全 文 ：第 31卷第 2期　　　　　　　　 　西 南 大 学 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2009年2月
Vol.31　No.2 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Feb.　2009
文章编号:1673-9868(2009)02-0089-05
秋水仙素对烟草单倍体
幼苗加倍及成苗效应研究＊
刘仁祥1 , 　黄　莺1 , 　蒋光华2 , 　杨双剑2 , 　黄　宁3 , 　张卫兵1
1.贵州大学 农学院 , 贵阳 550025;2.贵州省烟草公司 , 贵阳 550001;
3.贵阳市烟草公司 , 贵阳 550001
摘要:以 2片真叶期的烟草单倍体幼苗为材料 , 采用二次饱和 D-最优设计 , 研究了秋水仙素浓度及其浸苗处理时
间对染色体加倍率及成苗的影响.结果表明:秋水仙素浓度 、 浸苗时间对加倍率 、成苗数和双单倍体植株数的影响
不一致;0.346 9%的秋水仙素 、浸苗 72 h 处理的加倍率达到最高值 54.18%;0.387 8%的秋水仙素 、 浸苗 24 h 的
成苗数最多 , 达 92.88 株;0.311 5%的秋水仙素 、浸苗 49.7 h 的双单倍体植株数最多 , 达 37.06 株.研究得出以获
得最多的双单倍体系数量为研究目的时 , 采用 0.311 5%的秋水仙素 、浸苗 49.7 h 较为适宜.
关　键　词:烟草;单倍体;秋水仙素;染色体加倍;成苗
中图分类号:S572 文献标识码:A
单倍体植株经染色体加倍 , 即可得到基因位点完全纯合的双单倍体(DH 群体).DH 群体内基因纯合 ,
群体内不分离 , 群体间存在遗传多样性[ 1-2] , 是进行新品种选育以及现代遗传学 、分子生物学等基础研究
的有效工具.
DH 群体建立是单倍体育种关键技术 , 包括单倍体的诱导和染色体加倍.烟草单倍体诱导途径是胚状
体途径 , 其自然加倍频率很低[ 3] , 花药培养产生的植株基本上都是单倍体 , 主要通过人工加倍.染色体加
倍的方法主要有浸花药法[ 4] 、浸苗法[ 5] 、胚状体处理法[ 6] , 其加倍效率一般在 20%～ 50%之间 , 且很不稳
定 , 以前的研究者在进行加倍方法和处理技术的筛选时均以加倍率高低为标准[ 3-8] .笔者在多年的烟草单
倍体育种研究中 , 发现由于幼苗存活率高低的影响 , 加倍率与双单倍体植株数并不是简单的正比关系.从
而就秋水仙素浓度 、浸苗时间对烟草单倍体幼苗的加倍及成苗效应进行探讨 , 以构建加倍率高而稳定 、双
单倍体系多的烟草单倍体育种染色体加倍体系.
1　材料与方法
1.1　供试材料
(k326×中烟 90)×(Corker176×红大)组合的 F1 , 现蕾期取二核早期的花药 , 用 75%的酒精灭菌
0.5 min , 0.1%的升汞消毒8 min , 无菌水冲洗 5次后接种在 H 培养基上 , 置光照 1 800 ～ 2 000 lux 、12 h 、
温度(26±1)℃的人工日光管照明培养室培养 , 待多数幼苗长至 2片真叶时 , 选择每管出苗数相近的若干
试管随机分组进行加倍处理.
1.2　药　　品
秋水仙素由上海生化试剂站进口分装.
＊收稿日期:2008-03-23
基金项目:贵州省“十一五”重大专项资助项目([ 2006] 6026);贵州省烟草公司资助项目(2006-03).
作者简介:刘仁祥(1971-), 男 , 贵州眉潭人 , 副教授 , 主要从事烟草育种和植物组织培养研究.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2009.02.014
1.3　试验设计方案
本研究设置秋水仙素浓度 、浸苗时间二因素二次饱和 D-最优设计 , 共 6个处理(表 1).
各处理按表 1中秋水仙素浓度 、浸苗时间进行处理 , 每试管药液量以淹完小苗为准 , 处理期间置于温
度(26±1)℃的黑暗条件下 , 处理完成后倒掉秋水仙素液 , 用无菌水冲洗 4次 , 分处理取出幼苗 , 选择处于
2片真叶期的幼苗 300株(包括已萎焉幼苗), 剪去基部 , 转接至添加 0.1%NAA的 H 培养基上 , 随机分成
3组 , 幼苗生根后 , 移栽至育苗盘待鉴定其倍数性.
