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甜杨PsG6PDH基因超表达对提高烟草抗寒冻性的影响



全 文 :第 38 卷 第 3 期
2010 年 3 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.) Vo l.38 No.3Mar.2010
甜杨 PsG6PDH基因超表达对提高烟草
抗寒冻性的影响 *
林元震1 , 2 ,张志毅2 ,郭 海3 ,林善枝2 ,张 谦2
(1 华南农业大学林学院 ,广东 广州 510642;2 北京林业大学 林木花卉遗传教育部重点实验室 ,北京 100083;
3水利部 水土保持植物开发管理中心 , 北京 100038)
[ 摘 要]  【目的】研究甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(PsG6PDH)基因超表达对烟草抗寒冻性的影响 ,为烟草的抗
寒冻育种提供理论依据。【方法】构建甜杨 PsG6PDH 基因的植物表达载体 pBG Ⅰ , 采用叶盘转化法转化烟草 , 对转
化烟草植株低温驯化后的形态 、生理生化指标进行测定与分析。【结果】PC R检测及 Southe rn 杂交结果显示 , 甜杨
PsG6PDH 基因已整合到转基因烟草的基因组中。低温试验表明 , 未经冷驯化的对照烟草较转基因烟草早出现萎蔫 ,
恢复正常生长也较晚;经过冷驯化在接近 0 ℃处理 24 h 的对照烟草叶片基本萎蔫 ,而转基因烟草仍然正常。 在 0 ℃
及更低温度胁迫下 ,转基因烟草的相对电导率一直保持在 35%左右 , 而对照烟草的相对电导率则从 35%上升到
90%;随着胁迫时间的延长 , 转基因烟草的 SOD、POD活性升高 , 而 MDA 含量下降。【结论】甜杨 PsG6PDH 基因能
够提高植物的抗寒冻性 ,可以作为改良植物抗寒冻性的新的外源基因。
[ 关键词]  甜杨;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;烟草;抗寒冻性;超表达
[ 中图分类号]  S572.034;Q785 [ 文献标识码]  A [ 文章编号]  1671-9387(2010)03-0125-07
Research on overexpression of PsG6PDH gene from Populus
suaveolens to improve cold and freezing tolerance of tobacco plants
LIN Yuan-zhen1 ,2 , ZHANG Zhi-yi2 ,GUO Hai3 , LIN Shan-zhi2 , ZHANG Qian2
(1 Co llege o f Forest ry , South Ch ina A gr icu ltura l Un iver sity , Guangzhou , Guangdong 510642 , Ch ina;
2 Col lege o f B iolog ical S cience , Bei j ing F orest ry Universi ty , Bei j in g 100083 , Ch ina;3 P lant Materials Center for S oi l
and Water Conserva tion ,Minist ry o f Water Resources , B ei j in g 100038 , China)
Abstract:【Objective】Effects on tobacco plants by overexpression of P sG6PDH gene f rom P.suaveo-
lens were studied in this pape r , which might provide theoretical basis fo r the gene tic cold to lerace and freez-
ing resistance in plants.【Method】The gene P sG6PDH was constructed into binary vecto r pBI121 and
transfo rmed into tobacco plants by leaf disc method , and the indexes o f phy siolog y and biochemistry in
t ransgenic lines w ere determined under low temperature st ress.【Resul t】PCR and Southern blot ting re sults
veri fied integ ration of this g ene into the genome of tobacco.Moreover , cold t reatment experiments showed
that w ithout cold acclimation w ild-ty pe tobaccos suf fered or resumed from cold injury earlier or later than
transgenic lines.After cold acclimation ,w ild-ty pe tobacco s g reat ly suf fered f rom cold injury w hi le t ransgen-
ic lines w ere no rmal af ter 0 ℃ t reatment for 24 h.During 0 ℃ to even low temperature , the relat ive leakage
data of transgenic lines steadi ly stay ed on approximately 35%,whi le that o f w ild-type lines increased from
approximately 35% to 90%.In addi tion ,SOD , POD act ivities w ere increasing w hile MDA content was de-
creasing w ith the time extending under cold st ress.【Conclusion】The poplar g ene PsG6PDH could result
* [ 收稿日期]  2009-09-15
[ 基金项目]  国家自然科学基金项目(30271093 , 30771759)
[ 作者简介]  林元震(1979-), 男 ,福建仙游人 ,讲师 ,主要从事林木抗逆分子遗传研究。 E-mai l:yzhlin@scau.edu.cn
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2010.03.021
in the low-temperature-hardiness of plants and is a new foreign gene in improving the cold and freezing to l-
erance of t ransgenic plants.
