全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:675-680
文章编号:1001-6880(2008)04-0675-06
　
　
　收稿日期:2007-04-23　　　接受日期:2007-07-17
　基金项目:国家自然科学基金(30000032;30270331)
＊通讯作者 Tel:86-28-85410672;E-mail:jinkubao@yahoo.cn
氨基酸修饰及荧光光谱分析研究黄花石蒜
凝集素生物学活性与构象的关系
刘金枝 ,田　勤 ,徐小超 ,李　建 ,鲍锦库＊
四川大学生命科学学院 ,成都 610064
摘　要:本文通过对黄花石蒜凝集素(LycorisaureaAgglutinin, LAA)进行特殊氨基酸的化学修饰 , 显示一个 LAA
分子一共有 8个色氨酸分子 , 其中有 3个位于分子表面或近表面 , Trp、Tyr和 Ser/Thr不是 LAA凝集活性所必需
的氨基酸 , 而 Asp/Glu的羧基和凝血活性密切相关 , 对其修饰后导致凝血活性丧失 50%。 通过荧光淬灭的方法
对 LAA分子中色氨酸所处微环境进行了研究。结果显示中性淬灭剂丙烯酰胺对 LAA分子中色氨酸的淬灭作
用最强可以淬灭 100%的色氨酸荧光 , 其次是离子型淬灭剂碘化钾 , 能淬灭 62.9%的色氨酸荧光 , 而氯化铯对
LAA色氨酸的淬灭最弱 , 几乎不能淬灭 LAA的荧光。
关键词:黄花石蒜凝集素(LAA);荧光淬灭;化学修饰;荧光光谱
中图分类号:Q51;R284.1 文献标识码:A
StudiesontheChemicalModificationofAminoAcidsResidues
andFluorescenceSpectrumofLycorisaureaAgglutinin
LIUJin-zhi, TIANQin, XUXiao-chao, LIJian, BAOJin-ku＊
ColegeofLifeSciences, SichuanUniversity, Chengdu610064 , China
Abstract:ChemicalmodificationstudiesonLycorisaureaAgglutinin(LAA)demonstratedthatLAAcontains8Trpresi-
dues, amongwhichabout3 Trpresidueslocatedthesurfaceofproteinandcanbemodified.Asp/Gluresidueswerees-
sentialforthehemagglutinatingactivityofLAA.However, chemicalmodificationofTrp, TyrandSer/Thrdidn tafect
thehemagglutinatingactivityofLAA.Fluorescencequenchingstudywascarriedoutwiththreequenchers.Maximum
quenchingwasobservedwithacrylamide, folowedbyiodide, quenchingabout100% and62.9% fluorescenceofLAA,
respectively.However, CsClcannotquenchtheintrinsicfluorescenceofTrpresidues.
Keywords:LycorisaureaAgglutinin(LAA);fluorescencequenching;chemicalmodification;fluorescencespectrum
　　黄花石蒜凝集素(LycorisaureaAgglutinin简称
LAA)是来源于石蒜科具有多重生物学活性的甘露
糖结合蛋白 ,属于单子叶甘露糖结合凝集素 。这类
