全 文 ：应用与环境生物学报　2000 ,6(4):317～ 320 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2000-08-25
　
收稿日期:2000-01-10　　接受日期:2000-04-07
岩豆凝集素分子中色氨酸残基
的化学修饰及其荧光光谱研究
牟　航　周　红　鲍锦库　于　源1 　张仁怀1　吴洽庆1
(四川大学生命科学学院　成都　610064)
(1中国科学院成都生物研究所　成都　610041)
摘　要　从岩豆(Millettia dielsiana Harms ex Diels)种子中分离纯化得到的岩豆凝集素(简称MDL)经链霉蛋白酶
水解 ,测得其分子中含有 4个色氨酸(Trp)残基.用 N-溴代丁二酰亚胺(NBS)对 MDL分子中的色氨酸残基进行
化学修饰 ,在无变性剂存在下有 3.6个Trp残基被修饰 ,在变性条件下可修饰 3.8个Trp残基.修饰后MDL 活性
均丧失 ,且甘露糖对MDL 活性具有保护作用.表明 Trp残基是MDL 凝集活性所必需的基团 ,且位于MDL糖结合
部位.同时采用荧光光谱实验发现 ,随着NBS的加入 ,MDL荧光强度不断减弱 ,但发射谱形状和最大发射波长无
大的变化 ,提示 Trp残基可能位于MDL 分子表面的疏水区内.图 3 参 8
关键词　岩豆;凝集素;色氨酸残基;化学修饰;荧光光谱;糖蛋白
CLC　Q946.1 ∶Q949.751.906
CHEMICAL MODIFICATION OF TRYPTOPHAN RESIDUES
AND STUDIES ON LECTIN FROM
MILLETTIA DIELSIANA HARMS EX DIELS
MU Hang , ZHOU Hong , BAO Jinku , YU Yuan1 , ZHANG Renghuai1 &WU Qiaqing1
(College of Life Science , S ichuan University , Chengdu　610064)
(1 Chengdu Institute of Biology , Chinese Academy of Sciences , Chengdu　610041)
Abstract　The purified Millettia dielsiana Harms ex Diels Lectin(MDL)was studied by chemical modifica-
tion of typtophan residues and fluorescence spectroscopy.Result from pronase hydrolysis assay showed that there
were four tryptophan(Trp)residues in MDL molecule.Modification of Trp residues with N-Bromosuccinimide
(NBS)induced obvious changes in the fluorescence emission spectra of MDL and resulted in a complete loss of
hemagglutinating activity.There were 3.6 Trp residues modified as demonstrated by modification with NBS in
native state and 3.8 Trp residues modified in denaturing condition [ c(urea)=8 mol/L] .The research also
found that mannose could prevent MDL from losing its activity after being modified by NBS.It indicated that Trp
residues were essential for the activity of MDL and involved at carbohydrate-binding site.Results from fluores-
cence spectra also implied that Trp residues were located in the hydrophobic pocket of the surface of MDL.
Fig 3 , Ref 8
Keywords　Millettia dielsiana Harms ex Diels;lectin;tryptophan residue;chemical modification;fluores-
cence spectra;glycoprotein
CLC　Q946.1 ∶ Q949.751.906
凝集素是一类非酶 、非抗体 、具有糖结合专一性 、能促使细胞凝集以及使糖复合物沉淀的糖结合蛋白或糖
蛋白.从一百多年前人类最早发现凝集素到 1936年第一次分离纯化得到凝集素———伴刀豆球蛋白(ConA), 人
们逐步确认了凝集素广泛的生物学活性与其糖结合专一性的密切关系.以后 , 凝集素对人血型抗原的专一性
结合以及促细胞有丝分裂作用和凝集恶性细胞的能力被发现 , 同时发现凝集素具有抵御许多疾病和抗植物
病虫害等方面的作用 ,于是对凝集素的研究受到了广泛的关注[ 1] .色氨酸(Trp)残基是凝集素分子中重要的基
团 ,它往往在蛋白质分子的各级结构以及活性中心之中起着特殊的重要作用.研究表明 , 来源于豆科植物的凝
集素家族 ,其分子中的保守区域是凝集素的活性中心 , 具有糖结合活性 ,而 Trp 残基在其中扮演重要角色.本
文采用已纯化的岩豆凝集素(MDL)为材料 , 研究其色氨酸残基的化学修饰和荧光光谱的变化 , 以揭示两者之
间及其与凝集素生物活性之间的关系.