Key words:Pop ulus suaveolens;G6PDH ;tobacco;cold and freezing tolerance;overexpression
  低温可以使植物受到不同程度的伤害甚至死亡 ,
低温冻害是限制地球上植物分布与生长的重要因素
之一。近年来 ,国内外在运用转基因技术提高植物抗
冻性方面开展了大量研究工作 ,但一些被成功导入植
物体内的为数不多的抗冻蛋白基因 ,多为来源于北极
鱼类 、昆虫或草本植物的单一基因 ,并不一定是关键
基因;同时 ,由于动物与植物之间存在亲源关系远 、基
因结构差异大等问题 ,采用北极鱼类及昆虫抗冻基因
导入的方法 ,很难达到遗传改良植物抗冻性的目
的[ 1-2] 。因此 ,要继续通过基因工程来提高植物(尤其
是林木)的抗冻性 ,必须扩大抗冻基因的来源 ,特别是
要利用高大林木这个大的基因库 ,而不应该将抗冻基
因的选择局限于草本植物或者某些模式植物。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate
dehydro genase ,G6PDH)是磷酸戊糖途径的关键性
调控限速酶 ,其广泛存在于原核生物 、动物和植物
中。G6PDH 的主要功能是为脂肪酸合成 、氮还原
和谷胱甘肽等生物分子的合成提供 NADPH 还原
力 ,也为核酸合成提供戊糖。此外 ,它还参与了非生
物逆境胁迫的应答反应。因此 ,其对植物的生长发
育起着非常重要的作用[ 3-5] 。1972 年 ,Sagisak[ 6] 首
次发现 ,杨树枝条中的 G6PDH 活性 ,在入秋和越冬
时呈先升高后下降的趋势 。Sag isak[ 7] 在冷藏杨树
枝条时 ,发现枝条中的 G6PDH 活性下降 ,引起枝条
伤害 。至今 ,人们已在苜蓿 、黑麦草 、大豆 、香蕉和毛
白杨等植物中发现 ,低温会引起其 G6PDH 活性的
升高[ 8] 。但目前关于 G6PDH 活性与植物抗寒冻性
之间关系的分子机理研究报道尚比较少 ,在林木的
抗寒冻性研究方面尤其如此。
甜杨属青杨派 ,主要分布在中国大兴安岭东北及
漠河寒冷地带 ,是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基
因克隆问题的理想材料。前期研究表明 ,低温锻炼
后 ,甜杨中 G6PDH 活性的增加有助于膜保护性酶
SOD和 POD活性的提高 ,进而可以提高甜杨的抗冻
性[ 8] 。在此基础上 ,本研究小组以甜杨的无菌苗为材
料 ,分离出了甜杨 G6PDH cDNA 基因 PsG6PDH ,并
进行了基因的结构分析和功能预测。本研究进一步
构建了 PsG6PDH植物表达载体 ,采用叶盘转化法导
入烟草 ,进行了转基因烟草的低温试验 、电导率分析
和膜保护性酶活性变化测定 , 并探讨了甜杨
PsG6PDH 基因提高烟草抗寒能力的可能作用机制 ,
以期为研究甜杨 PsG6PDH 基因在转基因烟草抗寒
性中的功能 ,以及利用基因工程改良有经济价值的农
作物和林木的抗寒性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 甜杨 PsG6PD H 基因的烟草转化
以 pBI121 为载体 , 通过重组技术构建甜杨
PsG6PDH 基因的植物表达载体 pBG Ⅰ ,利用液氮
冻融法[ 9] 转化农杆菌 LBA 4404。采用叶盘法[ 10] 进
行烟草转化 ,卡那霉素(Km)筛选质量浓度为 100
mg/L。
1.2 转基因烟草的 PCR检测和Southern印迹检测
采用 CTAB 法[ 11] 提取转基因烟草(TG)和野生
型烟草(CK)的基因组总 DNA ,以 PFL01和 PFL02
为引物进行 PCR扩增 ,目的基因为 PsG6PDH 。用
EcoRⅠ酶切烟草基因组 DNA ,以目的基因为探针 ,
利用 Dig H igh Prime DNA Labeling and Detection
