全 文 ：书第 43 卷 第 10 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 43 No． 10
2015 年 10 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Oct． 2015
1)北京市教育委员会共建项目计划(科学研究与研究生培养共
建项目)。
第一作者简介:腰政懋，男，1986 年 3 月生，省部共建森林培育
与保护教育部重点实验室(北京林业大学) ，博士研究生。E － mail:
yzm19860315@ 163． com。
通信作者:徐程扬，省部共建森林培育与保护教育部重点实验室
(北京林业大学) ，教授。E － mail:cyxu@ bjfu． edu． cn。
收稿日期:2015 年 5 月 12 日。
责任编辑:潘 华。
不同种源辽东冷杉 rDNA ITS序列及其亲缘关系1)
腰政懋 徐程扬 李乐
(省部共建森林培育与保护教育部重点实验室(北京林业大学) ，北京，100083)
摘 要 对 6 个种源辽东冷杉的 rDNA ITS序列进行了扩增、纯化和测序，比较分析了各种源 rDNA ITS 序列
的长度、碱基变异位点、(G + C)含量和遗传距离，构建了系统发生树。结果表明:辽东冷杉 6 个种源的 rDNA ITS
序列总长度均为 1 355 bp，其中 ITS1、ITS2 和 5． 8S rDNA序列长度分别为 1 162、71 和 162 bp，种源间无长度差异;
rDNA ITS序列中只有 8 个碱基变异位点，均位于 ITS1 序列上，碱基变异类型为碱基转换或颠换;ITS1 和 ITS2 序列
中的(G + C)含量分别为 60． 24% ～ 60． 59%和 58． 60%，种源间(G + C)含量差异极小;种源间遗传距离平均值仅为
0． 002 3，其中清原种源和宽甸种源的遗传距离最小(0) ，其他种源间的遗传距离在 0． 000 7 ～ 0． 003 7。上述结果均
表明辽东冷杉种源间亲缘关系较近，遗传变异程度较低。系统发生树将地理距离相近的种源聚在一起，表明辽东
冷杉 6 个种源遗传距离与地理距离有明显的相关性。
关键词 辽东冷杉;种源;rDNA ITS序列;亲缘关系
分类号 S718． 43
rDNA ITS Sequences and Phylogenetic Relationships of Abies holophylla from Different Provenances / /Yao Zheng-
mao，Xu Chengyang，Li Le(Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Beijing Forestry Uni-
versity，Beijing 100083，P． R． China)/ / Journal of Northeast Forestry University，2015，43(10) :6 － 9，13．
We amplified，purified and sequenced the rDNA ITS sequence of Abies holophylla from six provenances． We compar-
atively analyzed the sequence lengths，base variation，(G + C)content and genetic distance of A． holophylla from different
provenances，and constructed the phylogenetic dendrogram． All of length of rDNA ITS sequence of A． holophylla from six
provenances were 1 355 bp，the lengths of ITS1，ITS2 and 5． 8S rDNA sequence were 1 162，72 and 162 bp，respectively，
and there was no difference in sequence length among provenances． Eight base variation loci were found in ITS1 sequence，
and the base transition and base transversion were the dominant base variation types． The (G + C)content of ITS1 and
ITS2 was 60． 24% － 60． 59% and 58． 60% respectively，and the difference of (G + C)content was very small． The aver-
age value of genetic distance among provenances was 0． 002 3，the genetic distance between Qingyuan and Kuandian prove-
