件下 ,花粉活力下降
231338卷 5期　　　　　　　　　　　　　　　　凌春英等　大花蕙兰和墨兰花粉活力测定及贮藏研究
很快 ,短期如 1周之内冷藏保存花粉活力下降不明显 ,但长
期保存则需要低温冷冻。 -20和 -80 ℃的低温保存都能够
使花粉在较长时间内保持较高活力 ,最初花粉活力略有下
降 , 1个月之后则基本趋于稳定。
图 5　墨兰 金`华山花粉在不同温度下贮藏活力的变化
Fig.5　ThechangeofCymbidiumsinense`Jinhuashan polen
viabilityatdiferenttemperatures
图 6　大花蕙兰`QG356花粉在不同温度下贮藏活力的变化
Fig.6　ThechangeofCymbidiumhybridiun` QG356 polenvia-
bilityatdiferenttemperatures
3　讨论
采用花粉离体萌发法测定花粉生活力时易受花粉萌发
条件的影响 ,如培养时间 、温度 、营养物质和矿质元素等 [ 14] 。
各个种和品种之间差异也很大。因此 ,花粉离体萌发率一般
达不到花粉真实的活力 [ 15] 。TTC染色法是根据花粉粒的呼
吸酶活性来判断花粉生活力的。花粉中呼吸酶的活跃情况能
较准确地反映其生活力的强弱 ,同时氧化还原染料能在呼吸酶
的作用下着色。该方法所得值是花粉活力的最直观 、最大值。
该方法适用于很多植物花粉生活力的检测 ,如银杉(Cathaya
argyrophyla)、锦带花(Weigelaflorida)、芍药(Paeonialactiflora)
等植物 ,花粉染色时所需时间为 15～ 60min[16-18] 。但是 ,该研
究表明兰科植物花粉需要至少 12h才能着色。这也是以前很
多试验中兰科植物没有成功染色的主要原因。兰花花粉属
于二核型花粉 ,具有厚实的外壁 ,能忍耐干燥 ,寿命长 ,较容
易保存 。有研究表明 ,兰科植物花粉外面大多包裹类脂膜 ,
类脂膜使得兰花花粉粒粘连成花粉块 ,减缓花粉的萌发速
度 ,也使得被包裹的花粉粒不易受环境中水气的影响 ,对花
粉活力的保持起到了相当重要的作用 [ 19] 。这可能是 TTC染
色时花粉不易着色的主要原因 ,也可能是花粉能够较长时间
保存活力的主要原因。花粉活力经初步检测之后 ,可将活性
较高的花粉作为父本进行人工授粉 ,但杂交果实能否正常生
长发育得到杂交后代 ,需要进一步研究。
参考文献
[ 1] 卢思聪 ,石雷.大花蕙兰 [ M].北京:中国农业出版社, 2005:21.
[ 2] 朱根发 ,王碧青 ,陈明莉,等.大花蕙兰与兰属植物种间杂交研究 [ J].
植物学通报 , 2005, 22(4):445-448.
[ 3] 朱根发.红花系大花蕙兰的杂交亲本及育种进展[ J].中国花卉园艺,
2003(8):20-22.
[ 4] 麦奋.垂花蕙兰及我国兰花的育种 [ J].中国花卉盆景 , 1998(4):16-
17.
[ 5] PRITCHARDHW,PRENDERGASTFG.Factorsinfluencingthegermina-
tionandstoragecharacteristicsoforchidpolen[M] //PRITCHARDWED
H.Modernmethodsinorchidconservation:Theroleofphysiology,ecology
andmanagement.Cambridge:CambridgeUniversityPress, 1989:1.
[ 6] WILLIAMWSANFORD, BONANOSS, XANIHAKESAA.Apreliminary
studyoforchidpolengerminationandthechromatographicisolationofa
stimulantfromcolumns[J].EnglandPhytochemistry, 1964, 13:671-676.
[ 7] 王利民 ,王四清 ,王彩霞,等.大花蕙兰花粉离体萌发试验初报[ J].中
国农学通报 , 2005, 21(4):122-124.[ 8] 郭丽霞 ,莫饶.海南原生墨兰花粉萌发试验初报 [ J].中国农学通报,
2007, 23(6):594-597.
[ 9] LANSACAR,SULLIVANCY, JOHNSONBE,etal.Viabilityandgermi-
nationofthepolenofsorghum[Sorghumbicolor(L.)Moench] [J] .An-
nalsofBotany, 1994, 74:27-33.
[ 10] 李枝林,王玉英,王卜琼,等.兰花远缘杂交育种技术研究[ J].中国野
生植物资源, 2007, 26(4):53-56.
[ 11] 王钦丽,卢龙斗,吴小琴,等.花粉保存及其生活力测定 [ J] .植物学通
报, 2002, 19(3):365-373.[ 12] 王友保,张莉.花粉萌发于花粉管生长实验 [ J] .生物学通报 , 2006, 41
(12):57.
[ 13] 胡适宜.植物学实验方法(一)花粉生活力的测定 [ J] .植物学通报,
1993, 10(2):60-62, 365-373.
[ 14] 闫立英,冯志红,张慎好 ,等.番茄花粉生活力研究 [ J] .种子 , 2005, 24
(6):24-26.
[ 15] 孙坤 ,张玉娜 ,苏雪,等.中国沙棘花粉生活力检测方法比较研究[ J].
西北师范大学学报:自然科学版 , 2009, 45(2):78-80.
[ 16] 王红卫,邓辉胜,谭海明,等.银杉花粉生命力及其变异 [ J] .植物生态
学报 , 2007, 31(6):1199-1204.[ 17] 刘林德,张萍 ,张丽,等.锦带花的花粉活力、柱头可授性及传粉者的观
察[ J] .西北植物学报 , 2004, 24(8):1431-1434.
[ 18] 红雨 ,刘强,韩岚.芍药花粉活力和柱头可授性的研究[ J].广西植物,
2003, 23(1):90-92.
[ 19] 吴应祥.中国兰花 [ M].2版.北京:中国林业出版社 , 1993:106-107.
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1 000 kg/hm2左右 ,或尿素 525 kg/hm2 左右 ,底肥氮肥应占
总施肥量的 70%;增施磷 、钾肥 ,底肥施过磷酸钙 600 kg/hm2
左右 ,氯化钾 112.5kg/hm2左右;及时施苗肥 ,可根据苗势施
尿素 150kg/hm2左右;早施腊肥 ,在 12月底根据苗势施尿素
75kg/hm2;及时施春肥 ,巧施花肥;注意施硼肥 ,若底肥未施
硼肥 ,应在薹期喷施硼肥;肥料的 70%在年前施用。
4.4　防治病害　生长期注意虫害 ,及时防治蚜虫 ,减轻病毒
病的发生。可选用 10%吡虫啉可湿粉 150 ～ 300 g/hm2、40%
毒死蜱 750 ～ 1 050 g/hm2、5%锐劲特 300 ～ 450 ml/hm2 或
4% ～ 5% 375 ml/hm2高效氯氰菊酯对水 750 L/hm2均匀喷
雾。所用农药应采取有机磷和菊酯类农药交替使用 ,以减少
蚜虫的抗药性;花期防治菌核病 , 药剂可选用速克灵 、多菌
灵 、克菌清等对口农药 ,在始花时喷治 ,隔 7 d再防治 1次 。
参考文献
[ 1] 沈惠聪.甘蓝型早熟油菜新品种 601[ J] .浙江农业科学 , 1991(2):76-
80.
2314 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年