S tarter Kit1(Roche)试剂盒对烟草基因组 DNA 酶
切产物进行 Southern印迹检测[ 12] 。
1.3 转基因烟草的移栽和抗寒性检测
将相同苗龄的野生型烟草和转基因烟草的生根
组培苗 ,移入营养杯(V(土)∶V(蛭石)=1∶1)中培
养 ,培养温度为 26 ~ 28 ℃,光照 16 h/d ,光照强度
2 200 lx 。培养 2个月后 ,选择生长性状一致的野生
型烟草和转基因烟草进行低温试验(低温生化培养
箱 DP-200)。试验参照 Fan等[ 13] 的方法 ,分 2个处
理:(1)未经 15 ℃冷驯化 ,培养温度从 26 ~ 28 ℃直
接下降到 4 ℃;(2)15 ℃冷驯化(培养温度从26 ~ 28
℃直接下降到 15 ℃)3 d后 ,再从 15 ℃缓慢下降到
-4 ℃,降温梯度为 0.5 ℃/h ,每下降到所需的处理
温度后再保持 24 h 。
1.4 电导率的测定
将相同苗龄的野生型烟草和转基因烟草在不同
温度(4 , 0 , -2 , -4 ℃)处理 2 h后 ,取相同部位的叶
片用打孔器打成小圆片 ,取 10个小圆片加入去离子
水5 mL ,真空渗透 15 min ,室温静置 30 min ,测定电
导率 S1 ;然后沸水浴 30 min ,冷却后测定电导率 S2 。
每处理重复 3次。相对电导率 S=S1/S2 ×100%[ 14] 。
相对电导率的方差分析参照明道绪[ 15] 的方法进行 ,
126 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 38 卷
半致死温度的计算参照朱根海等[ 16] 的方法 。
1.5 SOD 、POD活性和 MDA 含量的测定
将野生型烟草和转基因烟草于15 ℃冷驯化 3 d
后 ,培养温度直接下降到 4 ℃处理 1 ,3 , 5 d ,分别取
0.5 g 叶片 ,加适量 PVPP ,液氮研磨后加入 3.2 mL
提取液(62.5 mmol/L PBS , pH7.8;0.1 mmo l/L
EDTA),4 ℃浸提 1 h 后 ,于 4 ℃、12 000 r/min离
心 20 min ,取上清液 , -25 ℃保存备用 。SOD 、POD
活性和 MDA 含量的测定参照 Lin 等[ 8] 的方法。
SOD活性 、POD活性和 MDA 含量的方差分析参照
明道绪[ 15]的方法进行 。
2 结果与分析
2.1 转基因烟草的 PCR检测和Southern印迹检测
将 PCR产物用 8 g/L 琼脂糖凝胶进行电泳分
析 ,结果见图 1。由图 1可见 ,转基因烟草均可扩增
出大小约 1 600 bp的片段 ,与预期 PsG6PDH 基因
的大小一致 ,而未转化的对照烟草则没有扩增到此
条带 ,由此可初步证明该基因已整合到烟草基因组
DNA 中。Southern印迹检测结果(图 2)进一步表
明 ,整合到烟草基因组 DNA 上的确实是甜杨
PsG6PDH 基因。
图 1 转 PsG6PDH 基因烟草的 PCR检测
CK+.阳性对照(pBG Ⅰ质粒);CK-.阴性对照;
1~ 5.转基因植株;MK.DNA Maker
Fig.1 PCR detection o f PsG6PDH gene tr ansgenic tobaccos
CK+.Posi ti ve cont rol(Plasmid pBG Ⅰ);CK-.Negative
con trol;1-5.Trangenet ic plants;MK.DNA Maker
图 2 转 PsG6PDH 基因烟草的 Southern 检测
CK.对照;1~ 4.转基因植株
Fig.2 Southern blo tting detection of transgenic tobacco s
CK.Cont rol;1-4.T ransgenic plants
2.2 转基因烟草的抗寒性分析
为了鉴定转基因烟草的抗寒能力 ,本研究进行
了 2个不同的低温处理试验 ,其结果如图 3 ,4所示 。
图 3 未经冷驯化的野生型烟草(对照 ,左)和转基因烟草(右)的低温试验