nance was the smallest，and the genetic distance among provenances was in 0． 000 7 － 0． 003 7． The genetic relationship a-
mong provenances was close，and the genetic differentiation was low． Adjacent provenances on geographical distance were
clustered together by phylogenetic dendrogram，indicating that the genetic distance and geographical distance of A． holo-
phylla from six provenances showed obvious interrelated correlation．
Keywords Abies holophylla;Provenance;rDNA ITS sequence;Phylogenetic relationship
核糖体 DNA(ribosomal DNA，rDNA)内转录间隔
区(Internal Transcribed Spacer，ITS)中的 ITS1(介于
18S和 5． 8S之间)和 ITS2(介于 5． 8S和 26S之间)序
列作为非编码区(Non － Coding Region) ，承受的选择
压力较小，进化速率较快［1］，且与植物生活型呈相关
性［2］，可以提供丰富的遗传分析所需要的序列及位点
信息。rDNA ITS序列分析已被广泛应用于植物种间
或种内遗传多样性和系统发育关系的研究［3 － 6］，但对
冷杉属(Abies)植物进行 rDNA ITS 序列分析的报道
仍然较少，仅有向巧萍等［7］曾对 rDNA ITS序列在 28
种冷杉属植物中的长度多态性进行了研究。
辽东冷杉(Abies holophylla)为松科冷杉属常绿
乔木，别名沙松，原产于我国东北牡丹江流域山区、
长白山区及辽宁东部山区的气候寒冷湿润地带，生
长较快、材质优良、抗病虫害能力强，是温带针阔混
交林中的主要用材树种之一。目前，天然林中辽东
冷杉资源急剧减少，林相残缺破碎［8］，生境片断化
严重，亟需得到保护。目前有关辽东冷杉遗传多样
性的研究集中在形态学水平［9 － 10］，DNA分子水平的
遗传多样性研究未见报道。
本研究采用 PCR扩增产物直接测序的方法，对
6 个种源辽东冷杉的 rDNA ITS 序列进行测定与分
析，首次从 DNA分子水平上比较辽东冷杉种源间的
差异并分析其亲缘关系，旨在探讨辽东冷杉种内变
异程度及遗传多样性，为辽东冷杉种质资源的保护
和栽培利用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料的采集和保存
试验材料来自我国东北地区的黑龙江省宁安
市，吉林省敦化市、和龙市、抚松县，辽宁省清原满族
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2015.10.001
自治县和宽甸满族自治县，基本覆盖了辽东冷杉的
整个天然分布区，共计 6 个种源 90 个样本。各种源
地的具体情况详见表 1。采样过程中按照均匀分
布、随机取样的原则进行采样，保证采样母树的间距
在 50 m以上。采样时所选叶片均为新鲜幼嫩叶片，
采后用变色硅胶干燥法保存。带回到实验室后置于
超低温冰箱 － 80 ℃冷冻保存备用。
表 1 东北地区辽东冷杉 6 个种源地的基本情况
种源 北纬 东经 海拔 /m 坡向
宁安 43°3835″ 128°5246″ 563 东北
敦化 42°5317″ 127°5118″ 641 东北
和龙 42°1717″ 128°3133″ 858 西北
抚松 42°3617″ 127°4118″ 877 西北
清原 41°5910″ 125°1027″ 530 东北
宽甸 40°5321″ 124°5346″ 665 西北
1． 2 基因组 DNA的提取
采用 Ezup 柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒
(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取各干燥
叶片样品的总 DNA，按试剂盒操作指南进行。提取
后用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检
测其浓度与纯度，统一稀释到 50 mg·L －1，置于冰
箱 － 20 ℃保存备用。
1． 3 PCR扩增
使用真核生物 rDNA ITS序列的通用引物，上游引
物 ITS － 1 的序列为:5’－ TCCGTAGGTGAACCTGCGG
－3’，位于18S上;下游引物 ITS －4的序列为:5’－TC-
CTCCGCTTATTGATATGC －3’，位于 26S上。引物均由
