全 文 ：第 14卷 第 6期 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报 Vo l. 14, No. 6
1998年 12月 Chinese Journal o f Biochemist ry and M olecular Biolog y Dec. 1998　
收稿日期: 1997-07-25,修回日期: 1998-01-04
岩豆凝集素分子修饰与圆二色性的关系研究
鲍锦库　曾仲奎　周　红　杨　莉
(四川大学生物系生物化学教研室 ,成都　 610064)
摘要　天然态岩豆凝集素 ( MDL)远紫外圆二色性 ( CD)谱显示 216 nm处单一负峰 ,是一种高
β -折叠构象凝集素 ;近紫外 CD谱呈现 282 nm处负峰和 260～ 275 nm及 295 nm处的负肩 ,经
N-乙基顺丁烯二酰亚胺 ( N EM I)和对氯汞苯甲酸 ( PCMB)修饰 MDL的巯基 ,其近紫外 CD谱
未发生变化 ,远紫外 CD谱仅发生细微变化 , M DL凝集活性保持不变 ; PCMB过量时 , CD谱呈
现典型的无规卷曲谱形 , M DL完全丧失凝集活性 ,去除 PCMB后 ,活性又全部恢复 .二硫苏糖
醇 ( DDT)修饰 MDL的二硫键并用碘乙酸 ( ICH2 COOH)保护巯基 , M DL远紫外 CD谱 216 nm
处的负峰红移至 225 nm,且显著减小 ;同时 ,近紫外 CD谱 282 nm处负峰几乎消失 ,两负肩分
别保持完整 ,分子中α-螺旋降低 ,无规卷曲增加较多 , M DL凝集活性未发生变化 .用 N-溴代丁
二酰亚胺 ( N BS)修饰 MDL分子中的色氨酸 ,导致 216 nm负峰蓝移至 208 nm且变小 ,分子中
无规卷曲和 α-螺旋增加 ,β折叠减少 ,近紫外 CD谱 295 nm负肩消失 , 282 nm负峰红移至 287
nm , MDL凝集活性完全丧失 .
关键词:凝集素 ,岩豆凝集素 ,化学修饰 ,生物活性 ,圆二色性
Molecular Modification and Circular Dichroism of
Millettia dielsiana Harms. Lectin
Bao Jin-Ku　 Zeng Zhong-Kui　 Zhou Hong　 Yang Li
( Biology Departm ent of Sichuan Universi ty ,Chengdu 610064)
Abstract　 To explain the ro les o f thiol g roups (— SH) , disulfide bonds (— S— S— ) and tryp-
tophan in st ructure and function of a legume lectin from Mil let tia dielsiana Harms( abbrev.
MDL) , the confo rmational change o f MDL was studied by ci rcular dichroism ( CD) . Nativ e
MDL contained about 16. 2% α-helix and 46. 3% β -sheet, i ts CD spect ra exhibited a negativ e
peak a t 216 nm, near ult ravio let ( UV ) CD spect ra show ed a nega tiv e band a t 282 nm and two
negativ e shoulders centered at 260～ 275 nm and 295 nm. Treated MDL with N-ethy l-
maleimide and p-chloromercuribenzoate only resulted in minor change o f CD spect ra. M odifi-
cation of MDL by di thioth reitol and iodoacetic acid, caused the band red-shi f t f rom 216 nm to
225 nm and the ex t remum moves upw ard. the nega tiv e peak a t 282 nm disappeaed, while the
tw o shoulders intact , since there was no tyrosine in MDL, so the peak at 282 nm was con-
tributed by— S— S— . The content of helix and sheet decreased, w hile MDL kept all activi ty.
So the ca rbohydrate-binding si te w as located at subuni t and the domain w as consisted of
monomer, no t monomer-monomer interaction. The second and tertiary st ructure elements in
715
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1998. 06. 013
MDL exhibited less interaction at the monomer-monomer interface region, since MDL was a
dimeric glycopro tein composed of identical subuni t. Treated by N-bromosuccinimide, MDL
lo st activi ty completely , the band a t 216 nm blue-shi ft to 208 nm with decreased ex t remum;
the nega tiv e shoulder a t 295 nm disappea red andβ -sheet decreased. So this shoulder w as con-
tributed by t ryptophan, and tryptophans w ere all on the surface o f MDL and crucial fo r the
confo rmation and activi ty o f MDL. Some tryptophan may be located o r a round the carbohy-
drate-binding si te.
