全 文 ：文章编号:0490-6756(2003)01-0148-05
变性剂和巯基修饰对黄精凝集素 II
构象和活性的影响
吴传芳 ,常丽青 ,赵　曦 ,荣艳珍 ,高　顺 ,段　真 ,安　洁 ,顾　莹 ,
王陈继 ,滕　蕾 ,龚　萌 ,吕　辉 , 陈　放 ,鲍锦库＊
(四川大学生命科学院 , 成都 610064)
摘要 :采用圆二色谱 、荧光光谱 ,研究了黄精凝集素 II(Polygonatum cyrtonema Hua.LectinII ,PCL
II)在 4mol/L 和6mol/L盐酸胍中 ,以及巯基修饰后 ,其活性和分子构象的变化关系.研究结果
表明:PCL II是一种稳定的蛋白质 ,巯基修饰剂虽不影响其活性 ,但可使其分子构象发生变化 ,
去除修饰剂后其结构部分能够恢复.在 4mol/L盐酸胍中 ,PCL II活性及构象可发生很大变化 ,
去除盐酸胍后其活性恢复;在 6mol/L盐酸胍中 ,呈现典型的无规卷曲构象 ,活性完全丧失 ,去
除盐酸胍后活性仍不能恢复 ,表明活性中心已遭到不可逆的破坏.
关键词 :黄精凝集素 II(PCL II);化学修饰;荧光光谱;圆二色性;生物学活性
中图分类号:Q 513+.2　　　　　文献标识码:A
凝集素是一类非免疫来源的糖结合蛋白或糖蛋白 ,随着凝集素对人血型抗原的专一性结合以及促淋巴
细胞有丝分裂作用和凝集恶性细胞能力的发现 ,特别是发现凝集素具有抵御许多疾病和抗植物病虫害的作
用 ,因此凝集素的研究受到广泛的关注[ 1] .近年来 ,对于其结构与功能的研究已经成为糖结合蛋白研究的热
点内容.黄精凝集素 II (PCL II)是从中药黄精中分离出来的一种分子量为 15.9kD的糖结合蛋白 ,它能促使
T-淋巴细胞分裂 ,并能凝集兔红细胞[ 2] .以下我们报道应用圆二色谱 、荧光光谱 ,结合生物学活性 ,研究 PCL
II在变性剂和巯基修饰中构象与活性的变化关系.
1　材料与方法
1.1　材料
PCL II按文献[ 2]的方法纯化 ,经 SDS-PAGE 和FPLC 检测为单一蛋白带;新鲜兔血由自己制备 ,并配制为
2%的血球悬液备用;Sephadex G-25为 Pharmacia产品;N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)为Merk公司产品;对氯
汞苯甲酸(PCMB)和二硫苏糖醇(DTT)为Serva 产品;碘乙酸 、盐酸胍(GnHCl)购自上海化学试剂厂;其它试剂
皆为国产分析纯.
1.2　方法
1.2.1　蛋白质浓度的测定　用 Folin-酚试剂测定[ 3] ,以牛血清白蛋白作标准.
1.2.2　PCL II凝血活性的测定　参照文献[ 4]的方法 ,在系列倍比稀释的“V”型孔中 ,加入 PCL II 和兔血红
细胞后振摇10min ,室温下放置 2h ,显微镜下检查凝血活性.
1.2.3　盐酸胍(GnHCl)对PCL II活性及荧光和圆二色性的影响　参照文献[ 5] ,分别用 4mol/L ,6mol/L盐酸
胍对 PCL II样品(1×10-3g/mL)进行充分透析 ,取部分样品经Sephadex G-25去除过量盐 酸 胍 ,所 有 样 品
收稿日期:2002-08-26
基金项目:国家自然科学基金(39770178)
作者简介:吴传芳(1977-),女 , 2000 级硕士研究生.
＊通讯联系人
2003年 02月
第 40卷第 1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Feb.2003
Vol.40　No.1
均用于活性及光谱测定(以下实验样品同).