生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR扩增反应在 ABI 2720 Thermal Cycler(Ap-
plied Biosystems Inc．，USA)中进行。以 5 个种源辽
东冷杉的 rDNA为模板进行 ITS1 － 5． 8S － ITS2 整段
扩增，PCR反应体系总体积为25 μL，其中包括50 mg·
L －1模板 DNA 0． 5 μL，10 μmol·L －1引物各 0． 5 μL，
2． 5 mmol·L －1 dNTPs 1 μL，5 × PCR缓冲液 2． 5 μL，
2 U·μL －1 Taq DNA 聚合酶 0． 2 μL，加入 dH2O 补
足。上述试剂均购自生工生物工程(上海)股份有
限公司。PCR扩增程序为 94 ℃预变性 4 min;94 ℃
变性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循
环;72 ℃再延伸 10 min。扩增产物于 4 ℃下保存。
反应结束后，以 DNA Ladder Mix maker(生工生
物工程(上海)股份有限公司)作为分子量标记，用
1%的琼脂糖凝胶电泳(电压 150 V，电流 100 mA，时
间 20 min)检测 PCR 扩增产物，电泳结果在 FR980
型凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司)中观
察和拍照。
1． 4 PCR扩增产物的纯化和测序
使用 SanPrep柱式 DNA胶回收试剂盒(生工生
物工程(上海)股份有限公司)对扩增的 rDNA ITS
片段进行纯化，按试剂盒操作指南进行。将纯化后
的 PCR产物作为测序反应的模板，用 PCR 反应的
引物作为测序引物直接测序。序列测定在 ABI
3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc．，USA)
中完成。
1． 5 序列分析方法
所得序列使用 NCBI(National Center for Bio-
technology Information，USA)的在线 BLAST 程序进
行同源检索;使用 Clustal X(Version 2． 0)［11］软件进
行对位排列和多重比对，并辅以人工校对;使用分子
进化遗传分析软件 MEGA(Version 6． 0)［12］软件分
析碱基组成、(G + C)含量、DNA序列差异百分率和碱
基置换数，并用 Kimura 2 －Parameter模型(K2P Model)
构建序列遗传距离矩阵，NJ 法(Neighbor － Joining
Method)构建系统发生树。系统发生树各分支的置信
度用自觉检验法(Bootstrap Test)检验，共进行 1 000
次循环，以评价各分支的系统学意义及可靠性。
2 结果与分析
2． 1 辽东冷杉 rDNA ITS 序列 PCR 扩增产物的电
泳分析
以 6 个种源辽东冷杉基因组 DNA 为模板进行
rDNA ITS 序列的 PCR 扩增反应，PCR 扩增产物的
电泳结果显示，6 个种源辽东冷杉的 rDNA ITS 序列
的 PCR扩增产物均在 1 200 ～ 1 500 bp 处有 1 条清
晰的特异性条带。
2． 2 辽东冷杉 rDNA ITS序列的长度
将辽东冷杉在 NCBI 中进行在线 Blast 比对，发
现 GenBank中尚没有辽东冷杉 rDNA ITS 序列的登
录，因此参考冷杉属其他树种如秦岭冷杉(Abies
chensiensis) (登录号 EF057702． 1)、资源冷杉(Abies
ziyuanensis) (登录号 EF057704． 1)和臭冷杉(Abies
nephrolepis) (登录号 EF057712． 1)的 rDNA ITS 序
列，分析确定了辽东冷杉 rDNA ITS 序列中 ITS1 和
ITS2 与 3 个编码区 18S、5． 8S、26S 的界限，并使用
NCBI在线工具 BankIt 向 GenBank 提交了辽东冷杉
的 rDNA ITS序列(登录号 KT164592)。
6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS 全序列长度均
为 1 355 bp，其中 ITS1 序列长度为 1 162 bp，5． 8S编
码区序列长度为 162 bp，ITS2 序列长度仅为 71 bp，
较短。各区在种源间均未发生长度变异。
2． 3 辽东冷杉 rDNA ITS序列的碱基变异
6 个种源辽东冷杉的 rDNA ITS 序列的碱基变
异较少，只有 8 个位点发生了变异，均位于 ITS1 序
列上。其中 6 个位点发生了 A—G 或 C—T 碱基转
7第 10 期 腰政懋，等:不同种源辽东冷杉 rDNA ITS序列及其亲缘关系
换，2 个位点 G—C 或 G—T 碱基颠换，无插入或缺
失变异(表 2)。5． 8S 编码区序列和 ITS2 序列均非
常保守，没有变异位点。清原和宽甸种源的 rDNA
ITS序列完全一致，宁安和敦化种源均各有 1 个位
点变异，和龙和抚松种源变异位点较多，均为 4 个。