1　材料与方法
1.1　材 料
岩豆(Millettia dielsiana Harms ex Diels)种子采自四川长宁县山区秋季成熟的种子.MDL 按文献[ 2] 报道的
方法分离纯化 ,样品经 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条蛋白带.兔血采自农贸市场 , 血球经生理盐水洗涤 3
次 ,配成 φ=2%的红细胞悬液备用.
链霉蛋白酶(Pronase E)为MERCK 产品;L-Trp 为 EMK产品;D(+)-甘露糖为 Fluka产品;N-溴代丁二
酰亚胺(NBS)为上海化学试剂厂产品;其余试剂均为分析纯.
所有荧光测定均在 Hitachi MPF-4型荧光分光光度计上进行.样品测定 θ= 25℃,激发和发射光谱 λ均
为 5 nm.
1.2　方 法
1.2.1　蛋白质浓度的测定　　采用 Lowry[ 3]法测定 , 以牛血清白蛋白作标准.
1.2.2　MDL分子中色氨酸残基数目的测定　　MDL经链霉蛋白酶水解 , 以对二甲基氨基苯甲醛(DAB)为显
色剂 ,用比色法定量测定 MDL分子中色氨酸的含量和色氨酸残基总数[ 3] .
1.2.3　MDL分子中色氨酸残基的修饰及被修饰 Trp 残基数的测定　　参考 Spande等的方法[ 4] , 用 pH 4.0 , 0.
1 mol/L NaAc-HAc缓冲液配制MDL溶液.分别取3 mL置于6 支试管中 ,每 3支为 1 组 ,第 1组不加脲 , 第2 组
的3 支试管中分别加入脲使其浓度达到 8 mol/ L.每组中各取一支试管作活性对照(CK).第 2 支用于NBS 修饰
反应:即每次加入 10 μL c(NBS)= 10 mmol/ L的溶液(用 pH 4.0 , 0.1 mol/ L NaAc-HAc 缓冲液配制), 间隔 5
min测定 D280nm ,再加入 NBS , 直至 D280nm不再下降(或略有升高)为止 , 此时表明修饰已完成 , 即可定量计算被
修饰的色氨酸残基数 N(Trp):N(Trp)=(1.31×■D280nm ×Mr×V)/(5 500×m)或 N(Trp)=(1.31×
■D280nm×Mr)/(5 500×ρ).其中 N(Trp)为每个MDL分子中被修饰的 Trp 残基数 , Mr是 MDL的分子量 , V 为
反应体系的初始体积(mL),m 为 MDL的含量(mg), ρ为被滴定溶液中蛋白质质量浓度(mg/mL), 1.31 是经验
系数 , 5 500 是色氨酸的摩尔消光系数.第三支试管中加入甘露糖至 0.2 mol/L , 再加入过量 NBS 进行修饰 , 透
析除去过量单糖和 NBS ,检查活性 , 判断抑制糖是否对MDL有保护作用.
1.2.4　MDL内源荧光光谱的测定　　分别以 280 nm 和 292 nm 为激发波长 ,测得 MDL的荧光发射光谱 , 再以
发射谱中的λmax(332 nm)为发射波长 , 测得激发光谱.