凝集素由于具有独特的糖结合特异性 、逆转录病毒
抑制活性和保护农作物等而引起人们的兴趣 ,对它
的分离纯化及部份性质研究已有报道 [ 1] 。我们在
已有研究的基础上 ,用色氨酸修饰 、荧光淬灭等方
法 ,研究了 LAA的生物学活性与构象的关系 ,为黄
花石蒜凝集素的结构与功能关系研究提供理论依
据 。
1　材料与方法
1.1　材料
丙烯酰胺(acrylamide,华美生物工程公司产品 ,
光谱纯);氯化铯 (Caesiumchloride, 上海试剂一
厂);碘化钾(宜兴市第二化学试剂厂);其它试剂均
为国产分析纯 ,所用溶液均以双蒸水配制。黄花石
蒜凝集素按照 Liujiwei[ 1]文章纯化。
1.2　方法
1.2.1　色氨酸残基化学修饰后 LAA的荧光光谱
按 Spande等的方法[ 2, 3]进行修饰反应。用 0.1
mol/L, pH5.1的磷酸缓冲液配制 LAA溶液(浓度
0.08 mg/mL)。取 3支试管 ,分为 3组 ,第 1组作活
性对照 ,第 2组每隔 5 min加入 2 μL10 mmol/L的
NBS,每次取样于 280 nm处测光吸收值 ,直到继续
滴加 N-溴代二酰亚胺 (N-bromosuccinimide, 简称
NBS)光吸收值略有回升为止 。根据下列公式来计
算被修饰的色氨酸残数:n=(1.31 ×■A280 ×M)/
(C×5500),其中 , ■A280为蛋白质经 NBS修饰后于
280nm处光吸收的下降值 , M为蛋白质分子的相对
分子量 , C为溶液中的 LAA的浓度(×10-3 g/mL),
1.31是经验系数 , 5500是色氨酸的摩尔消光系数 ,
第三组加入 8 mol/L脲 ,然后按照同样的方法进行
色氨酸的修饰和数目的计算。
1.2.1.1　Tyr的修饰
对硝基苯磺酰氟(NBSF)的修饰参照 Liao[ 4]等
的方法 ,反应在 0.1 mol/L, pH8.0的 Tris-HCl缓冲
液中进行。 NBSF先用异丙醇溶解后加入到反应体
系中 , LAA的最终浓度为 1 mg/mL,反应在 25 ℃恒
温水浴进行 60 min后 ,将反应体系的 pH用 0.1 N
HCl调至 pH5.0 ～ 6.0以终止反应 ,透析除去过量
的试剂 ,用兔血细胞检测活性 。对照除未加 NBSF
试剂外(代之以等量的异丙醇),其它试剂和操作步
骤均与修饰样一样。
1.2.1.2　Asp/Glu的修饰
按 C.Caraway[ 5]等的方法 ,采用水溶性的碳二
酰亚胺(EDC)修饰 , 配以亲核剂甘胺酰乙酯。 100
μLEDC加到 1 mL含 1 M甘胺酰乙酯的凝集素样
品中 ,凝集素浓度 1 mg/mL,室温搅拌反应 2h,反应
过程中用 HCl使 pH维持在 4.5,反应结束后用灭菌
水透析测活 。
1.2.1.3　Ser/Thr的修饰
Ser/Thr的修饰参照赵键 ,孙册的方法进行 [ 6] ,
反应在 0.05 mol/L, pH7.0的磷酸缓冲液中进行 。
苯甲磺酰氟(PMSF)先用异丙醇溶解后加入到反应
体系中 ,最终浓度 5 mmo1/L;LAA用同种缓冲液溶
解后加入到反应体系中 ,最终浓度为 lmg/mL。反
应在 30 ℃恒温水浴进行 30 min后 ,透析去除过量
的试剂 ,检测活性 。
1.2.2　黄花石蒜凝集素的荧光光谱分析
1.2.2.1　天然态 LAA样品的天然态荧光光谱的测
定
荧光光谱在荧光分光光度计(Model4500, Hita-
chiLtd., Tokyo, Japan)上进行 , 未经处理样品荧光
光谱的测定是在 PBS缓冲液中测定 ,测定温度为 25
℃。LAA浓度为 0.1 mg/mL;激发光波长为 280和
295nm,测定发射光谱 。再以 337.2 nm为发射波
长 ,测定激发光谱 。
1.2.2.2　氨基酸残基化学修饰后 LAA的荧光光谱
将氨基酸残基化学修饰后的凝集素样品测定荧