A.低温处理前(28 ℃);B ~ F.4 ℃低温分别处理 12 , 24 , 48 , 72 , 84 h
Fig.3 Cold treatment e xperiment on w ild type tobacco(CK , left)and transgenic tobacco(right)w ithout cold-acclimation
A.Before cold t reatm en t(28 ℃);B-F.Cold t reatment at 4 ℃ f or 12 , 24, 48 , 72 , 84 h , respect ively
127第 3 期 林元震 ,等:甜杨 PsG6PDH 基因超表达对提高烟草抗寒冻性的影响
  由图 3可以看出 ,在处理前 ,转基因烟草植株与
对照烟草植株无明显的生长性状差异 。低温处理
后 ,未经冷驯化的转基因烟草植株较对照晚受伤害。
其中 ,4 ℃处理 12 h时 ,对照烟草植株基部叶片已表
现出比较明显的萎蔫症状 ,而转基因烟草植株仍保
持正常;4 ℃低温处理 24 h 后 ,转基因及对照烟草植
株均出现萎蔫现象;但 4 ℃处理 84 h后 ,转基因烟
草植株已经适应低温并恢复生长 ,而对照烟草仍处
于萎蔫状态。
由图 4可见 ,在经过冷驯化的试验中 ,于 8 ~ 1
℃持续处理 24 h ,对照与转基因烟草均生长正常 ,表
明低温锻炼可以提高烟草的抗寒力;但当温度降至
近 0 ℃或更低温度时 ,对照烟草开始出现萎蔫症状 ,
并且随着温度的下降 ,其萎蔫程度更加严重 ,而转基
因烟草仅在-2 ℃以下才开始出现萎蔫症状 ,其萎
蔫程度也随着温度的下降而加重 ,但其萎蔫程度较
对照轻 。
图 4 冷驯化的野生型烟草(对照 ,左)和转基因烟草(右)的低温试验
A.低温处理前(15 ℃);B ~ I.在 8 , 4 , 2.5~ 3.5 , 1~ 2 , 0~ 1 , -1~ 0 , -2.5~ -1 , -4~ -3 ℃低温下分别处理 24 h
Fig.4 Co ld treatment experiments on wild type tobacco(CK , left)and transgenic tobacco(right)w ith cold-acclimation
A.Before cold t reatmen t(15 ℃);B-I.Cold t reatmen t for 24 h at 8 , 4 ,2.5-3.5 , 1-2 , 0-1 , -1-0 , -2.5--1 , -4--3 ℃, respectively
  综上可知 ,无论是否经过低温驯化 ,转基因烟草
都比对照烟草显示出更强的耐低温能力;同时 ,低温
驯化可有效提高烟草的抗寒能力 ,但对照烟草对低
温的耐受程度不如转基因植株明显 , 这表明
PsG6PDH 的组成型表达的确可以增强转基因烟草
的耐低温能力。
2.3 转基因烟草在低温胁迫下相对电导率的变化
当植物受到逆境影响时 ,细胞膜遭到破坏 ,膜透
性增大 ,从而使细胞内的电解质外渗 ,导致植物细胞
浸提液的电导率增大。因此 ,植物组织受低温伤害
的程度可通过电导率来表示 。由图 5可以看出 ,在
28 ~ -4 ℃,转基因烟草的相对电导率从 5.0%上升
到 40%,而对照烟草的相对电导率则从 5.0%上升
到 90%,尤其在 0 ℃以下时 ,对照烟草的相对电导
率显著升高 ,而转基因烟草则保持在一个相对稳定
的水平 。方差分析结果(表 1)表明 ,不同温度及材
料间相对电导率的差异均达极显著水平 。对相对电
导率配合 Logistic方程计算半致死温度(LT50),结
果见表 2。由表 2 可知 ,对照烟草的半致死温度
(LT 50)为 -0.167 ℃, 而转基因烟草的 LT 50为
-3.152 ℃,远低于对照烟草 。这说明在低温胁迫
下 ,转基因烟草细胞膜的受害程度较对照烟草小 ,其
抗低温能力更强 。