Key words: Lectin,Millett ia dielsiana Harms lectin, Chemical modi fica tion, Bioactivi ty , Ci rcu-
lar dich roism
二硫键和色氨酸是蛋白质分子中重要的侧链基团 ,在维系蛋白质分子的各级结构 ,以及在
发挥生物学活性中都起着重要作用 .在植物凝集素超级家族中 ,豆科植物凝集素因其种属繁
多 ,分布广 ,性质不一而占有重要地位 .按亚基组成一般分为两类: 第一类由同种亚基组成的凝
集素 ,如 ConA和 WBAI分别有四个和两个相同亚基 ,另一类则由两种亚基组成 ,如 PSA.色
氨酸在豆科植物凝集素家族的糖结合区域中扮演重要角色 ,处于这族分子的保守区域 ,随着色
氨酸的修饰和破坏 ,会导致凝集素生物学活性的降低和逐渐丧失 [1～ 3 ] .岩豆凝集素是一种分子
量为 63 800的糖蛋白 ,由两个分子量约为 32 000的相同亚基组成 [4 ] ,属于和 ConA同类的豆科
植物凝集素 ,研究表明色氨酸与其生物学活性密切相关 .本文在岩豆凝集素化学修饰和活性关
系研究 [5 ]的基础上报道二硫键、巯基和色氨酸修饰与结构变化的关系 .
1　材料与方法
1. 1　材料
岩豆凝集素 (Mil let tia dielsiana Harms. lectin) ,简称 MDL,按文献 [ 5]报道的方法纯化 ,经
FPLC检测为单一蛋白峰 ,兔血采自本系动物饲养室 ,血球经生理盐水洗涤 3次 ,配成 2% (v /v )
红细胞悬液备用 .
Sephadex G-25为 Pharmacia产品 ;二硫苏糖醇 ( DT T) ,对氯汞苯甲酸 ( PCMB)为 Serv a
产品 ; N-乙基顺丁烯二酰亚胺 ( N EM I)为上海东风生化试剂厂产品 ; N-溴代丁二酰亚胺
( NBS)、碘乙酸 ( ICH2 COOH)为上海化学试剂厂产品 ;其余试剂为分析纯级 .
1. 2　方法
1. 2. 1　蛋白质浓度的测定　用 Folin-酚试剂测定 ,以牛血清白蛋白作标准 .
1. 2. 2　凝集活性的测定　在微量血清稀释板上进行 ,在系列倍比稀释的“V”型孔中 ,加入兔
红细胞振摇 10 min, 25℃放置 2 h后 ,显微镜检查凝血活性 .
1. 2. 3　二硫键、巯基的修饰　 MDL与 DTT、 ICH2 COOH、N EM I、 PCMB的反应参照文献 [5 ]
的方法进行 ,经 Sephadex G-25柱去除过量试剂 ,测定凝集活性和圆二色性 ,同时增加未去除
过量 PCMB样品的圆二色性和活性测定 .
1. 2. 4　 NBS修饰 MDL分子中色氨酸 ( T rp)的反应　按 Lindahl等 [6 ]的方法进行 ,用
0. 14mol /L的 NaCl溶液配制成 0. 8 mg /m l的 MDL样品 ,并用 0. 05 mo l /L pH4. 0的醋酸缓冲
液配制 NBS,浓度为 10 mmol /L ) ,反应时向 2 m l MDL中加入 N BS,每次 10μl,间隔 2 min,再
加 NBS,直至在 280 nm处吸收值不再下降 , Sephadex G-25去除过量 N BS,收集样品部分 ,检
测 MDL的凝集活性并测定圆二色性 .