表 2 6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS序列的碱基变异位点
种源
位点序号
143 146 168 766 767 851 1070 1162
宁安 T C C C G G T G
敦化 T T C C G G C G
和龙 T T G T G A T A
抚松 C T C T T G T A
清原 T T C C G G T G
宽甸 T T C C G G T G
2． 4 辽东冷杉 rDNA ITS序列的碱基含量
6 个种源辽东冷杉的 ITS1 序列中各碱基的含
量存在明显差异(表 3) ，其中鸟嘌呤 G含量最高，腺
嘌呤 A 含量最低，(G + C)含量在 60． 24% ～ 60．
59%，基本相等;ITS2 序列中各碱基的含量也存在
明显差异，从 16． 13% ～38． 71%不等，其中胞嘧啶 C
含量最高，胸腺嘧啶 T 含量最低，(G + C)含量均为
58． 06%。ITS1 和 ITS2 序列中(G + C)含量均明显
高于(A + T)含量。不同物种的(G + C)含量不同，
物种间的亲缘关系越近，(G + C)含量差异越
小［13 － 14］。种源间(G + C)含量差异极小，也说明辽
东冷杉种源间亲缘关系非常近。
表 3 6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS序列的碱基含量 %
种源
ITS1 的碱基量
T C A G (G + C)
ITS2 的碱基量
T C A G (G + C)
宁安 26． 51 28． 83 12． 99 31． 67 60． 50 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
敦化 26． 42 28． 92 12． 99 31． 67 60． 59 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
和龙 26． 51 28． 83 12． 99 31． 67 60． 50 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
抚松 26． 42 28． 92 12． 99 31． 67 60． 59 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
清原 26． 59 28． 66 13． 17 31． 58 60． 24 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
宽甸 26． 59 28． 83 13． 08 31． 50 60． 33 16． 13 38． 71 25． 81 19． 35 58． 06
2． 5 辽东冷杉 rDNA ITS序列间的遗传距离
根据 Kimura 2 － parameter 模型(K2P model)构
建的辽东冷杉 rDNA ITS 序列种源间遗传距离矩阵
(表 4)显示，清原种源与宽甸种源的遗传距离最小，
为 0，表明它们的序列同源性最高，亲缘关系极近;
清原和宽甸种源均与和龙和抚松种源间的遗传距离
最大，为 0． 003 7，亲缘关系最远;其它种源间遗传距
离也在0． 000 7 ～0． 003 0;遗传距离平均值为0． 002 3，
表明辽东冷杉种源间亲缘关系较近，遗传变异程度
较低。
表 4 6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS序列间的遗传距离
种源 宁安 敦化 和龙 抚松 清原
敦化 0． 001 5
和龙 0． 003 0 0． 003 0
抚松 0． 003 0 0． 003 0 0． 003 0
清原 0． 000 7 0． 00 07 0． 003 7 0． 003 7
宽甸 0． 000 7 0． 000 7 0． 003 7 0． 003 7 0
2． 6 辽东冷杉 rDNA ITS序列的系统发生树
基于 6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS 序列的系统
发生树(图 1)表明，地理距离相近的种源聚在一起。
位于黑龙江省东南部的宁安种源与相邻的位于吉林
省东北部的敦化种源即牡丹江流域的两个种源聚在
一起，位于长白山区的吉林省的和龙和抚松种源也
聚在一起，并与上述两个种源共同聚为一个大类;位
于辽宁省东部的清原和宽甸种源聚在一起，单独聚
为一个大类。这与遗传距离分析所得的结果一致，
表明辽东冷杉 rDNA ITS 序列的差异与其地理分布
相关性较高，地理距离相近则遗传距离也较近，表现
出一定的分子地域性差异。
图 1 基于 6 个种源辽东冷杉 rDNA ITS序列的系统发生树
3 结论与讨论
rDNA在不同物种间存在丰富变异，核苷酸序列变
化大，可以提供详尽的遗传学信息［15］，相对于线粒体
DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)和叶绿体 DNA(Chlo-
roplast DNA，cpDNA)，其受到细胞核保护机制的保护，