128 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 38 卷
图 5 低温胁迫下转基因烟草与对照烟草相对电导率的变化
F ig.5 Variation of electrical conductivity of tobaccos
under low tem perature stress
2.4 转基因烟草低温处理下 SOD 、POD 活性和
MDA 含量的变化
当植物受到低温胁迫时 ,会产生一些破坏植物
细胞膜系统的有毒物质 ,但植物也会通过提高一些
膜保护性酶 ,如 SOD和 POD 等的活性来清除这些
有毒物质 ,从而增强其抗寒冻性。
图 6表明 ,经过冷驯化的烟草植株 ,在 4 ℃相继
处理 1 ~ 5 d 后 ,转基因烟草的 SOD 活性一直呈升
高趋势 ,而对照烟草则表现出先上升后下降的变化
趋势。
由图 7 可以看出 , 转基因烟草与对照烟草的
POD活性均随处理时间的延长呈上升趋势 ,但转基
因烟草的 POD活性始终大于对照烟草 。
由图 8可知 ,对照烟草的 MDA 含量随处理时
间延长一直呈上升趋势 ,而转基因烟草的 MDA 含
量在开始时略有上升 ,而后一直呈下降趋势。
对照烟草和转基因烟草的 SOD 、POD 活性和
MDA 含量的方差分析结果见表 3。由表 3可知 ,对
照烟草和转基因烟草的 SOD 、POD 活性和 MDA 含
量的差异均达显著水平。上述 SOD 、POD 活性和
MDA 含量的变化说明 ,转基因烟草能通过提高抗
氧化酶活性 、减少膜脂过氧化产物即 MDA 含量来
增强抗寒性 。
表 1 低温胁迫下烟草相对电导率的方差分析
Table 1 Variance analysis o f e lectrical conductivity o f tobacco s unde r low tempera ture stress
变异来源
Sou rce of variat ion
d f 平方和(SS)
Sum of squ are
均方(MS)
Mean squ are
F F 0.01 F0.05
温度 Temperature 4 113.156 28.289 20.086** 4.22 2.78
材料 Material 1 17.270 17.270 12.262** 7.82 4.26
误差 Error 24 33.802 1.408
总变异 Total 29 164.229
表 2 低温胁迫下转基因烟草与对照烟草的半致死温度(LT 50)
Table 2 Calculation of LT 50 in tobacco plants under low temperature str ess
材料
Material
Logist ic方程参数值
Parameter value
K ln a b
Logist ic方程
Logis tic equation
L T50/ ℃
CK 85.641 0.017 -0.103 y=0.103x+0.017 -0.167
TG 96.266 0.300 -0.095 y=0.095x+0.300 -3.152
129第 3 期 林元震 ,等:甜杨 PsG6PDH 基因超表达对提高烟草抗寒冻性的影响
表 3 低温胁迫下烟草 SOD 、POD活性及 MDA 含量的方差分析
Table 3 Variance analy sis o f SOD , POD activity and M DA content of tobacco s under low temperature str ess
变异来源
Source of
va riation
SOD POD MDA
d f SS MS F F0.01 F0.05 df SS MS F F0.01 F0.05 df SS MS F F0.01 F0.05
时间
Time
3 9.257 3.086 5.372** 5.01 3.13 3 16.372 5.457 7.944** 5.01 3.13 3 3.146 1.049 4.041* 5.01 3.13