1.2.5　离子强度和温度对MDL内源荧光光谱的影响　　离子强度的变化是通过向MDL溶液中加入 KCl , 使
其浓度从 10 mmol/L逐步上升到 1.5 mol/L , 观察 MDL内源荧光光谱有无变化.MDL 溶液分别在 40℃、70℃、
100℃处理 5 min ,冷至室温后 , 再观察荧光光谱的变化.
1.2.6　NBS 修饰后MDL内源荧光光谱的变化　　MDL 溶液中每次加入 20μL 10mmol/ L NBS , 分别以 280 nm
和 292 nm 波长激发 ,测定内源荧光光谱的变化.
2　结 果
2.1　MDL中 N(Trp)的测定
由比色法定量测得MDL中色氨酸含量为 1.34%,每分子 MDL含有 4.1 个色氨酸残基(见 Fig.1).
318　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　6卷
2.2　NBS对 Trp残基的修饰
在 pH 4.0 , 0.1 mol/ L NaAc-HAc 缓冲液中 ,用 NBS 滴定法修饰MDL ,第 1 组非变性条件下 ,有 3.6 个 Trp
残基被修饰;而第 2 组强变性条件下(脲浓度 8 mol/L), 有 3.8 个 Trp 残基被修饰.活性检测显示无论是否在变
性条件下 ,经 NBS 修饰后的 MDL均丧失活性 , 而对照溶液仍有凝集活性.当有甘露糖存在时 ,MDL中 Trp 残基
不被全部修饰 ,仍然保持一定的凝集活性.
2.3　荧光光谱分析
2.3.1　MDL的内源荧光光谱　　Fig.2中曲线 1 和曲线 2分别是激发波长为 280 nm 和292 nm 时MDL的发射
光谱.又以 λmax=332 nm 为发射波长得到MDL的激发光谱(曲线 3).从图中可以看出 , 激发光谱有两个峰 , 波
长分别为 236 nm 和 284 nm , 发射光谱有一个峰 ,波长在 332 nm处.
图 1　DAB比色法测定MDL分子中色氨酸含量
Fig.1　Determination of the typtophan content of MDL
with p-Dimethylamino benzaldehyde
图 2　MDL内源荧光光谱
Fig.2　Intrinsic fluorescence spectra of MDL
ρ(MDL)=0.1 mg/mL , pH 7.5, c(Tris― HCl)=0.05 mol/ L
2.3.2　离子强度及温度对内源荧光光谱的影响　　改变 MDL溶液中 c(KCl),在 10 mmol/L到 1.5 mol/ L范围
内 ,离子强度的变化对 MDL内源荧光发射光谱的波长 、峰形和强度均无影响.
取经不同温度处理的样品溶液 ,测定凝血活性.结果在常温(25℃)和 40℃下样品凝集活性强;70℃处理的
样品活性有所下降;100℃处理的样品完全失活.通常升高温度可引起蛋白质内源荧光强度下降 ,这是一种荧
光淬灭现象.但 MDL经 40℃和 70℃处理后荧光强度并没有下降 , 最大发射波长 λmax=332 nm 时也保持不变 ,
说明此时MDL分子结构还未发生明显变化.而经 100℃处理过的样品其荧光强度反而有所增强 , λmax红移至
336 nm ,推测这与蛋白质在高温下热变性有关.
2.3.3　NBS 修饰MDL后内源荧光的变化　　分别用 280 nm 和 292 nm 波长激发 , 300～ 420 nm 范围内的内源
荧光发射光谱强度明显减弱 ,但发射谱的形状和最大发射波长λmax=332 nm 时并无明显变化(见 Fig.3 A、B).
这种变化显然与 Trp 残基逐渐被修饰有关.
图 3　NBS修饰后MDL 的荧光发射光谱
Fig.3　Fluorescence emission spectra of MDL modified by NBS
3194期 牟　航等:岩豆凝集素分子中色氨酸残基的化学修饰及其荧光光谱研究 　　
3　讨 论
本文采用链霉蛋白酶降解后 DAB比色法测得MDL分子中共有 4.1 个色氨酸残基.由于MDL分子由两个
同样大小的亚基组成[ 5] ,因此每个亚基可能含有2 个色氨酸残基.