1. 2. 5　圆二色性的测定　用 JASCO-500型自动记录分光偏振仪在 25℃时测定 ,蛋白质浓度
716
为 1 mg /ml ,配制的溶液在测定温度下平衡后再进行测定 ,扫描范围分 320～ 250 nm和 250～
200 nm两段进行 ,平均残基分子量取 110,光程分别为 0. 5 cm和 0. 02 cm ,灵敏度 2 m0 /cm;圆
二色谱用平均椭圆度 [θ]表示 ,单位为度 .厘米 /分摩尔 ( deg cm2 dmo l- 1 ) ,并按 Chen、 Yang的
方法计算各构象单元含量 [7 ] .
2　结果与讨论
2. 1　天然态岩豆凝集素的远紫外 CD谱显示 216 nm处的单一负峰 ,分子中含有 16. 2%的α
螺旋 , 46. 3%的 β折叠和 37. 5%的 β -转角和无规卷曲 ,是一种高 β折叠构象的凝集素 ,近紫外
CD谱呈现 282 nm左右的负峰 , 260～ 275 nm和 296 nm的负肩 ,主要由芳香氨基酸侧链残基
贡献 .经 N EM I和 PCMB修饰的 MDL,其近紫外 CD谱未变化 ,表明修饰后的 MDL侧链芳香
氨基酸残基未受影响 ,远紫外 CD谱较天然态有所变化 ,表现为负峰位置的红移和极值处的上
移 ( Fig. 1) ,表明 MDL主链构象发生变化 ,计算结果亦支持这种变化 ( Table 1) .此时 MDL活
性未发生变化 [5 ] ,说明尽管巯基修饰改变了 MDL分子的部分构象 ,但并未对活性中心造成破
坏 ,活性仍保持完整 ,经 PCMB修饰 ,可使包埋于分子内部的巯基得以全部修饰 ,弥补了 N E-
M I只能修饰分子表面的自由巯基的缺点 ,由于 NEM I、 PCMB的修饰均不改变 MDL的凝集
活性 ,故巯基与 MDL的凝集活性无关 .对于未去除过量 PCMB的 MDL而言 ,其凝集活性完
全丧失 ,远紫外 CD谱表现为典型的无规卷曲谱线 ,低于 225 nm的 CD谱由于噪声无法测出 ;
近紫外 CD谱亦无法测定 ,表明 MDL结构已遭破坏 ,呈无规线团 .由于过量 PCMB的存在 ,破
坏了 MDL分子的电荷性质 ,使维系 MDL空间结构所需的化学键断裂 ,二级结构和三级结构
解体成为松散构造 ,同时活性中心的完整构象受到破坏 ,导致活性丧失 ;侧链基团亦完全破坏 ,
使近紫外 CD谱无法测出 ,当去除 PCMB时 , M DL发生复性作用 ,结构和活性恢复 ,但较天然
态结构有一些变化 ( Table 1) ,可能是巯基修饰对主链结构有一定影响所致 ,但活性中心构象
完全恢复 ,故活性未发生改变 .
Fig. 1　 Far and near-uv CD spect ra of MDL m odi fied by various reagents
—— Native M DL, … … NEM I, - 5 mmol /L PCMB;
× -× 8 mmol /L PCMB; - D TT+ CH2ICOOH
蛋白质在变性过程中通常要经历若干个构象状态 ,对于 MDL而言 ,至少要经历两个阶
段 ,第一阶段 , MDL构象开始出现变化 ,但活性中心构象并未变化 ,活性仍保持不变 ,即构象变
717
化先于活性变化 , N EM I和未过量 PCMB对 MDL的影响即属此阶段 .第二阶段 ,当 PCMB过
量时 , M DL构象变化达到影响其活性改变的程度 ,尤其是活性中心构象变化 ,无规卷曲大量增
加 , M DL完全变性 ,丧失凝集活性 .