1.4　鉴定项目及方法
幼苗移栽育苗盘前分处理 、重复统计生根幼苗数 , 计为成苗数;幼苗移栽大田前用气孔保卫细胞叶绿
体计数法鉴定其倍数性[ 9] , 然后全部移栽至大田 , 以开花结实情况结合苗期鉴定统计双单倍体植株数 , 以
双单倍体植株数除以成苗数计为加倍率.
表 1　二因素二次饱和 D-最优设计方案
序号 各因素编码值/ Z秋水仙素浓度/ Z 1 浸苗时间/Z 2
各因素实际处理水平/ X
秋水仙素浓度 X 1/ % 浸苗时间 X 2/h
1 -1 -1 0.1 24
2 1 -1 0.4 24
3 -1 1 0.1 72
4 -0.131 5 -0.131 5 0.23 45
5 0.394 4 1 0.31 72
6 1 0.394 4 0.4 58
2　结果与分析
2.1　秋水仙素浓度 、浸苗时间处理对加倍率的影响
由不同处理的加倍率及其差异显著性分析结果(表 2)看出 , 处理 5的加倍率最高 , 达 53.44%, 处理 1
最低 , 为 30.25%, 处理间差异显著或极显著.结果表明秋水仙素浓度 、浸苗时间对加倍率有影响.
表 2　各处理加倍率比较
序号 加倍率/ %Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均
差异显著性
0.05 0.01
1 29.89 29.67 31.18 30.25 e D
2 35.56 33.33 32.58 33.82 d CD
3 38.10 38.46 34.38 36.98 d C
4 41.98 42.86 46.43 43.75 c B
5 52.54 52.38 55.38 53.44 a A
6 44.74 48.57 50.00 47.77 b B
图 1　秋水仙素浓度 、浸苗时间与加倍率关系图
　　根据表 2中各处理平均值建立加倍率与秋水仙素
浓度 、浸苗时间的回归方程:Y =45.03+5.02Z 1 +
6.50Z2 -6.36Z 1 2 +3.20Z1 ·Z2 , 回归方程和回归系
数显著性检验的结果表明该方程是加倍率与秋水仙
素浓度 、浸苗时间的最优回归方程 , 说明此回归方
程式能反映秋水仙素浓度 、浸苗时间与加倍率的真
实关系.
对回归方程中的秋水仙素浓度(Z1)、浸苗时间
(Z 2)分别取 0水平 , 即可分别得到加倍率随浸苗时
间 、秋水仙素浓度(Z 1)变化的单因素效应方程 , 据
之可做出秋水仙素浓度(浸苗时间)为 0水平时 , 不
同浸苗时间(秋水仙素浓度)对加倍率的单因子效应图(图 1).
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由加倍率回归方程和图 1可知 , 浸苗时间无二次项 , 而其一次项系数最大 , 说明在本试验取值范围内 ,
加倍率与浸苗时间呈线性关系 , 即随浸苗时间的延长 , 加倍率提高 , 且浸苗时间对加倍率的影响最大;秋
水仙素浓度的二次项系数次之 , 与浸苗时间一次项系数接近 , 说明秋水仙素浓度发生变化时对加倍率变化
的影响也大 , 由于其符号为负 , 说明随着秋水仙素浓度的提高 , 加倍率呈现开口向下的抛物线曲线变化趋
势;秋水仙素浓度 、浸苗时间二因素的交互项系数不为 0 , 说明二者交互作用对加倍率有影响 , 最高加倍率
的秋水仙素浓度 、浸苗时间组合并不是二者单因素最佳处理的简单组合.
对回归方程分别就秋水仙素浓度(X 1)、浸苗时间(X2)取偏导数 , 并令之为零 , 可得到当秋水仙素浓度
X 1 =0.3469%、浸苗时间 X 2 =72 h 时 , 加倍率达到最高值 54.18%.即就加倍率而言 , 0.346 9%的秋水仙
素浓度 、浸苗 72 h 是烟草单倍体幼苗染色体加倍的最佳处理组合.
2.2　秋水仙素浓度 、浸苗时间处理对成苗数的影响
由不同处理的成苗数及其差异显著性分析结果(表 3)看出 , 处理 2的加倍效率最高 , 平均达 92.67株;
处理 5最低 , 平均为 62.33株.处理间差异显著.结果表明秋水仙素浓度 、浸苗时间对成苗数有影响.