进化过程稳定，且其 ITS1、ITS2 序列的间隔区(18S、5．
8S和 26S rDNA)极为保守，能够用通用引物进行扩增
及直接测序［16 －17］。因此，非常适用于种以上水平的系
统发育和分类鉴定研究，在裸子植物中，已先后应用于
铁杉属(Tsuga)［18］、松属(Pinus)［19］、落叶松属(Lar-
ix)［20］、黄杉属(Pseudotsuga)［20］、冷杉属(Abies)［7］和云
杉属(Picea)［21］等。但在鉴别种内差异方面，其应用价
值则因种而异［22 －24］。
裸子植物的 rDNA ITS 序列长度(包括 ITS1、
ITS2 和 5． 8S rDNA)介于 975 ～ 3 125 bp 之间，平均
长度约为 1 500 bp［25］，明显大于被子植物的 565 ～
8 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43 卷
700 bp［26］。向巧萍等［7］对 28 种冷杉属植物 rDNA
ITS序列长度的研究发现分布于欧亚大陆和其它分
布于北美的冷杉属植物的 rDNA ITS全序列长度约
为 1 700 bp。本研究结果认为 6 个种源辽东冷杉
rDNA ITS序列总长度均为 1 355 bp，与裸子植物 rD-
NA ITS序列的平均长度相近，但稍短于 1 700 bp，这
可能与物种差异及测序引物不同有关。
本研究发现不同种源辽东冷杉 rDNA ITS 序列
碱基变异位点较少，仅有 8 个，均位于 ITS1 序列上，
而且变异类型也不丰富，仅有碱基置换(包括碱基
转换和颠换)这一种类型，没有碱基插入或缺失变
异，甚至清原种源和宽甸种源的 rDNA ITS序列完全
一致，且序列长度分析表明 ITS1 序列、ITS2 序列和
5． 8S rDNA序列在 6 个种源间均未发生长度变异，
说明辽东冷杉 rDNA ITS 序列整体具有较高的保守
性。这不利于使用 rDNA ITS 序列分析的方法对辽
东冷杉进行精准的种源鉴定，也提示 rDNA ITS序列
在种内差异鉴别方面的应用有一定的局限性［27］。
辽东冷杉 rDNA ITS序列种源间(G + C)含量差
异极小和遗传距离平均值仅为 0． 002 3，均表明辽东
冷杉种源间亲缘关系较近，遗传变异程度较低。由
于冷杉植物的生长对于温度有着较严格的要求，因
此第四纪温度的变化尤其是末次盛冰期对世界现代
冷杉属植物的分布格局的形成起着决定性的作
用［28］。在冰期，大多数高纬度地区物种必须退缩到
冰期避难所或者分布范围原地急速收缩，在冰期结
束后，这些物种在当地扩张范围或回迁到它们从前
的分布区域，伴随该过程的奠基者效应和瓶颈效应
不可避免地降低种群内和物种内的多样性［29］，辽东
冷杉作为分布在我国东北高纬度地区的树种，不可
避免地经历了这一分布“收缩—扩张”的过程，导致
其种源间遗传多样性较低。
植物种群遗传变异的分布情形与该种的地理分
布情形和生态特征密切相关［30］。在对植物使用 rD-
NA ITS序列分析进行的遗传多样性研究中，种源间
遗传距离与地理距离间是否存在显著的相关性并没
有统一的结论［31 － 32］。根据 NJ法构建的辽东冷杉系
统发生树基本上将分布区地理距离较近的种源聚在
一起，辽东冷杉 6 个种源呈现出明显的地域分布规
律。这表明辽东冷杉种源遗传距离与地理空间距离
有明显的相关性，即如果种源间的地理距离较近，其
遗传距离也相对较小。
参 考 文 献
［1］ 李喜凤，邱天宝，张红梅，等．不同种群蒲公英的内转录间隔区
(ITS)序列及其亲缘关系分析［J］． 中国药学杂志，2013，48
(9) :687 － 690．
［2］ 严寒静，房志坚，余世孝．不同种源何首乌的 ITS序列分析及其
亲缘关系研究［J］．西北植物学报，2008，28(5) :922 － 927．
［3］ Kress W J，Liu A Z，Newman M，et al． The molecular phylogeny
of Alpinia (Zingiberaceae) :a complex and polyphyletic genus of
gingers［J］． American Journal of Botany，2005，92(1) :167 －
178．
［4］ Yamaji H，Fukuda T，Yokoyama J，et al． Reticulate evolution
and phylogeography in Asarum sect． Asiasarum (Aristolochiaceae)
documented in internal transcribed spacer sequences (ITS)of nu-
clear ribosomal DNA［J］． Molecular Phylogenetics ＆ Evolution，
2007，44(2) :863 － 884．
［5］ 徐纲，于超，阳勇，等． 不同居群栽培牡丹 rDNA ITS 区序列分
析及鉴别［J］．天然产物研究与开发，2009，21(2) :225 － 230．
［6］ 王晓锋，刘娜娜，季孔庶．黄杨属植物 ITS序列分子进化特点分
析［J］．分子植物育种，2011，9(4) :506 － 513．