1.2.4　PCL II与二硫苏糖醇(DTT)的反应　按 Spande等[ 6]的方法进行 ,所需浓度的 PCL II用 0.14mol/L , pH
6.8的磷酸缓冲液(PB)配制 ,加入 DTT 使其终浓度为 20mmol/L ,用 0.1mol/L NaOH 调 pH值至 8.0 ,室温下反
应3h ,由 Sephadex G-25去除过量的 DTT ,收集样品.
1.2.5　PCL II与对氯汞苯甲酸(PCMB)的反应　按 Riordan等[ 7]的方法进行 ,由 2mg PCMB用低浓度的 NaOH
溶液 5mL配制作为 PCMB母液 ,取 1mL 0.4mg/mL的 PCMB母液用 0.33 mol/L pH 4.6的磷酸缓冲液稀释至
10mL ,向 5mL PCL II样品中加入过量的 PCMB ,反应 1.5h后 ,经 Sephadex G-25去除过量试剂 ,收集样品.
1.2.6　PCL II与碘乙酸的反应　将PCL II溶于碘乙酸(0.1mol/L ,用 0.2mol/L pH 8.0的PB液配制),使PCL
II终浓度为 1×10-3g/mL ,40℃下反应 10min ,经 Sephadex G-25去除过量的碘乙酸 ,收集样品.
1.2.7　PCL II与N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)的反应　按Alexander等[ 8 ,9]的方法 ,在室温下加入过量 NEM
(10mmol/L ,用上述的磷酸缓冲液配制)与 PCL II在室温下反应 3h ,经 Sephadex G-25去除过量试剂 ,收集样
品.
1.2.8　光谱测定　在日立 F-4500荧光分光光度计上进行 PCL II 和去除盐酸胍 DTTDEMIPCMB和碘乙酸后
PCL II样品荧光光谱的测定.所用的激发和发射光谱带宽均为 5.0nm ,扫描速度为 180nm/min.测定溶液为生
理盐水溶液 ,样品浓度为 0.1×10-3g/mL ,以 281.6nm , 295nm 为激发波长 ,测得荧光发射谱 ,再以发射谱的
λmax(323nm)为发射波长 ,测得激发光谱.
1.2.9　圆二色谱(CD 谱)的测定 　用 JASCO-500型自动记录分光偏振仪在 25℃时测定 ,蛋白质浓度为
0.8×10-3g /mL ,生理盐水溶液配制 ,扫描范围分为 320nm ～ 250nm 和 250nm ～ 200nm 两段.平均残基分子量
取110 ,光程分别为 0.5cm和 0.02nm ,灵敏度为每厘米 2毫度;圆二色谱用平均椭圆度[θ]表示 ,单位为 deg.
cm2/dmol ,并按文[ 10]的方法计算各构象单元含量.
2　结果
2.1　凝集素凝血活性的测定结果　
由表 1可见 ,PCL II浓度为 0.4×10-6g/mL时仍有活性 ,当巯基被修饰后 ,PCL II活性变化不明显 ,说明
巯基不是 PCL II凝血活性的必需基团;盐酸胍对 PCLII的影响随着浓度的加大而逐渐加强 ,说明随着变性剂
浓度的加大活性中心被逐步破坏 ,最终导致活性丧失.