表 3　各处理成苗数比较
序号 成苗数/株Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均
差异显著性
0.05 0.01
1 87 91 93 90.33 a AB
2 90 99 89 92.67 a A
3 63 65 64 64.00 d D
4 81 84 84 83.00 b B
5 59 63 65 62.33 d D
6 76 70 74 73.33 c C
　　根据表 3中各处理平均值建立成苗数与秋水仙素浓度 、浸苗时间的回归方程:Y =81.03-14.55Z 2 -
0.74 Z 1 2 -3.33Z2 2 -1.35Z 1 ·Z2 , 回归方程和回归系数显著性检验的结果表明该回归方程是成苗数与秋
水仙素浓度 、浸苗时间的最优回归方程 , 说明此回归方程式能反映秋水仙素浓度 、浸苗时间与成苗数的真
实关系.
图 2　秋水仙素浓度 、浸苗时间与成苗数关系图
对回归方程中的秋水仙素浓度(Z1)、浸苗时间
(Z 2)分别取 0水平 , 即可分别得到成苗数随浸苗时
间 、秋水仙素浓度(Z 1)变化的单因素效应方程 , 据
之可做出秋水仙素浓度(浸苗时间)为 0水平时 , 不
同浸苗时间(秋水仙素浓度)对成苗数的单因子效应
图(图 2).
由回归方程和图 2可知 , 浸苗时间一次项系数最
大 , 二次项系数也较大 , 且符号为负 , 说明本试验处
理范围内 , 浸苗时间对成苗数的影响最大 , 随着浸苗
时间的延长 , 成苗数总体呈现开口向下的曲线变化趋
势 , 但其直线下降的趋势明显强于曲线变化趋势 , 即
先平缓下降 , 然后急剧下降;秋水仙素浓度 、浸苗时间二因素的交互项系数次之 , 说明二者交互作用对成
苗数也有较大影响 , 最高成苗数的秋水仙素浓度 、浸苗时间组合并不是二者单因素最佳处理的简单组合;
秋水仙素浓度无一次项 , 二次项系数又很小 , 且符号为负 , 说明秋水仙素浓度对成苗数的影响很小 , 其开
口向下的关系曲线近似平行 X轴的直线 , 说明秋水仙素浓度对成苗数几乎没有影响.
对回归方程分别就秋水仙素浓度(X 1)、浸苗时间(X2)取偏导数 , 并令之为零 , 可得到当秋水仙素浓度
X 1 =0.387 8%、浸苗时间 X2 =24 h时 , 成苗数达到最高值 92.88株.即就成苗数而言 , 0.387 8%的秋水
仙素浓度 、浸苗 24 h是烟草单倍体幼苗染色体加倍的最佳处理组合.
2.3　秋水仙素浓度 、浸苗时间处理对双单倍体植株数的影响
由不同处理的双单倍体植株数及其差异显著性分析结果(表 4)看出 , 处理 4的双单倍体植株数最高 ,
91第 2期　　　　　 　刘仁祥 , 等:秋水仙素对烟草单倍体幼苗加倍及成苗效应研究
平均为 36.33株;处理 3最低 , 平均为 23.67株.处理间差异显著.结果表明秋水仙素浓度 、浸苗时间对双
单倍体植株数有影响.
表 4　各处理双单倍体植株数比较
序号 双单倍体植株数/株Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均
差异显著性
0.05 0.01
1 26 27 29 27.33 c BC
2 32 33 29 31.33 b AB
3 24 25 22 23.67 d C
4 34 36 39 36.33 a A
5 31 33 36 33.33 ab A
6 34 34 37 35.00 ab A
　　根据表 4 中各处理平均值建立成苗数与秋水仙素浓度 、浸苗时间的回归方程:Y =36.41+3.18Z1 -
3.99Z1 2 -3.69Z 2 2 +1.28Z1 ·Z 2 , 回归方程和回归系数显著性检验的结果表明该回归方程是双单倍体植株
数与秋水仙素浓度 、浸苗时间的最优回归方程 , 说明此回归方程式能反映秋水仙素浓度 、浸苗时间与双单
倍体植株数的真实关系.
图 3　秋水仙素浓度 、浸苗时间与双单倍体植株数关系图
对回归方程中的秋水仙素浓度(Z 1)、浸苗时间
(Z 2)分别取 0水平 , 即可分别得到双单倍体植株数随
浸苗时间 、秋水仙素浓度(Z 1)变化的单因素效应方
程 , 据之可做出秋水仙素浓度(浸苗时间)为 0 水平
时 , 不同浸苗时间(秋水仙素浓度)对双单倍体植株数
的单因子效应图(图 3).
