全 文 ： 收稿日期：2004-10-10
基金项目：深圳市科技局资助项目（98001）和国家自然科学基金项目（30060038）资助
作者简介：马永（1974-），男，安徽亳州人，硕士研究生，主要从事濒危植物多样性保育研究。
注：李楠为通讯作者。

叉孢苏铁 ISSR 反应条件的优化及初步应用
马 永 1,2 , 李 楠 1, 钟业聪 3, 陆照甫 4，林鉴钊 2，蒋 明 1，林平义 1，罗 斌 1
（1.深圳市仙湖植物园管理处，广东 深圳 5180004；2.广西大学 农学院，广西 南宁 530005；3.广西林业勘测设计院，
广西 南宁 530011；4.广西百色林业局，广西 百色 533000）

摘 要：利用 ISSR 技术对叉孢苏铁（Cycas segmentifida）遗传多样性进行研究，对影响 PCR 反应的 DNA 模
板浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量、引物浓度、Mg2+浓度和退火温度等进行了条件优化。叉孢苏铁的 ISSR 最
佳反应扩增体系为：20μl 反应体积 2μl 10 × PCR buffer，模板 DNA 20ng，1UTaq 酶，1.5～2.75mmol/L MgCl2，
0.1mmol/L 4 × dNTP，0.22μmol/L 引物，2%甲酰胺。适宜的退火温度为 50～52℃。从 103 条引物中筛选出
12 条用于所有样品的扩增，共扩增出 122 条带，其中多态性条带为 86 条，占总条带数的 70.49%。POPGENE
分析结果表明，种级水平上，叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平，且各居群间有着很高的遗传分化度。
关键词: 叉孢苏铁；ISSR；条件优化；初步应用
中图分类号：Q943.2; Q949.62 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2005)01-0010-04
Optimization and Preliminary Application of ISSR-PCR Amplification for
Cycas segmentifida
MA Yong1,2, LI Nan1, ZHONG Ye-cong3, LU Zhao-fu4, LIN Jian-zhao 2, JIANG Ming1, LIN Ping-yi1, LUO Bin1
(1.Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden, Shenzhen 518004, Guangdong China；2.Agricultural College, Guangxi University,
Nanning 530005, Guangxi China; 3.Guangxi Academy of Forest Exploration, Nanning 530011, Guangxi China; 4.Baise
Forestry Bureau of Guangxi, Baise 533000, Guangxi China)

Abstract: Cycas segmentifida genomic DNA, extracted from its leaves by CTAB method, was used
as ISSR-PCR amplification template. By adjusting the influencing factors of ISSR, such as template
DNA concentration, dNTP concentration, Taq polymerase content, primer concentration, Mg2+
concentration and annealing temperature, the PCR amplication conditions were optimized. The
optimal experiment conditions were as follows: PCR reaction volume of 20µl contained 2µl 10 ×
PCR buffer, 20ng template DNA, 1U Taq polymerase, 1.5～2.75mmol/L MgCl2, 0.1mmol/L 4 ×
dNTP, 0.22µmol/L primer and 2% formamide; proper annealing temperature was 50～52 . 12 ℃
primers, which could produce more reproducible and polymorphic bands, were used to amplify all of
the samples，and 122 DNA bands were generated, of which 86(70.49%) were polymorphic.
POPGENE analysis indicated that moderate or slightly high levels of genetic diversity existed at
species level, and the value of gene diversity coefficient(Gst) among populations was very high.
Key words: Cycas segmentifida; ISSR; optimization; preliminary application

自 Zietkiewicz 等[1]首次提出锚定 SSR 策略后，因其可操作性、可重复性、稳定性均优于 RAPD，
且具有较高的多态性水平和信息容量大的优点[2-4]，因而得到较快发展。目前 ISSR 分子标记已广泛应
用于经济作物的品种鉴定和种质资源分析、居群生物学及遗传多样性的研究[5-12]。在苏铁类植物中应用