Table 1　 The effect of v arious reagents on seconda ry st ructure o f MDL
Native
PCMB PCM B DT T+ ICH2COO H N EM I NBS
5 mmol /L 8 mmol /L 20 mmol /L　 50 mmol /L 10 mmol /L 0. 5 mmol /L
α-Helix(% ) 16. 2 16. 3 4. 2 8. 7 15. 4 21. 3
β-Sh eet (% ) 46. 3 42. 5 8. 5 40. 2 43. 1 32. 6
Coi l and turn(% ) 37. 5 41. 2 87. 3 51. 1 41. 5 46. 1
Hemagglu tinating
　 activity(% ) 100 100 0 100 100 0
　　 MDL经 DTT修饰后 ,二硫键还原成巯基 ,用碘乙酸保护巯基 ,使之不再重新氧化成新的
二硫键 ,从而导致 MDL二聚体解聚为亚基单体 ,但 MDL仍保留完整的凝集活性 [ 6] ,说明活性
中心完整地存在于亚基上 ,亚基可独立行使功能 ,故 MDL解聚后活性仍保持 .从 CD谱看 ,
216 nm负峰红移至 225 nm ,极值显著上移 ,表明主链构象发生变化 ;近紫外 CD谱 282 nm处
负峰消失 ,而两负肩相对保持完整 ,由于 MDL分子中不存在酪氨酸 [5 ] , 282 nm负峰不可能由
酪氨酸提供 ,而随着二硫键的破坏 ,负峰消失 ,故此负峰应由二硫键提供 .计算结果表明 ,α螺
旋、β折叠均显著减小 ( Table 1) .由于亚基具有不同于二聚体的完整 CD谱 ,仍保留特定的空
间构象 ,推测活性中心的构象仍保留完整 ,故活性未受影响 ,由此可见二硫键是 MDL维持完
整构象的重要因素 ,但不是活性中心所必须的 ,活性中心并不存在二硫键 ,同时 , M DL存在链
内活性中心结构域 ,而不是亚基之间共同参与组成活性中心 ,这样才能保证解聚时亚基仍能行
使功能 .
对于由同一亚基组成的四聚体红花菜豆凝集素 ( PCL)来说 ,解聚时亚基仍保留完整的糖
结合性质 ,却完全丧失血凝集活性 ,说明其高级结构的完整是血凝活性所必需的 [ 8] . ConA亦
由相同亚基形成四聚体 ,亚基呈穹窿形 ,形成两个反平行 β折叠层 ,前层含 7个反平行 β折叠链
穿过亚基中心 ,后层含 6个反平行 β折叠链形成亚基背部 ,底部的 β-折叠链在两相邻亚基间形
成氢键 ,将两个亚基链接形成椭圆形二聚体 ,产生一个连续的 12个反平行 β折叠链 ,延伸穿过
二聚体亚基间的接触面 (界面 ) ,两个二聚体连接形成以 222位处对称的四聚体 ,通过氢键、盐
桥、疏水相互作用维持其稳定 .这种开放的四聚体包含三个独特的亚基间接触面 ( interface) ,
并和 97～ 102位肽段形成的噜璞 ( lo op)结构发生相互作用 ,对参与糖和金属离子结合的 loop
起稳定作用 [9 ] ,故高级结构对生物学活性的保持是必需的 .
而由相同亚基 Mr= 29 000组成的二聚体翅豆凝集素 ( WBAI)却不同于 ConA规则的二聚
体 ,不显示特征的连续 12个反平行 β折叠链 ,但在分子内至少有 3个 β折叠链 , WBAI仅有一个
位于 C末端的糖基化位点 (多数含糖的豆科植物凝集素糖基化位点位于 N-末端或中间 ) ,所形
成的 lo op(相应于 ConA中 72～ 102位肽段 )远离亚基间的界面 ,由于糖链的阻碍作用 ,不能形
成类似 ConA中的界面 ,而代之以手形 (伸展型 )的界面 ,使得在亚基中形成三个热不折叠
( thermal unfo lding )结构域 ,同时在 80～ 91位氨基酸间有异常独特的 5个脯氨酸 ( Pro)交替出
现序列 ,可以引起亚基上结构域的扭曲 ,这些都表明 WBAI中二级和三级结构元件在亚基界
面间的相互作用非常小 .低温下 ,两个结构域不折叠作为整体成为配体结合的第一位点 ,高温
下伴随着 WBAI二聚体解离为 2个单体 ,第 3个结构域并不发生进一步折叠而作为第二结合位
718
点参与配体结合 ,使之仍能行使生物学活性 [2, 10 ] . M DL亦由相同亚基 (Mr= 32 000)形成二聚
体 , WBAI这种独特的结构或许有助于解释 MDL解离时亚基仍保留完整血凝活性的分子基
础 ,即亚基上仍存在构象完整的结构域参与配体的结合 .但 MDL分子中是否存在类似结构 ,
仍有待于对结构的深入研究后才能阐明 .