［7］ 向巧萍，向秋云，Liston A，等． ITS(nrDNA)片段在冷杉属植物
中的长度多态性及其在松科的系统与演化研究中的应用［J］．
植物学报:英文版，2000，42(9) :946 － 951．
［8］ 张有富，刘高义，陈文山，等．黑龙江省沙松资源评价［J］．防护
林科技，2002(1) :56 － 60．
［9］ 祝旭加，孙岳胤．沙松球果表型性状地理变异规律的研究［J］．
防护林科技，2013(9) :12 － 15．
［10］ 腰政懋，徐程扬，柴源，等． 辽宁省东部不同种源沙松冷杉种
子品质的差异［J］．东北林业大学学报，2014，42(8) :15 － 19．
［11］ Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al． Clustal W and
Clustal X version 2． 0［J］． Bioinformatics，2007，23(21) :2947
－ 2948．
［12］ Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al． MEGA6:molecular
evolutionary genetics analysis version 6． 0［J］． Molecular Biology
＆ Evolution，2013，30(12) :2725 － 2729．
［13］ Rodríguez Trelles F，Tarrío R，Ayala F J． Evidence for a high
ancestral GC content in Drosophila［J］． Molecular Biology ＆ E-
volution，2000，17(11) :1710 － 1717．
［14］ 陈妍，高燕会，廖望仪，等． 乳白石蒜 rDNA － ITS 序列分析及
种内系统发育研究［J］． 植物资源与环境学报，2009，18(3) :
25 － 31．
［15］ Schmidt G J，Schilling E E． Phylogeny and biogeography of Eu-
patorium (Asteraceae:Eupatorieae)based on nuclear ITS se-
quence data［J］． American Journal of Botany，2000，87(5) :716
－ 726．
［16］ Ainouche M L，Bayer R J． On the origins of the tetraploid Bro-
mus species (section Bromus，Poaceae) :insights from internal
transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA［J］． Ge-
nome，1997，40(5) :730 － 743．
［17］ Baraket G，Saddoud O，Chatti K，et al． Sequence analysis of the
internal transcribed spacers (ITSs)region of the nuclear riboso-
mal DNA (nrDNA)in fig cultivars (Ficus carica L．) ［J］． Sci-
entia Horticulturae，2009，120(1) :34 － 40．
［18］ Vining T F，Campbell C S． Phylogenetic signal in sequence re-
peats within nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1
in Tsuga［J］． American Journal of Botany，1997，84(S1) :702．
［19］ Liston A，Robinson W A，Piriero D，et al． Phylogenetics of Pi-
nus (Pinaceae)based on nuclear ribosomal DNA internal tran-
scribed spacer region sequences［J］． Molecular Phylogenetics ＆
Evolution，1999，11(1) :95 － 109．
［20］ Gernandt D S，Liston A． Internal transcribed spacer region evo-
lution in Larix and Pseudotsuga (Pinaceae) ［J］． American Jour-
nal of Botany，1999，86(5) :711 － 723．
［21］ Campbell C S，Wright W A，Cox M，et al． Nuclear ribosomal
DNA internal transcribed spacer 1 (ITS1)in Picea (Pinaceae) :