2005,34(1):10-13.
Subtropical Plant Science
第 1 期 马永,等：叉孢苏铁 ISSR 反应条件的优化及初步应用

﹒11﹒
ISSR 研究居群遗传变异方面也有报道[13,14]。
运用 ISSR 标记技术时，由于不同物种对引物要求不同，且不同引物所要求的反应条件也不同，因
此，对引物的筛选和条件优化显得非常重要。本文以野生叉孢苏铁（Cycas segmentifida）DNA 为模板，
筛选出了多态性高和可重复性的引物，并建立了 ISSR 反应的最佳体系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
采自广西壮族自治区 7 个县市的野生叉孢苏铁叶片，置于变色硅胶中干燥保存。选取 5 个居群，
每个居群取 2 个个体，共 10 个个体的基因组 DNA 作为模板，筛选具有多态性的引物。采取改进后的
CTAB 法[15]提取总 DNA。103 条引物中，有 100 条来自哥伦比亚大学，3 条自行设计。
1.2 PCR 反应及电泳
本实验采用的 ISSR-PCR 反应程序如下：95℃ 3min，然后进行 35 个循环：94℃ 30s，48～54℃（不
定）45s，72℃ 1.5min，最后 72℃再延伸 7min。4℃终止反应。
Taq 酶选用大连宝生物产品。PCR 扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，以大连宝生物公司
100bp DNA ladder (100～1500bp)为标准分子量；溴化乙锭染色显带。用 Gene Genius 公司的 Bio Imaging
System 观察、记录。以 808、836 两个较为通用的引物为代表，对 DNA 模板浓度、Mg2＋浓度、dNTP
和 Taq 酶含量、退火温度、可重复性等进行了交叉实验，对 PCR 反应体系进行优化。以 103 条 ISSR
引物进行筛选并进行可重复性实验，筛选出能扩增出清晰、可重复、多态性高的引物，用于正式扩增。
2 结果与分析
2.1 DNA 模板浓度的优化
在一定范围内，PCR 产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性
增加。本实验在 5～100ng/μl 之间设置了 5、10、20、50、100(ng/μl) 5 个浓度梯度，参照前人[13,14]的
ISSR-PCR 反应，暂时确定本实验中各成分的含量为 Primer 0.22μmol/L，Taq 1 U，dNTP 0.1mmol/L，
Mg2+2.5mmol/L，退火温度 50℃，用引物 808 和 836 进行扩增实验。结果发现，叉孢苏铁 ISSR 反应对
DNA 模板浓度的许可范围较大。5ng/μl 的模板浓度扩出的带较少，带型模糊。10～50ng/μl 的模板浓
度扩增出了较清晰、带型基本相同的图谱，100ng/μl 的模板浓度扩出的带型很不稳定。
2.2 dNTP 浓度的影响
高浓度的 dNTP 易产生错误碱基的渗入，浓度过低会降低反应产量，甚至会因 dNTP 过早的消耗
而使产物单链化，影响扩增效果。dNTP 浓度取决于扩增片段的长度。浓度一般为 0.05～0.2mmol/L[16]。
本研究设置了 0.1、0.15、0.2mmol/L 3 个浓度梯度，结果表明，0.1mmol/L 和 0.15mmol/L 的 dNTP 浓度
均有扩增产物，且扩增带型基本一致。为防止高浓度的 dNTP 而导致的高错误碱基掺入率，我们认为
使用 0.1mmol/L 这一浓度最佳。
2.3 Taq 酶含量的影响
Taq 酶浓度是影响 PCR 反应的重要因素。增加 Taq 酶量会导致反应特异性下降，且成本提高，造
成浪费。若酶量过低则会导致合成速率下降。50μl PCR 反应体系中 Taq 酶的用量为 0.5～2.5U[16]。本
实验设置了 0.5U、1U、1.5U、2U 4 个 Taq 酶含量梯度。结果表明，0.5U Taq 酶含量扩增的条带较弱，
且很不稳定；2U Taq 酶含量反应的非特异性扩增增强；1U、1.5U 两个梯度条带清晰，也都具有很高的
稳定性。因此，我们在正式实验中选用了 1U 这一酶含量。
2.4 引物浓度的影响
引物浓度过高会引起模板与引物的错配，PCR 反应特异性下降，且形成引物二聚体的几率增大；
引物浓度过低则不能扩增。引物浓度一般为 0.1～0.5μmol/L。本实验设置了 0.1，0.22，0.3，0.5μmol/L
第 34 卷