2. 2　色氨酸经 NBS修饰后 MDL的 CD谱发生很大变化 ( Fig. 2) ,远紫外区 , 216 nm处的负
峰蓝移至 208 nm,且极值处上移 ,峰形亦发生变化 ,峰谷由钝变尖 ,在 220 nm左右出现不太明
显的负肩 ,整个 CD谱似有形成双负峰的趋势 ,而双负峰是 α螺旋构象的特征谱形 ;计算结果
表明 , M DL分子中 β折叠下降 ,变为 32. 6% ,而 α螺旋和无规卷曲相应增加 ,分别为 21. 3%和
46. 1% ,似乎和 CD谱的变化相吻合 , M DL处于α-螺旋和 β -折叠含量均较多的构象状态 .无规
卷曲的增加表明分子的结构有所松散 ,说明 Trp修饰使主链构象遭到破坏 ,近紫外 CD谱 295
nm处的负肩消失 ,其余负峰和负肩保持完整 ,表明 295 nm的负肩由色氨酸贡献 ,故随 Trp的
修饰和破坏而消失 ;同时 ,负峰位置由 282 nm红移至 287 nm且极值下移 ,说明随色氨酸的修
饰 ,影响到二硫键周围的微环境 ,使之发生变化 .
Fig. 2　 Far and near-uv CD spectra of MDL modif ied b y NB S
—— Nativ e MDL; … … M DL modi fied by NBS
N BS处理 MDL,使其凝集活性完全丧失 [ 5] ,表明色氨酸在糖结合中处于重要地位 ,这与
许多豆科植物中色氨酸的修饰结果一致 ,色氨酸可能位于糖结合区域或在其附近参与维持活
性中心的必需构象 [2 ] .在豆科植物凝集素家族中 ,色氨酸处于这族分子的保守区域 ,参与糖结
合位点的组成 ,三维结构研究表明 ,按糖结合位点位置的不同可将糖结合蛋白分为两类:一类
将它们的糖配体完全包埋在分子内深的结合口袋中 ,如细菌的外周胞质结合蛋白和一些酶 ;另
一类的结合位点位于分子表面的浅袋或沟槽中 ,许多植物凝集素即属此类 [11 ] . Yamamo tu等
从羊蹄甲凝集素 ( BPA)中分离得到的具糖结合活性的九肽片段中含有两个色氨酸 ,研究表明 ,
BPA中糖结合部位的立体结构不是很紧密 ,致使其中的两个色氨酸残基位于亲水环境中 [3, 12 ] .
类似的结构存在于许多由相同或不同亚基组成的豆科植物凝集素中 ,如 ConA, WBAI,西非单
叶豆同功凝集素Ⅳ ( GS-Ⅳ ) ,利马豆凝集素 ( LBA) ,大豆凝集素 ( SBA) ,豌豆凝集素 PSA等
中 .且通常位于暴露在蛋白质分子表面的环状结构上 ,具有形成广泛的 β-折叠结构的趋向 [1 ] .
719
由于 MDL在 4 mo l /L的脲中完全失活 ,即使去除脲后也不能恢复 ,故在色氨酸修饰中未按常
规方法用脲预先处理 MDL,使之结构松散 ,以便埋藏于分子内部的色氨酸暴露而得以修饰 ,而
是用 N BS直接修饰位于分子表面的色氨酸 ,结果 MDL完全丧失凝集活性 ,说明色氨酸参与
形成的糖结合区域位于 MDL分子表面的沟或浅袋 ;随着分子表面色氨酸的修饰 , 295 nm负
肩消失 ,显示 4个色氨酸分子 [5 ]均位于 MDL分子的表面 ,不存在包埋在分子内的色氨酸 ,这也
说明 MDL的糖结合区域位于分子表面 .从 CD谱的变化和各构象单元组成的变化可知色氨
酸在维持 MDL构象完整 ,尤其是 β-折叠构象中的作用 ,β折叠的减少导致 MDL凝集活性的
丧失说明 MDL活性中心所必需的构象以 β -折叠为主 .而对于红花菜豆凝集素 PCL和翅豆凝
集素 WBAI色氨酸的修饰并不改变其二级结构 ,仅涉及到色氨酸分子周围微环境的变化 [2, 8 ] ,
M DL中色氨酸在维持构象中的作用显然比 PCL和 WBAI中的更加重要 ,尽管色氨酸都是他
们保持活性所必需的 ,至于 MDL分子究竟是否存在和其它许多豆科植物凝集素类似的糖结
合区域 ,哪些色氨酸与糖结合相关以及它们是如何维持活性区域构象等问题 ,有待于更深入的
研究工作加以阐明 .