sequence divergence and structure［J］． Molecular Phylogenetics
＆ Evolution，2005，35(1) :165 － 185．
［22］ Francisco Ortega J，Santos Guerra A，Hines A，et al． Molecular
evidence for a mediterranean origin of the macaronesian endemic
genus Argyranthemum (Asteraceae) ［J］． American Journal of
Botany，1997，84(11) :1595 － 1613．
［23］ 孟娜，周守标，蒋继宏．五种大戟属植物 nrDNA的 ITS序列分
析及其叶的比较解剖学研究［J］．广西植物，2006，26(1) :18
－ 21．
［24］ 王洁，杨旭，杨志玲． 不同产区厚朴 nrDNAITS 序列分析及亲
缘关系鉴定［J］．广西植物，2013，33(1) :35 － 41．
［25］ Liston A，Robinson W A，Oliphant J M，et al． Length variation
in the nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region of
non-flowering seed plants［J］． Systematic Botany，1996，21(2) :
109 － 120．
［26］ Baldwin B G． Molecular phylogenetics of Calycadenia (Composi-
tae)based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA:chromo-
somal and morphological evolution reexamined［J］． American
Journal of Botany，1993，80(2) :222 － 238．(下转 13 页)
9第 10 期 腰政懋，等:不同种源辽东冷杉 rDNA ITS序列及其亲缘关系
养基为 1 /2MS + IBA0． 01 mg·L －1 + NAA0． 01 mg·
L －1 +蔗糖 30 g·L －1 +琼脂粉 5 g·L －1，生根最佳
温度为 25 ℃，生根率可达 93． 33%，生根小植株移
栽成活率达 98%。
培养基中激素的种类及配比是影响外植体分化
和不定芽诱导的关键因素，调节其水平及配比是建
立和优化再生体系的有效手段［10］。有研究认为，培
养基中激素的相对含量控制植物不定芽的分化及器
官形成，并非其绝对含量［11］。然而一些针对杨属植
物不定芽诱导的研究结果迥异，激素的绝对含量相
差无几，而相对含量相差甚大。王金贵［12］筛选出的
的俄罗斯抗寒杨(Populus alba)不定芽的诱导培养
基中 6 － BA 与 NAA 的绝对质量浓度为 0． 5 mg·
L －1和 0． 2 mg·L －1。崔莉洁［13］等人研究来源于阿
塞拜疆共和国巴库地区的欧洲黑杨(Populus nigra)
最适的不定芽诱导培养基中 6 － BA 与 IBA 的绝对
质量浓度为 1 mg·L －1和 0． 25 mg·L －1。崔旭东［9］
研究的欧美杨渤丰 1 号分化培养基中 6 － BA 与
NAA的绝对质量浓度为 0． 4 mg·L －1和 0． 04 mg·
L －1。本研究中欧洲黑烟 N46 最适的分化培养基中
6 － BA 与 NAA 的绝对质量浓度为 0． 5 mg·L －1和
0． 03 mg·L －1。激素 6 － BA的质量浓度在 0． 4 ～ 1．
0 mg·L －1，NAA 的质量浓度在 0． 03 ～ 0． 2 mg·
L －1，绝对质量浓度相差不大，而相对质量浓度相差
悬殊，从 2． 5 倍到 17 倍不等，均取得了良好的分化
效果。由此可见，培养基中激素的相对质量浓度和
绝对质量浓度均是不定芽诱导的影响因素，其种类
及配比因物种而异。
对于不定芽的生根培养基存在不同的观点，均
取得了良好的生根效果。洪震［14］等人在研究秀丽
野海棠叶片不定芽生根时，使用 MS 培养基取得了
良好的效果。崔旭东［10］发现渤丰 1 号杨在 1 /2MS
的培养基中生根效果最好。任如意［15］使用 1 /4MS
培养基培养药用植物北玄参，生根率达 100%，平均
生根数为 11． 33。不过，崔莉洁［13］等人比较欧洲黑
杨在 1 /2MS与 MS培养基上的生根效果，结果表明
1 /2MS培养基生根效率和效果明显优于 MS 培养
基。金华等［16］人利用 741 杨的培养结果支持上述
观点。
本研究采用无机离子减半的 1 /2MS 培养基
进行生根培养，不定芽 8 d 即可生根，生根率可达
93． 33%。由此可见，采用无机离子减半的 1 /2MS
培养基更有利于欧洲黑杨生根。再生体系是遗传
转化的基础，而遗传转化是培育转基因新品种的
有效途径。本研究建立了欧洲黑杨 N46 无性系的
组培再生体系，为黑杨快速无性繁殖及遗传转化
提供了借鉴。