表 1　不同处理后黄精凝集素 II(PCLII)凝集活性的变化＊
PCLII 样品 凝集素浓度(×10
-6
g/mL)
400 200 100 50 25 12.5 6.3 3.2 1.6 0.8 0.4
PCLII + + + + + + + + + + +
DTT + + + + + + + + + + -
PCMB + + + + + + + + + + -
ICH2COOH + + + + + + + + + + -
NEM + + + + + + + + + + -
4mol/mL GnHCl + + + + + - - - - - -
4mol/mL GnHCl＊＊ + + + + + + + + + + -
6mol/mL GnHCl H H H H - - - - - - -
6mol/mL GnHCl - - - - - - - - - - -
　　　　　　　＊:“ +”表示凝血;“ -”表示不凝血;“H”表示溶血;＊＊表示经 Sephadex G-25去除过量试剂
2.2 　PCL II的荧光光谱
PCL II具有 λmax=323nm的内源荧光发射光谱和 λmax=281.6nm的荧光激发光谱(如图 1);当PCL II为
149第 1期 吴传芳等:变性剂和巯基修饰对黄精凝集素 II构象和活性的影响
0.1×10-3g/mL时 ,荧光相对强度分别为 33.6和 32.7 ,而于 295nm处激发的荧光发射峰位则远远小
图 1　黄精凝集素 II(PCL II)荧光光谱
a.323nm的发射光谱;　　　　b.281.6nm 的激发光谱;
1.天然 PCL II;　　2.天然PCL II 在 295nm 的激发光谱;
3.PCL II 经NEM 作用;　　　　4.PCL II经碘乙酸作用;
5.PCL II经4mol/L 盐酸胍作用;6.PCL II经6mol/L 盐酸胍作用;
7.PCL II经 DTT作用;　　　8.PCL II 经PCMB作用
于281.6nm ,由于 295nm 仅激发色氨酸的荧光 , 且
PCL II分子中约含有3个色氨酸(Trp)和 5个酪氨酸
(Tyr)残基[ 11] ,所以用 281.6nm 激发的发射光谱由
Trp和 Tyr共同贡献 ,但是在光谱中并无 Tyr 残基产
生的荧光峰 ,说明 PCL II 的内源荧光发生了从 Tyr
到Trp的能量转移.和游离色氨酸最大荧光发射峰
位 348nm 相比 , 295nm 处的荧光最大发射峰位为
323nm ,蓝移了近 25nm ,说明 Trp 周围的极性较弱 ,
并未完全暴露于周围溶剂中 ,而是被屏蔽在一定的
构象中 ,处于疏水的微环境或 Trp 的吲哚环有着特
殊的构象.
当巯基分别被 DTT 、碘乙酸 、NEM 和 PCMB 修
饰后 , PCL II的荧光发射峰强度降低 ,特别是由DTT
和PCMB修饰后其荧光强度几乎为零 ,而用碘乙酸
和NEM修饰后 ,激发峰红移至 335nm 和 325nm ,相
对强度分别为 11.2和15.2 ,表明 Trp周围介质极性增强 ,疏水性减少 ,巯基对 PCLII的空间构象具有独特的
作用 ,当它被修饰后 ,使蛋白质的空间构象发生改变 ,从而影响了 Trp所在微区的构象 ,导致 Trp残基进一步
远离疏水环境 ,极性增加或Trp残基所处的特殊构象被破坏 ,减少了残基的荧光发射量子产率.
由图 1可见 ,经 4mol/L , 6mol/L 变性剂盐酸胍作用后 , PCL II 激发峰红移至 349nm 处 ,相对强度分别为
12.4和 8.0.表明变性剂在改变整个蛋白质的构象的同时 ,也影响了 Trp所在的微区构象 ,导致Trp残基所处
微环境极性增加 ,量子产率减少 ,而且其影响随着变性剂浓度的增大而加深.
2.3　天然 PCL II和盐酸胍修饰后的PCL II的圆二色性
λ(nm)
图 2　黄精凝集素 II(PCL II)远 、近紫外圆二色谱
1.天然 PCLII;2.4mol/ L盐酸胍;3.去除 4mol/ L盐酸胍;
　　　　　　4.6mol/L 盐酸胍;5.去除 6mol/ L盐酸胍
　　天然态 PCL II 的远紫外 CD谱(图 2)
显示 , 224nm 处有单一大负峰及 208nm 和
236nm二肩.近紫区 CD谱(图 2)的 278nm
处有一大负峰和 256nm ,285nm ,300nm 3个
肩.构象组成为 XH =17.3%, Xβ =45.8%,
X R=36.9%,从计算结果知 ,PCL II是一种
高 β-折叠蛋白质 ,且是一种 CD 谱异常的
特异蛋白质.
蛋白质的近紫外 CD谱主要反映侧链
残基的构象.PCL II 分子中的 285nm ,
300nm处的肩可能是色氨酸的贡献[ 12] ;
256nm 处的肩可能是苯丙氨酸的贡献 ,
278nm处的负峰由酪氨酸提供[ 12] .