由回归方程和图 3可知 , 秋水仙素浓度二次项系
数最大 , 且符号为负 , 一次项系数也较大 , 说明秋水
仙素浓度对双单倍体植株数的影响最大 , 随着秋水仙
素浓度的提高 , 双单倍体植株数呈现开口向下的抛物
线变化趋势;浸苗时间二次项系数次之 , 且符号为
负 , 说明浸苗时间对双单倍体植株数的影响也较大 , 随着浸苗时间的延长 , 双单倍体植株数呈现开口向下
的抛物线变化趋势;秋水仙素浓度 、浸苗时间二因素的交互项系数不为 0 , 说明二者交互作用对成苗数也
有较大影响 , 最高成苗数的秋水仙素浓度 、浸苗时间组合并不是二者单因素最佳处理的简单组合.结果表
明双单倍体植株数最高值将出现在本试验设定的处理范围内.
对回归方程分别就秋水仙素浓度(X 1)、浸苗时间(X2)取偏导数 , 并令之为零 , 可得到当秋水仙素浓度
X 1 =0.311 5%、浸苗时间 X 2 =49.7 h时 , 双单倍体植株数达到最高值 37.06株.即就获得的双单倍体植
株数而言 , 0.311 5%的秋水仙素浓度 、浸苗 49.7 h是烟草单倍体幼苗染色体加倍的最佳处理组合.
3　结　　论
1)秋水仙素浓度 、浸苗时间对烟草单倍体幼苗染色体的加倍率 、成苗数 、双单倍体植株数有影响.
2)浸苗时间大于秋水仙素浓度对加倍率的影响.加倍率与浸苗时间呈线性关系 , 即随着浸苗时间的延
长 , 加倍率提高.加倍率与秋水仙素浓度呈现开口向下的抛物线关系 , 即随着秋水仙素浓度的增加 , 加倍
率先升后降.0.346 9%的秋水仙素浓度 、浸苗 72 h是加倍率的最佳处理组合 , 加倍率达 54.18%.
3)浸苗时间大于秋水仙素浓度对成苗数的影响.成苗数与浸苗时间呈总体下降的曲线关系 , 即随着浸
苗时间的延长 , 成苗数先平缓下降 , 随后急剧下降.秋水仙素浓度对成苗数几乎没有影响.就成苗数而言 ,
0.387 8%的秋水仙素浓度 、浸苗 24 h是烟草单倍体幼苗染色体加倍的最佳处理组合 , 达 92.88株.
4)秋水仙素浓度大于浸苗时间对双单倍体植株数的影响.双单倍体植株数与秋水仙素浓度 、浸苗时间
呈现开口向下的抛物线关系 , 即随着秋水仙素浓度 、浸苗时间的提高和延长 , 双单倍体植株数先升后降.
0.311 5%的秋水仙素浓度 、浸苗 49.7 h是双单倍体植株数最佳的处理组合 , 达 37.06株.
92 西南大学学报(自然科学版)　　　　　投稿网址 http://xbg jx t.sw u.cn　　　　　第 31卷
5)随浸苗时间的延长 , 加倍率提高 , 但由于多数幼苗发生萎焉 , 转接成活率低 , 导致成苗数急剧减少 ,
最终实际获得的双单倍体系的数量反而减少.因此 , 在进行烟草单倍体幼苗染色体加倍研究中 , 以获得最
多双单倍体系数量为目的时 , 采用 0.311 5%的秋水仙素浓度 、浸苗 49.7 h 较为适宜.
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Effects of Colchicine Concentration and Seedling
Soaking Time on Chromosome Doubling and
Seedling Survival of Tobacco Haploid Plants
LIU Ren-xiang1 , 　HUANG 　Ying1 , 　JIANG Guang-hua2 ,
YANG Shuang-jian2 , 　H UANG　Ning3 , 　ZHANG Wei-bing1
1.College of Agricul tural , Guizhou Universi ty , Guiyang 550025 , China;
2.Guizhou Province Tobacco Company , Guiyang 550001 , China;
3.Guiyang Ci ty Tobacco Company , Guiyang 550001 , China
Abstract:In an experiment w ith quadrat ic saturated D-opt imal design , to bacco haploid seedling s w ith tw o
real leaves w ere so aked w i th colchicines at di fferent concentrations for different time duration to study the
ef fects o f the treatments on chromosome doubling and seedling survival.Colchicine treatment at the con-
centration of 0.346 9% fo r 72 h gave the highest doubling rate (54.18%);concentration of 0.387 8% fo r
24 h had the highest seedling survival rate (92.88 plants)and concentration of 0.311 5% for 49.7 h
achieved the greatest number o f doubled haploid plants (37.06 plants).Therefo re , in the w o rk to obtain
doubled haploid plants of tobacco , co lchicine t reatment at 0.311 5% fo r 49.7 h is recommended.
Key words:tobacco ;haploid;co lchicines;chromosome doubling ;seedling surviv al
责任编辑　夏　娟　　　　
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