用化学试剂专一性修饰蛋白质分子中某种氨基酸残基的侧链基团 , 是研究蛋白质结构与功能关系的一
种常用方法.在不使用变性剂的条件下 , 用NBS 修饰MDL可判断分子表面的色氨酸残基数.pH 3～ 4 时大多数
色氨酸残基被NBS 修饰 ,随着 pH 值升高 , NBS 所修饰的色氨酸残基数下降 , 且 pH 越接近 4 , NBS 对色氨酸残
基作用的专一性就越强[ 4] .在 pH 4 时 ,非变性条件下 ,每个MDL分子有 3.6 个 Trp 残基被修饰 ,提示 4 个 Trp
残基可能全部位于 MDL 分子表面 , NBS 易接近并与之反应 , 不存在包埋在分子内的 Trp 残基;在脲浓度为 8
mol/ L的强变性条件下 ,每个 MDL分子有 3.8 个Trp 残基被修饰 , 这与用 Lindahl法[ 6]修饰得到的结果是一致
的[ 2] .随着分子表面的 4 个 Trp残基被修饰破坏 ,MDL 的凝集活性逐渐下降直至丧失.被修饰的MDL完全失
活 ,而 CK仍有活性.这表明 Trp 残基对MDL活性是重要的 ,并且可以推断MDL分子表面的 4 个 Trp 残基是维
持其凝集活性所必需的.
尽管Trp 残基的修饰会引起活性的变化, 但并不能就此确定其位于活性部位.因为Trp 残基可能位于结合部
位, 当它被修饰后产生了空间位阻效应阻碍了凝集素与糖基的结合;也可能是 Trp 对维持MDL的天然活性构象
起关键作用 ,被修饰后空间构象破坏 , 活性也随之丧失.因此我们加入专一性抑制糖 ,判断其是否阻断化学修饰
剂对 Trp 残基的作用[ 7] ,从而确认Trp 残基是否位于活性部位.对MDL的研究发现 ,当其专一性抑制糖甘露糖存
在时 , Trp 残基可避免被 NBS 修饰且对凝集活性有一定的保护作用 , 表明MDL 分子中的 Trp 残基直接参与了其
糖结合部位的组成.由于 Trp 残基位于 MDL分子表面 ,可以推断MDL的糖结合部位就位于分子表面.
实验表明 ,离子强度改变后 MDL内源荧光光谱基本无变化 ,说明离子强度对 MDL的溶液构象和 Trp 残基
的微环境基本没有影响.
研究表明 ,当激发波长为 292 nm 时 , 多数蛋白质的荧光光谱基本由 Trp 残基提供(95%以上).由于 MDL
分子中不含Tyr残基 , 故以 280 nm 作为激发波长得到的MDL内源荧光发射光谱中 , 观察不到 Tyr 残基产生的
荧光 ,其内源荧光完全由 Trp 残基贡献.与水溶液中的游离Trp相比 ,MDL的最大荧光发射波长为332 nm , 发生
了蓝移 ,提示 MDL分子中 Trp 残基可能处于疏水区.MDL经 NBS 修饰 ,其内源荧光光谱的荧光强度不断下降 ,
但发射谱的形状和最大发射波长并无明显变化 ,提示 MDL分子表面的被修饰色氨酸残基是处于疏水环境中.
否则随着 Trp 残基被修饰 ,MDL荧光光谱应有明显蓝移.这一结论与我们研究的野花生豆凝集素结果一致[ 8] .
总之 , Trp 残基是维持MDL生物活性所必需的基团 , 可能参与了活性部位的组成 ,并且可能位于分子表面
的疏水袋中.
参考文献
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320　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　6卷