分别用 4mol/L ,6mol/L的盐酸胍处理PCL II后 ,在 4mol/L 盐酸胍中 ,PCL II的CD谱发生较大的改变(如
图2).在近紫外 ,于 260nm ～ 320nm 处的吸收峰 、肩均消失.而 256nm处肩的[ θ]值由-0.75×10-3deg.cm2/
dmol增至 0.45×10-3deg.cm2/dmol.远紫外的 242nm处产生一负峰 , 224nm处的峰消失 , 236nm处的肩消失.
208nm处的肩变为一小负峰 ,经 Sephadex G-25去除过量盐酸胍后 ,PCL II的 CD谱有较大恢复(如图 2).各峰
肩的位置没有改变 ,负峰下移.
在6mol/L盐酸胍中 ,远紫外的峰 、肩消失 ,近紫外 256nm 处的肩红移至 260nm 处 ,且上升为一小正峰 ,
278nm处的峰 ,285nm 和 300nm处的肩变得不明显 ,经 Sephadex G-25去除过量盐酸胍后 ,谱线恢复 ,但未能恢
150 四川大学学报(自然科学版) 第 40卷
复至天然态.
表 2　黄精凝集素 II(PCL II)二级结构单元含量
凝集素 α-螺旋(%) β-折叠(%) β-转角和无规卷曲(%)
天然 PCL II 17.3 45.8 36.9
4mol/ L盐酸胍 45.0 12.5 42.5
6mol/ L盐酸胍 4.2 10.6 86.2
从以上实验结果看 ,在 4mol/L和 6mol/L 的盐酸胍中 ,PCL II构象可发生很大变化 ,其二级结构已发生了
改变 ,从远紫外谱计算知 ,其二级结构的组成如下:在 4mol/L 盐酸胍中 , X H =45%, Xβ =12.5%, X R=42.
5%;在 6mol/L 盐酸胍中 , XH =4.2%, Xβ =10.6%, X R=86.2%.从计算结果知 ,在 4mol/L 盐酸胍中 , PCL II
的高 β-折叠构象大幅下降.在 6mol/L 盐酸胍中 ,PCL II以无规卷曲构象为主 ,其远紫外亦呈现典型的无规卷
曲CD谱[ 13] .
2.4　巯基修饰对 PCL II活性及圆二色性的影响
λ(nm)
图 3 　巯基修饰的 PCL II天然 PCL II CD谱
1.天然 PCL IICD谱;2.经 DTT 作用;3.经 PCMB作用;4.经碘乙酸作用;5.经 NEM作用
　 　对 PCL II 分 别 用
DTTPCMBNEM 和碘乙酸修
饰其巯基 ,尽管修饰巯基会
改变 PCL II 分子的部分构
象 ,但并未对其活性中心造
成破坏 ,活性中心仍保持完
整.PCMB 修饰可以使包埋
于分子内部的巯基得以全部
修饰 ,弥补 NEM只能修饰分
子表面的自由巯基的缺点 ,
由于 NEMPCMB的修饰均不
改变 PCL II 的凝血活性 ,故
巯基与PCL II的凝血活性无关 ,PCL II经 DTT 修饰后 ,二硫键还原成巯基 ,但其仍保留完整的凝血活性 ,说明
-S-S-并不是血凝活性所必需的.
巯基被修饰的 PCL II CD谱与天然 PCL II CD谱比较(图3),其在近紫外峰 、肩位置没有变化 ,278nm 处的
峰变小 ,而[ θ]的变化却不同.在远紫外 ,两者相比 , CD谱峰形状基本相同 ,仅峰 、肩的[ θ] 略有变化 ,表明巯
基 、二硫键的修饰主要是对侧链基团构象产生影响 ,对主链构象影响不大.DTT 使二硫键断裂还原为巯基 ,
PCMB 、NEM 则将巯基进行修饰.从上面结果看 ,PCL II 分子中的二硫键 、巯基与活性中心的构象无关.
3　讨论
经对 PCL II圆二色性的研究表明 ,其是一种高 β-折叠蛋白质 ,典型的高 β-折叠蛋白质的 CD谱的特征是
217nm处的负峰 ,有的还有 242nm 处的小负峰和 195nm 处的正峰 , PCL II 的远紫外 CD谱与典型的高 β-折叠
的不同 ,因而是一种 CD谱异常的特异蛋白质.