光色谱 ,观察化学修饰对凝集素 LAA蛋白质结构的
影响 。
1.2.2.3　黄花石蒜的荧光淬灭研究
1.2.2.3.1　丙烯酰胺对 LAA的淬灭作用
以丙烯酰胺为淬灭剂时 ,在 pH7.2的 Tris-HCl
缓冲液中将丙烯酰胺配制成 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8
和 1.0 mol/L的溶液。向溶液中加入 LAA使其终
浓度为 0.1 mg/mL,进行活性和荧光光谱的测定。
由于丙烯酰胺在 295 nm处的光吸收会引起蛋白质
荧光强度的变化 , 所以要对结果进行校正。采用
Shyamali等 [ 7] 修改过的 Eftink方程进行校正 , 即:
Icorr=Iobs[ log-1 (0.5A295)] [ log-1 (0.5A338 )] , 其中
Icorr, Iobs分别为校正后及观察到的 338 nm处的相对
荧光强度 , A295和 A338为丙烯酰胺于 295和 338 nm
处的光吸收值 。
1.2.2.3.2　KI对 LAA荧光的淬灭作用
按照 Sushama等 [ 8]的方法 , KI溶液由 pH7.4,
20mmol/L的 PBS缓冲液配制成 0.0、0.1、0.2、0.3、
和 0.4 mol/L四种浓度(内含 2 mmol/LNa2S2O3作
还原剂 , 以防止 I2的生成)。向五种溶液中加入
LAA使其终浓度为 0.08mg/mL,进行荧光光谱的测
定。
1.2.2.3.3　氯化铯对 LAA的淬灭作用
将 CsCl用生理盐水分别配制成 0.0、0.1、0.2、
0.3、和 0.4 mol/L四种浓度 ,向溶液中加入 LAA使
其终浓度为 0.1 mg/mL,进行荧光光谱的测定。
2　结果与分析
2.1　LAA部分基团的化学修饰
2.1.1　LAA色氨酸修饰
NBS滴定法修饰 LAA,经 Spande[ 2]方法计算 ,
在自然条件下 ,有约有 2.7个 Trp残基被修饰;但是
色氨酸的修饰并没有引起 LAA凝血活性的变化(表
1),表明色氨酸可能并不是 LAA凝血活性所必需的
氨基酸。 LAA经脲变性后约有 8个色氨酸被修饰 ,
说明其中约有 5个色氨酸残基位于 LAA分子内部
或偏内部区域 ,在自然条件下 NBS难以与之接触。
2.1.2　LAA的 Tyr残基修饰
NAI是使 Tyr残基的酚羟基发生乙酰化的试
剂 ,表 1中可以看到 , NAI修饰的 LAA凝血活性没
有变化。 NBSF是一种非常专一的酪氨酸残基修饰
676 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
剂 ,其修饰产物是 N-磺酰化的 Tyr。 NBSF修饰后 ,
LAA凝集活性基本不变 ,可以确定 Tyr残基不位于
凝集活性中心。
2.1.3　LAA的 Asp/Glu残基修饰
水溶性 EDC修饰前后黄花石蒜凝集素凝血活
性的变化见表 1。经 EDC修饰后 ,凝集素对兔血细
胞凝集能力下降 50%。水溶性 EDC是含羧基氨基
酸的专一性修饰剂 ,与亲核剂配合使用时修饰的条
件不是很温和 ,并可能使蛋白的构象发生一定的变
化 。另外 ,羧基常常是形成维持分子构象的氢键和
盐键的重要成分之一 ,因而修饰后可能引起分子构
象的变化 ,进而影响 LAA的凝血活性 。这说明酸性
氨基酸 Asp/Glu的羧基对保持 LAA凝血活性非常
重要 ,可能处于凝集活性的糖结合部位 ,或者位于活
性中心部位附近参与维持其必需的构象 。
2.1.4　LAA的 Ser/Thr残基修饰
经 PMSF修饰后 , LAA凝血活性部分丧失。因
为 PMSF是一种对 Ser/Thr专一的羟基修饰剂 ,表明
Ser或 Thr并非是 LAA凝血活性所必需的 ,也可能
不位于凝集活性部位。
表 1　化学修饰对 LAA凝血活性的影响