﹒12﹒
4 个浓度梯度，结果表明，0.1μmol/L 浓度几乎未扩增，0.22、0.3、0.5μmol/L 3 个梯度都有扩增产物，
但 0.5μmol/L 浓度在不同的反应中稳定性较差，并有引物二聚体出现；0.22 和 0.3μmol/L 两个梯度都
有扩增，但相比之下 0.22μmol/L 稳定性更高，故我们采用 0.22μmol/L 引物浓度。
2.5 Mg2+浓度和退火温度的综合影响
Mg2+浓度和退火温度明显地影响扩增带的式样，是 PCR 反应中最为重要的影响因子。不同的物种
具有不同的特性，对反应体系中的 Mg2+浓度要求各不相同。不同的引物对 Mg2+浓度要求也各不相同。
在其它影响因子确定的情况下，本实验把 Mg2+浓度和退火温度两个影响因子结合起来进行优化。退火
温度设置 48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、54℃ 6 个梯度，Mg2+浓度为 1.5、2.0、2.5、2.635、2.75、
3mmol/L 6 个浓度梯度，然后对不同的引
物进行交叉实验，最后确定不同引物各自
最佳的 Mg2+浓度和退火温度（表 1）。
2.6 ISSR 优化结果
通过以上优化实验，确定了 20μl 的
反应体系成分为：2μl 10 × PCR buffer，
模板 DNA 20ng，1U Taq 酶，1.5～2.75
mmol/L MgCl2，0.1mmol/L 4 × dNTP，0.22
μmol/L 引物，2%甲酰胺。从 103 条引物
中筛选出 12 条位点清晰、稳定性高的引
物（表 1）用于叉孢苏铁的正式 ISSR 扩增。
2.7 在野生叉孢苏铁遗传多样性研究中的
初步应用
根据优化后的反应体系，对叉孢苏铁
10 个野生居群的所有样品进行了正式扩
增。图 1 是引物 808 对田阳县坡洪居群的
ISSR 扩增带型。运用 POPGENE1.31 对叉
孢苏铁的群体遗传分析表明，122 条带中
有 86 条是多态性的，多态性比率为
70.49%；物种平均期望杂合度（He）和观
察杂合度（Ho）分别为 0.2086 和 0.3190（表
2）；居群之间的 Nei 基因分化系数（Gst）
为 0.6427。本实验结果表明，叉孢苏铁种
级水平的遗传多样性水平中等偏高，且各
居群之间有着较强的遗传分化。
3 讨 论
特异性、有效性和忠实性是检验 PCR
扩增效率的三个指标。这三个指标的影响
因素很多，如模板、引物、及 dNTP 用量、
镁离子浓度、退火温度等，所以要优化 PCR
反应的各种条件，以便得到较好的可重复
性实验结果。
不同的物种具有不同的特性，对反应
体系中 Mg2+浓度要求各不相同，同时不同
表 1 ISSR 引物序列及最佳条件
编号 序列(5’-3’)1） 退火温度 ( )℃
Mg2+浓度
(mmol/L)
59913 TGGCCTCTCTCTCTCTC 52 1.5
59931 CACACACACACACACAAT 52 1.5
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 50 2.75
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 52 1.5
809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 52 2.5
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 51 1.5
818 CACACACACACACACAG 52 1.5
835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 52 2.75
836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52 2.75
840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 51 2.75
842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 52 1.5
857 ACACACACACACACACYG 52 2.5
注：1）Y＝（C/T）
表 2 叉孢苏铁各居群 ISSR 分析结果
居 群 PPB(%) He Ho
田东步兵 17.21 0.0657(0.1523) 0.0968(0.2203)
田东印茶 14.75 0.0593(0.1493) 0.0864(0.2139)
田林福达 15.57 0.0546(0.1388) 0.0817(0.2013)
田林洞弄 17.21 0.0695(0.1588) 0.1012(0.2281)
德保关东 10.66 0.0412(0.1237) 0.0608(0.1800)
百色阳圩 26.23 0.0868(0.1678) 0.1303(0.2410)
西林足别 16.39 0.0590(0.1415) 0.0883(0.2071)
西林八达 24.59 0.0962(0.1778) 0.1409(0.2563)
隆林扁牙 14.75 0.0584(0.1458) 0.0856(0.2110)
田阳坡洪 30.33 0.1238(0.1964) 0.1799(0.2809)
mean 18.77 0.0715(0.1552) 0.1052(0.2240)
Species 70.49 0.2086(0.1913) 0.3190(0.2690)
图 1 引物 808 对广西田阳县坡洪居群 11 个个体
扩增的 ISSR 产物图谱
第 1 期 马永,等：叉孢苏铁 ISSR 反应条件的优化及初步应用

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的引物对 Mg2+浓度要求也不同，推荐的 PCR 反应中 Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L[16,17]，但本实验中引
物807、835、836、840扩增时Mg2+的最佳浓度为2.75mmol/L，引物809和857Mg2+最佳浓度为2.5mmol/L。
李海生等[18]对海南海桑（Sonneratia hainanensis）的研究，Mg2+浓度达到了 3.0 mmol/L。可见不同的物
种、不同的引物进行 PCR 反应时对 Mg2+浓度的要求是不同的。
同一引物对不同的物种，PCR 反应退火温度亦有所不同[19,20]。李海生等[18,21]应用 ISSR 技术检测海
南海桑（Sonneratia hainanensis）和卵叶海桑（sonneratia ovata）遗传多样性时引物 808 和引物 809 的
退火温度分别是 53.5℃和 52℃；余艳等[20]在应用 ISSR 检测沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）时，
引物 808 和 809 采用的退火温度分别为 50℃和 48℃；而我们在叉孢苏铁的 ISSR 实验中，引物 808 和
809 采用的退火温度都是 52℃。一般来说，在 Tm 允许的范围内，尽量选择较高的退火温度，这样可
以减少引物和模板之间的非特异性结合，提高 PCR 的特异性。
总之，ISSR 实验受到诸多因素的影响，这就要求我们在实验中要综合考虑多因素的影响，同时通
过反复实验来寻求最佳反应体系成分和 PCR 扩增条件。
致 谢：本试验得到深圳仙湖植物园张寿洲博士和华南农业大学庄雪影教授的指导和帮助，在此一并
致谢！
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