在4mol/L和 6mol/L 盐酸胍中的PCL II ,其活性逐步丧失 ,表明活性中心受到破坏;CD谱变化较大 ,说明
不但肽链构象变化较大 ,侧链基团亦发生重排.在近紫外区 ,除 256nm 处的肩受影响较小外 , 278nm处的峰 ,
285nm和 300nm处的肩均发生改变 ,这说明酪氨酸 、色氨酸残基构象均发生改变.在 6mol/L 的盐酸胍中 ,其
谱线只产生260nm处的小峰 ,其余部分几乎呈直线 ,说明受主链的影响 ,侧链也发生极大的变化 ,整个 PCL II
分子几乎无肽链构象而呈现无规卷曲状态.
盐酸胍是一种变性剂 ,它主要和蛋白质分子的氢键形成竞争并与其分子内部的疏水区相互作用 ,但它和
蛋白质分子间的作用不稳固 ,可以通过 Sephadex G-25去除.从荧光光谱和 CD谱表现来看 ,盐酸胍能改变分
子的构象及Trp周围的极性 ,在 4mol/L 浓度时 ,活性中心受到部分破坏 ,但去除后活性中心恢复 ,PCLII 仍能
151第 1期 吴传芳等:变性剂和巯基修饰对黄精凝集素 II构象和活性的影响
使兔血红细胞凝集 ,在 6mol/L浓度时 ,活性丧失 ,去除盐酸胍后仍不能凝集细胞 ,表明活性中心所遭到的破
坏是不可逆的.
二硫键对维持分子中某些氨基酸残基的构象是很重要的.巯基经过不同修饰剂修饰以后 ,其荧光光谱强
度均有不同程度的降低 ,而且其峰也有红移现象 ,表明二硫键被打断 ,导致某些基团重排 ,使其构象发生改变
而引起Trp周围介质极性减弱 ,致使疏水性增加.在近紫外区的 CD谱线也发生了变化 ,这也与 Trp周围介质
极性有关 ,而远紫外 CD谱表明 ,虽二硫键被打断 ,但巯基被修饰后对分子的二级结构影响却不大.
参考文献:
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The Effect of Denaturant and Thiol group Modification on Conformation and
Biological Activity of Polyonatum cyrtonema Hua.Lectin II
WU Chuan-fang , CHANGLi-qin , ZHAO Xi , RONGYan-zhen , GAO Shun , DUAN Zhen , AN Jie ,
GU Yin , WANG Chen-ji , TENGLei , GONG Meng , LU Hui , CHEN Fang , BAO Jin-ku
(College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:To demonstrate the relationship between conformation and biological activity ofPolyonatum cyrtonemaHua.
Lectin II(PCL II), denaturant and thiol group reagents were used to modify PCL II , and the conformational change of
PCL II was studied by fluorescence and circular dichroism (CD)spectra.In 4mol/L and 6mol/L guanidine hydrochlo-
ride , the λmax of fluorescence emission spectra red-shifted and the relative fluorescence intensity decreased obviously.In
4mol/L guanidine hydrochloride , the near-UV CD spectra peak and shoulders disappeared , the [ θ] of 256nm shoulder
increase remarkable.At far-UV region , a negative peak appeared at 242nm , the peak of 224nm and shoulder of 236nm
disappeared , the shoulder of 208nm turned into a negative peak.Removed excess guanidine hydrochloride , the near-UV
CD spectra centered at 260 ～ 320nm regained partly.In 6mol/L guanidine hydrochloride , the shoulder and peak of far-
UV region disappeared , the shoulder of 256nm in near-UV region red-shifted to 260nm , and became a positive peak ,
Removed excess guanidine hydrochloride , the UV CD regained , but the biological activity lost.The results showed that
the conformation of activity center was destroyed unreversely.Modification of hydrosulfide group , the near-UV and far-UV
CD spectra had little changed , but theλmax of fluorescence emission spectra red-shifted and the relative fluorescence in-
tensity decreased obviously , especially themodified by DTT and PCMB.
Key words:Polyonatum cyrtonema Hua , Lectin II (PCLII);chemical modification;fluorescence spectrum;circular
dichrosim;biological activity
152 四川大学学报(自然科学版) 第 40卷