Table1　EfectofchemicalmodificationonthehemagglutinatingactivityofLAA
LAA样品
SampleofLAA
LAA浓度 ConcentrationofLAA(mg/mL)
1000 500 250 125 62.5 31.3 15.6 7.8 3.9
Control + + + + + + + + +
NBS-treatedLAA + + + + + + + + +
NAI-treatedLAA + + + + + + + + +
NBSF-treatedLAA + + + + + + + + +
EDC-treatedLAA + + + + + - - - -
PMSF-treatedLAA + + + + + + + - -
2.2　黄花石蒜凝集素的荧光光谱分析
2.2.1　天然态的荧光光谱
从图 1中可以看出 , LAA的荧光发射光谱有一
个峰 ,波长在 337.2 nm处;295 nm处激发的荧光发
射峰远远小于 280 nm,由于 295 nm仅激发色氨酸
(Trp), 280nm激发的发射光谱由 Trp和 Tyr共同贡
献 ,但是在光谱中并没有 Tyr残基产生的荧光峰 ,说
明 LAA分子中的 Tyr残基和 Trp残基在空间位置上
相距较近 ,发生了从 Tyr到 Trp的能量转移 [ 9] ,和游
离色氨酸最大荧光发射峰位 348nm相比 , 295 nm处
图 1　天然态 LAA的内源荧光光谱
Fig.1　IntrinsicfluorescencespectraofnativeLAA
1.337.2nm处的激发光谱;2.280nm处的发射光谱;3.295nm
处的发射光谱
1.Fluorescenceexcitationspectrumat337.2 nm;2.Fluorescence
emissionspectrumat280nm;3.Fluorescenceemissionspectrumat
295nm
的荧光最大发射峰为 337.2 nm,蓝移了 10.8nm,说
明 Trp残基处于一种疏水环境 ,部分 Trp残基可能位于
蛋白质的疏水内核或者表面的疏水浅沟里面。
2.2.2　氨基酸残基化学修饰后 LAA的荧光光谱
2.2.2.1　色氨酸化学修饰对 LAA内源荧光的影响
NBS滴定法修饰 LAA,修饰过程中荧光光谱如
图 2。以 295 nm波长激发 , 300 ～ 400 nm范围内的
内源荧光发射光谱强度明显减弱 ,发射谱的峰形由
尖变钝 ,这种变化显然与 Trp残基逐渐被修饰有关。
随着 Trp不断被修饰 ,发射光谱峰位峰发生了部分
图 2　自然条件下 Trp修饰对 LAA荧光光谱影响
Fig.2　Effectofthemodificationoftryptophanonthefluores-
cenceofLAAinnativecondition
曲线从上到下分别代表加入 0、 6、 12、 18、 24μL10mmol/LNBS时
的荧光光谱。
Curvesfromtoptobotomrepresentthefluorescencespectraafterthe
additionof0, 6, 12, 18and24μLof10mmol/LNBS.
677Vol.20 刘金枝等:氨基酸修饰及荧光光谱分析研究黄花石蒜凝集素生物学活性与构象的关系
蓝移 ,说明色氨酸修饰后 LAA内色氨酸所处微环境
发生了变化 。
2.2.2.2　其它氨基酸化学修饰对 LAA内源荧光的
影响
其它氨基酸修饰 LAA的荧光光谱如图 3。以 295
nm波长为激发 , LAA产生的荧光发射光谱显示:NAI
与 NBSF修饰的 Tyr产生的荧光与 LAA本身的内源荧
光图谱基本相似 ,只是峰值略有下降;而 PMSF修饰的
Ser/Thr产生的荧光与 LAA的本身的内源荧光图谱也
只是荧光强度下降 ,峰形没有大的改变 ,由此说明 , NAI