材料
Mate rial
1 2.801 2.801 4.876* 8.18 4.38 1 3.428 3.428 4.990* 8.18 4.38 1 2.126 2.126 8.192** 8.18 4.38
误差
Error
19 10.914 0.574 19 13.053 0.687 19 4.930 0.259
总变异
T ot al
23 22.973 23 32.853 23 10.203
3 讨 论
目前 ,已从多种植物中克隆分离到 G6PDH 基
因 ,但关于其与抗寒冻性之间关系的研究报道还比
较少 ,而且至今未见关于木本植物相关基因克隆的
报道 。本课题组在前期研究中首次从甜杨中克隆到
G6PD H 基因 ,并发现 G6PDH 基因与甜杨的抗冻
性密切相关[ 8] 。 Lin 等[ 2] 采用生物信息学方法对
PsG6PDH 进行了结构分析和功能预测 ,然后进行
了原核表达 ,证明所克隆到的 PsG6PDH 是可编码
的 ,而且具有完整的编码框。为了进一步验证甜杨
PsG6PDH 基因在抗冻性中的功能和机理 ,本研究
对其进行了烟草转化 。由于植物抗寒性机制比较复
杂 ,所以本研究选择表型低温试验 、电导率测定和膜
保护性酶活性变化来研究其在转基因烟草抗寒性中
的功能。
低温直接损伤细胞的膜结构 ,使膜脂及功能蛋
白受到损伤 ,从而破坏细胞正常的生理生化过程 ,因
此膜结构的稳定性与植物抗寒性直接相关[ 7] 。POD
和SOD等作为内源活性氧的清除剂 ,能够在低温逆
境中清除体内过量的活性氧 ,从而维持活性氧代谢
的平衡 ,保持膜结构的稳定性 ,消除或减轻低温造成
的伤害 ,因而在低温逆境中 , POD 和 SOD的活性水
平与植物品种的抗寒性强弱有十分密切的关系 ,并
可作为植物抗寒性检测的生理指标[ 17] 。本研究结
果表明 ,与转美洲拟鲽 AFP 番茄相似[ 18] ,在低温胁
迫下 ,转 P sG6PDH 基因烟草的 SOD 、POD 活性均
高于对照烟草 ,而且差异显著 ,因而能有效清除细胞
内一些过量的有毒物质(如氧自由基或过氧化物
等),维持细胞膜结构的稳定 ,进而达到保护烟草组
织细胞膜免受低温伤害的目的 。转 PsG6PDH 基
因烟草的 MDA 含量变低 ,表明膜脂过氧化程度下
降 ,细胞膜越趋于正常 ,转基因烟草受伤害的程度越
小。另外 ,膜透性的变化证实 , PsG6PD H 基因的表
达可维持烟草细胞膜结构的稳定。电导率测定结果
表明 ,在 0 ~ -4 ℃,对照烟草与转基因烟草之间相
对电导率变化的差异非常明显 ,对照植株从 0 ℃开
始相对电导率逐渐增高 ,而转基因烟草则保持在一
个相对稳定的水平 ,与美洲拟鲽 AFP 转番茄[ 19] 和
胡萝卜 AFP 转烟草[ 13] 的电导率变化结果相似。同
时 ,半致死温度计算结果表明 ,转基因烟草的 LT 50
远低于对照烟草 。由此可见 ,低温胁迫下 ,转基因烟
草叶片的相对电导率比对照烟草小得多 ,即转基因
烟草细胞膜在低温逆境下的受害程度较对照烟草
轻。上述结果也许正是不论是否经过低温驯化 ,转
基因烟草均较对照烟草表现出更强的抗寒能力的主
要原因所在。综上所述 , PsG6PDH 基因在烟草中
的表达 ,有助于膜保护性酶 SOD和 POD活性的提
高 ,可以降低 MDA 含量和电导率 ,即转基因烟草在
生理生化水平上获得了有益的变异 ,从而达到提高
烟草抗寒性的目的 ,这与前期 G6PDH 在甜杨抗冻
性中作用机理的研究结果一致[ 8] 。另外 , 甜杨
G6PDH 基因在 35S 启动子驱动下 ,可在烟草中稳
定持续地表达 ,且不会影响烟草的表型。
综上所述 ,甜杨 P sG6PDH 的组成型表达 ,不
会影响烟草的表型生长 ,而且在低温胁迫下可以提
高烟草的抗寒能力。因此 ,其可作为植物抗寒冻遗
传改良的新的外源基因。
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