参 考 文 献
［1］ Winton L． Tissuue culture propagation of european aspen［J］．
Forest Science，1971，17(3) :348 － 350．
［2］ Ahuja M R． Somatic cell differentiation and rapid clonal propaga-
tion of aspen［J］． Silvae Genetica，1983，32(3 /4) :131 － 135．
［3］ Vinocur B，Carmi T，Altman A，et al． Enhanced bud regeneration
in aspen (Populus tremula L．) roots cultured in liquid media
［J］． Plant Cell Reports，2000，19(12) :1146 － 1154．
［4］ Wang Huimei，Liu Hongmei，Wang Wenjie，et al． Effects of Thidia-
zuron，basal medium and light quality on adventitious shoot regen-
eration from in vitro cultured stem of Populus alba × P． berolinen-
sis［J］． Journal of Forestry Research，2008，19(3) :257 － 259．
［5］ Dmytro P Yevtushenko，Santosh Misra． Efficient Agrobacterium-me-
diated transformation of commercial hybrid poplar Populus nigra
L． × P． maximowiczii A． Henry［J］． Plant Cell Reports，2010，29
(3) :211 － 221．
［6］ 于志水，金红，茼胜军，等． 黑杨派杨树组培再生系统的研究
［J］．辽宁林业科技，2002(6) :11 － 13．
［7］ 康薇，郑进，刘凯于，等．美洲黑杨(中嘉 8 号)离体叶片再生研
究［J］．武汉植物学研究，2006，24(1) :83 － 86．
［8］ 周洲． L －蛋氨酸对甜樱桃砧木组培苗生根及叶绿素、碳水化
合物及脯氨酸含量的影响［J］． 中国果业信息，2013，30(9) :
33 － 36．
［9］ 崔旭东，苏晓华，张冰玉，等．欧美杨渤丰 1 号高效组培再生体
系建立［J］．林业科学研究，2012，25(2) :157 － 162．
［10］ 苏晓华，张冰玉，黄秦军，等． 我国林木基因工程研究进展及
关键领域［J］．林业科学，2003，39(5) :111 － 118．
［11］ 苏晓华，张冰玉，黄秦军，等． 杨树基因工程育种［M］． 北京:
科学出版社，2009．
［12］ 王金贵．俄罗斯抗寒杨树的组织培养技术探讨［J］．中国科技
纵横，2014，183(3) :248．
［13］ 崔莉洁，王宏芝，魏建华，等． 1 个欧洲黑杨无性系的组织培养
技术［J］．中国园艺文摘，2009，11:32 － 33．
［14］ 洪震，朱乐杰，傅晓强，等． 秀丽野海棠叶片不定芽高频再生
体系的建立［J］．植物生理学报，2015，51(2) :241 － 245．
［15］ 任如意，薛巨坤，李艳萍，等． 药用植物北玄参高频再生体系
建立［J］．植物生理学报，2014，50(12) :1816 － 1820．
［16］ 金华，尚敏克，姜国斌．导入抗逆基因的转双抗虫基因 741 杨
的获得［J］．东北林业大学学报，2012，40(1) :

28 － 31．
(上接 9 页)
［27］ 张君毅，郭巧生，吴丽伟，等．我国不同地区半夏 rDNA序列分
析［J］．中国中药杂志，2006，31(21) :1768 － 1772．
［28］ 向巧萍．中国的几种珍稀濒危冷杉属植物及其地理分布成因
的探讨［J］．广西植物，2001，21(2) :113 － 117．
［29］ Hewitt G． The genetic legacy of the quaternary ice ages［J］． Na-
ture，2000，405:907 － 913．
［30］ Loveless M D，Hamrick J L． Ecological determinants of genetic
structure in plant populations［J］． Annual Review of Ecology and
Systematics，1984，15(4) :65 － 95．
［31］ 沈洁，丁小余，张卫明，等．花椒及其混淆品的 rDNA ITS 区序
列分析与鉴别［J］．药学学报，2005，40(1) :80 － 86．
［32］ 陈建梅，王钊宇，张立娜，等．基于 ITS条形码技术分析北京云
蒙山杜鹃花属遗传多样性［J］．中国农学通报，2014，30(25) :
43 － 48．
31第 10 期 冯莉，等:欧洲黑杨‘N46’组培再生体系的建立