与 NBSF修饰 Tyr和 PMSF修饰 Ser/Thr后 ,色氨酸的
疏水环境没有发生明显改变。
而 EDC修饰 Asp/Glu,随着 Asp/Glu不断被修
饰 ,发射光谱峰位峰发生了部分红移 ,其凝集活性丧
失 50%,说明其活性的降低可能是 LAA内色氨酸所
处微环境发生的变化所至 。
图 3　不同氨基酸修饰的 LAA的荧光图谱
Fig.3　FluorescencespectraofLAAwithdifferentmodifica-
tionreagents
A.空白;B.NAI修饰;C.NBSF修饰;D.PMSF修饰;E.EDC修
饰 ,发射波长 295nm
A.Control;B.ModifiedbyNAI;C.ModifiedbyNBSF;D.Modified
byPMSF;E.ModifiedbyEDC, Excitationwavelengthwasat295nm
2.3　LAA荧光淬灭研究
2.3.1　丙烯酰胺对 LAA的淬灭作用
　　一些特殊的物质能使产生荧光的物质荧光强度
图 4　丙烯酰胺对 LAA的荧光淬灭图
Fig.4　QuenchingofLAAintrinsicfluorescencespectrabyac-
rylamide
丙烯酰胺浓度从上到下分别为 0、0.1、 0.2、 0.3、0.4mol/L, 295 nm
激发
Concentrationofacrylamidefromtoptobottom:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4
mol/Lexictedat295 nm
减弱甚至不产生荧光 ,这就是荧光淬灭现象[ 10, 11] 。
通过对荧光淬灭的研究 ,能够获得物质中发光基团
所处微环境的有用信息 。因此 ,荧光淬灭的方法可
以用于研究蛋白质分子中 Trp残基所处的微环境 。
　　丙烯酰胺对 LAA的荧光淬灭作用见图 4,随着
丙烯酰胺浓度的升高 ,荧光强度逐渐下降。以 F0 /F
对 [ Q]作图 ,结果得到一条直线 ,表明两者呈线性关
系 ,遵从 Stern-Volmer公式:F0 /F=1 +KQ [ Q] (KQ
为淬灭常数),因此丙烯酰胺对 LAA分子中 Tyr和
Trp残基的荧光淬灭作用属完全动态淬灭(扩散控
制机制)。从图 5-A中可以计算得出 KQ =2.63, 1/
KQ=0.380。所以 50% Trp荧光强度被淬灭时所需
丙烯酰胺的浓度为 0.380 mol/L。
由上述公式经推导得[ 9, 12] :F0 /■F=1 /fm +1/
(fm K)×1 /[ Q] ,其中 K为可被淬灭剂所接近的发
色基团的 Stern-Volmer常数 , ■F表示加入淬灭剂
前后荧光强度的变化值 , fm为可被荧光淬灭剂所接
近的发色基团占总的荧光发色基团的百分比 。
图 5　丙烯酰胺对 LAA内源荧光的淬灭作用的 Stern-Volmer
曲线图(295nm激发)
Fig.5　Stern-Volmerplotsofthequenchingofintrinsicfluores-
cencespectraofLAAbyacrylamide(excitedat295nm
　　以 F0 /■F对 1/[ Q]作图 ,从图 5-B中可知 1/
fm =0.95,所以 fm =1,丙烯酰胺几乎能完全淬灭
LAA分子中 Trp残基的荧光。
图 6　碘化钾对石蒜凝集素荧光淬灭图
Fig.6　QuenchingofLAAintrinsicfluorescencespectrabyKI
碘化钾的浓度从上到下分别为 0, 0.1、 0.2、0.3、0.4 mol/L, 295
nm激发。
ConcentrationofKIfromtoptobotom:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mol/
L, exictedat295nm.