References
1　孙建忠 ,王克夷 .植物凝集素的超级家庭 .生物化学与生物物理进展 ( Su ng Jian-Zh ong, Wang Ke-Yi. Super family of
ph ytoh emagglutinins. Prog B iochem B iophys) , 1994, 21( 2): 104～ 108
2　 Kamal D P, Avadh esh a S. Amino acid sequence of th e Winged b ean ( Psophocarpus tet ragonolobus ) basic lect in. J B iol
Chem, 1994, 269( 49): 30917～ 30926
3　 Yamam otu K, Konami Y. Pu rif icat ion and characteri zation of a carboh yd rate-binding pep tide f rom Bauhinia Purpu re
lectin. FEB S Lett , 1991, 281( 52): 258～ 262
4　曾仲奎 ,郑健 ,刘荣华 .岩豆凝集素的纯化及性质研究 .生物化学杂志 ( Zeng Zh ong-Kui, Zh en Jian, Liu Rong-Hua. Purif i-
cation and characterization of Millett ia diel siana Harms lectin. Chin Biochem J ) , 1992, 8( 1): 93～ 98
5　鲍锦库 ,周红 ,曾仲奎 ,杨莉 .岩豆凝集素的纯化及其分子残基的化学修饰和活性关系 .应用与环境生物学报 ( Bao Jin-
Ku, Zh ou Hong, Zeng Zh ong -Kui , Yang Li. Stud y on the relation betw een residu e modi fication and biological activi ty of
Millet tia dielsiana Harm s. lect in.Ch in J App l Environ Biol ) , 1996, 2( 3): 214～ 219
6　 Lindah l P. Alriks son E, Jornvall H, Bjork I. Interaction of the cys teine proteinas e inhibiter and chicken cys tat in. B io-
chemist ry, 1988, 27: 5074～ 5082
7　 Chen Y H, Yang J T, Chau K H. Determination of the helix and β f orm of proteins in aqueous solu tion by ci rcular dich ro-
ism. Biochemist ry, 1974, 13( 6) , 3350～ 3359
8　施炜星 ,孙册 .红花菜豆凝集素分子的色氨酸残基修饰与其活性的关系 .生物化学杂志 ( Shi Wei-Xing, Sun Ce. Tryp to-
phan-modif ied phaseolus coccineus Var. rubonanous lectin in relation to i ts activi ty. Chin B ioch em J ) , 1997, 13( 4): 438～
443
9　 Derw enda Z, Yariv J, Hel liw el l J R, Kalb A J, Dodson E J. Th e st ructure of th e sacch aride-binding site of concanavalin
A. EMBO J , 1989, 8( 8): 2189～ 2193
10　 Schwar z F P, Pu ri K D, Surolia A. Thermodynamics of th e binding of galactopy ranosid e derivativ es to basic lectin f rom
winged bean (Psophocarpus tetrogonolobus) . J Biol Chem , 1991, 166( 36): 24344～ 24350
11　V yas N K. Atomic featu re of protein-carbohydrate interactions ,Curr Op in S truct Biol , 1991, 1: 732～ 740
12　王克夷 ,王三山 ,梁卫平 .凝集素中活性肽段的构象预测和比较 .生物化学与生物物理学报 ( Wang Ke-Yi , Wan San-
Shan, Liang Wei-Ping. Conformation p redication and compari son of activ e peptid es f rom lectins. Acta Biochim B iop hys
Sin ) , 1993, 25( 2): 201～ 205
720