678 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
2.3.2　KI的淬灭
　　KI是一种带负电荷的阴离子型淬灭剂 ,由于其
分子较中性淬灭剂大 ,并且带有一定的电荷 ,只能淬
灭位于分子表面或接近于分子表面 ,极性环境中的
Trp荧光。 KI对 LAA荧光淬灭如图 6所示 ,从图中
可以看出 ,随 KI浓度的升高 ,最大发射波长位置和
峰形基本不变 ,各激发波长下的荧光发射峰强度逐
渐下降 ,说明碘化钾能淬灭 LAA的荧光。
图 7　碘化钾对 LAA内源荧光的淬灭作用的 Stern-Volmer
曲线图(295 nm激发)
Fig.7　Stern-Volmerplotsofthequenchingofintrinsicfluo-
rescencespectraofLAAbyKI(excitedat295 nm)
　　按照同样的方法以 F0 /F对 [ Q]作图 ,结果得到
一条直线 ,表明两者呈线性关系 ,遵从 Stern-Volmer
公式[ 9, 12] :F0 /F=1 +KQ [ Q] (KQ为淬灭常数),因
此 KI对 LAA分子中 Tyr和 Trp残基的荧光淬灭作
用也是动态淬灭(扩散控制机制)。从图 7-A中可
以得出 KQ =1.62, 1/KQ =0.617, 所以 LAA分子
50%Trp荧光被淬灭时所需碘化钾的浓度为 0.617
mol/L。由 Stern-Volmer修正公式 F0 /■F=1/fm +
1 /(fm K)×1 /[ Q] ,通过 F0 /■F对 1/[ Q]作图得图
7-B,从图中可知 1/fm =1.591,所以 fm =0.629,即
KI能淬灭 LAA分子中 62.9%的 Trp残基的荧光 ,
可以看出 KI对 LAA分子的淬灭程度远不如丙烯酰
胺强。
2.3.3　CsCl的淬灭
CsCl和 KI一样属于离子型淬灭剂 ,带正电荷 ,
不能进入分子内部 ,只能淬灭位于分子表面或接近
于分子表面 ,极性环境中的 Trp荧光。 CsCl对 LAA
的淬灭作用如图 8所示 ,从图上可以明显看出随着
CsCl浓度的升高 , LAA荧光强度没有明显的变化 ,
即使浓度达到 0.5 mol/L时 ,对 LAA淬灭的程度仍
很小。这可能是由于 LAA分子中的荧光基团是处
于一个带正电的环境 , Cs+很难与荧光基团接近进
行淬灭 。
图 8　氯化铯对 LAA的荧光淬灭图(295nm激发)
Fig.8　QuenchingofLAAintrinsicfluorescencespectraby
CsCl(excitedat295 nm)
氯化铯的浓度从上到下分别为:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mol/L。
ConcentrationofCsClfromtoptobottom:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5
mol/L.
3　讨论
　　植物凝集素是一类非酶 、非免疫来源并具有高
度特异性糖结合活性的蛋白 [ 13] 。凝集素对细胞的
凝集活性主要归因于其特异的糖结合专一性 ,而凝
集素的构象和特殊氨基酸组成的糖识别结构域对保
持这种结合活性是必需的。氨基酸化学修饰和荧光
淬灭可以确定荧光基团的分布状况及微环境的变
化 ,从而提供凝集素一级结构和生物学活性的相关
性。
本文应用特殊氨基酸残基的化学修饰和荧光研
究 ,结果表明:有 3个色氨酸位于 LAA分子表面 ,约
有 5个色氨酸处于 LAA分子的疏水内核 , Trp、Tyr
和 Ser/Thr不是 LAA凝集活性所必需的氨基酸 ,而
Asp/Glu的羧基和凝血活性密切相关 ,对其修饰后
导致凝血活性丧失 50%。三种淬灭剂对黄花石蒜
凝集素内源荧光的淬灭作用丙烯酰胺最强 ,几乎可
以淬灭 LAA全部的荧光;其次为离子型淬灭剂 KI,
而 CsCl对 LAA的淬灭作用很小 。KI和 CsCl不及
丙烯酰胺淬灭作用强 ,一方面是因为丙烯酰胺是一
种非常有效的 、不带电荷的极性淬灭剂 ,它可以进入
蛋白质的疏水内核 [ 14] ,既可淬灭分子表面的荧光基
团的荧光 ,也能淬灭埋在分子内部的荧光基团的荧
光。带电荷淬灭剂 KI和 CsCl并不能进入蛋白质分
子内部疏水环境 ,因此只能淬灭位于分子表面或接
近于分子表面的极性环境中的 Trp荧光。另一方
面 ,在通常情况下小分子和大分子的相互作用主要
通过氢键 、范德华力 、静电作用和疏水相互作用。因
此 ,可能是 Trp残基周围存在带相同电荷的极性区 ,
排斥了 I-和 Cs+的接近或被包埋的 Trp残基所处的
疏水穴使 I-和 Cs+不能进入 [ 15] 。说明 LAA分子中
679Vol.20 刘金枝等:氨基酸修饰及荧光光谱分析研究黄花石蒜凝集素生物学活性与构象的关系
的位于表面的色氨酸可能处于一种带正电荷的环
境 。
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