全 文 ：收稿日期:2007-04-17;　修订日期:2007-06-18
基金项目:国家 “ 863”资助项目(No.2004AA2Z3160)
作者简介:刘新友(1968-),男(汉族),安徽砀山人 ,现任中国人民解放军第
四军医大学唐都医院主管药师,硕士学位 ,主要从事结肠靶向药物和药代
动力学研究工作.
＊通讯作者简介:梅其炳(1953-), 男(汉族),四川泸州人 , 现任中国人民
解放军第四军医大学药理学教研室教授 , 博士生导师 ,博士学位 ,主要从
事分子药理学研究工作.
超滤对当归多糖组分总糖含量和蛋白含量的影响
刘新友1 , 周四元 2 , 程建峰 1 , 张　琰1 , 刘琳娜 1 , 梅其炳2＊
(1.中国人民解放军第四军医大学唐都医院 ,陕西 西安　710038;
2.中国人民解放军第四军医大学 ,陕西 西安　710032)
摘要:目的 探讨超滤分离当归多糖组分的可行性及其对各组分总糖含量和蛋白含量的影响。方法 新鲜岷县当归经
80%无水乙醇回流除去脂溶性成分 , 水提醇沉提取当归粗多糖。将当归粗多糖用蒸馏水溶解 , 反复冻融除蛋白后 ,超滤
分离出不同分子量的当归多糖组分 ,并测定各组分的总糖含量及蛋白含量。结果 超滤得到分子量分别为 10 ～ 30kD, 30
～ 300kD和 >300 kD的 3个组分 ,其颜色分别为棕褐色 、淡黄色 、类白色;总糖含量分别为 40.15%, 62.12%和 80.33%;
蛋白含量分别为 2.88%, 0.98%和 0.74%;当归多糖中以分子量 >300 kD的当归多糖组分为主 , 占当归干重的 5.48%。
结论 超滤分离当归多糖 ,可得到总糖含量较高而蛋白含量较低的主要组分 ,且操作简单 ,适于规模化生产。
关键词:超滤;　分离;　当归多糖;　含量测定
中图分类号:R284.2;R927.2 　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)12-2895-02
EffectofUltrafiltrationonTotalSugarContentandProteinContentofAngelicaSinensis
PolysaccharideFractions
LIUXin-you1 , ZHOUSi-yuan2 ,CHENGJian-feng1 , ZHANGYan1 ,LIULin-na1 ,MEIQi-bing2＊
(1.DepartmentofPharmacy, TangduHospital, theFourthMilitaryMedicalUniversity, Xian710038, China;
2.DepartmentofPharmacology, theFourthMilitaryMedicalUniversity, Xian710032 , China)
Abstract:ObjectiveToexplorethefeasibilityofisolatingAngelicasinensispolysaccharidefractionsbyultrafiltrationandthe
effectofultrafiltrationontotalsugarcontentandproteincontentofthesefractions.MethodsThefreshplantDangGuifromMin-
xiancountywascircumfluencedin80% ethanoltoremovethelipophilicfraction.Rudepolysaccharidewasobtainedbyadding
ethanoltoitsconcentratedsolutionextractedindistilledwater.Therudepolysaccharidewasdissolvedindistilledwaterandwas
deproteinizedbyrepeatedfreezethawing, thenthediferentpolysaccharidefractionswereisolatedbyultrafiltration.Thecontents
ofthetotalsugarandtheproteinofthesefractionsweredetermined.ResultsThreefractionswithdifferentmolecularweightof10
～ 30 kD, 30 ～ 300 kDand>300 kDwereobtained.Thecolorsofthesefractionsweredarkbrown, lightyellowandof-white
color, respectively.Thetotalsugarcontentwas40.15%, 62.12%and80.33%, respectively.Theproteincontentwas2.88%,
0.98% and0.74%, respectively.ThemaincomponentofAngelicasinensispolysaccharidewasthefractionwithlargemolecular
weight(>300KD), whichaccountedfor5.48%ofdryDangGui.ConclusionThemainfractionofAngelicasinensispolysaccha-
rideobtainedbyultrafiltrationhashighertotalsugarcontentandlowerproteincontentandtheisolationbyultrafiltrationiseasyto
operate, hence, itissuitabletoisolateAngelicasinensispolysaccharidefractionsinlargescale.
Keywords:Ultrafiltration;　Isolation;　Angelicasinensispolysaccharide;　Contentdetermination
　　当归多糖是一种多组分多糖 ,分子量范围很广 , 因为药材产
地 、采集时间以及提取方法的不同其组成会有很大变化。现代药
理学研究证实 , 当归多糖具有增强免疫 [ 1] 、提高造血功能 [ 2] 、保
肝 [ 3] 、抗肿瘤 [ 4] 、抗辐射损伤 [ 5]及促进胃肠道黏膜上皮细胞的移
行与增殖 , 拮抗泼尼松龙引起的外周血白细胞减少 , 加速胃肠道
损伤黏膜修复等作用 [ 6] , 还能作为载体合成具有结肠靶向递药
特性的地塞米松前体药 [ 7] 。但当归多糖常采用凝胶柱进行分
离 , 效率低 ,成本高。本实验拟采用超滤分离当归多糖组分 ,并对
各组分的总糖含量和蛋白含量进行分析。
1　材料与仪器
甘肃岷县新鲜当归 ,于每年霜降后采收。无水乙醇 , 无水葡
萄糖 , 浓硫酸 ,磷酸均为分析纯;重蒸苯酚(陕西建华生物有限公
司);Servablue-G-250染料(华美生物工程公司);牛血清白蛋
白(BSA)(Sigma-Aldrich)。 MM12型食品绞碎机(广东省韶关
市食品机械厂), 10 L调温式电热套(北京科伟永兴仪器有限公
司), RE52-05型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), CR21F型
高速离心机(Hitachi), 真空泵(河南巩义市英裕予华仪器厂), 冷
冻干燥机(FTSSystems), DU-800紫外分光光度计(Beckman),
Pellicon标准超滤仪和 Pelicon-2超滤膜包为 Millipore公司
生产。
2　方法与结果
2.1　当归药材的预处理 岷县新鲜当归 , 清水洗净后 , 用食品绞
碎机绞碎 ,浸泡于无水乙醇中保存。取醇浸当归 ,以 85%乙醇回
流提取 3次 , 2 h/次。醇提当归渣自然晾干 , 备用。
2.2 　当归总多糖的提取 取处理后的干当归渣 500 g, 加入 20
倍蒸馏水回流提取 3次 , 时间分别为 3 , 3 , 2 h。合并 3次提取
液 , 60 ℃减压浓缩至 5 000ml, 放冷 , 3 000 r/min离心 10 min, 上
清液继续浓缩至呈稠膏状 ,加入 3倍量(体积)无水乙醇 , 边加边
搅拌 , 静置自然沉淀。倾去上层乙醇液 , 余下部分以 3 000 r/min
离心 10min,得到淡黄色的当归粗多糖。
2.3　反复冻融除蛋白 取离心得到的当归粗多糖 , 按湿重加入 4
倍量的蒸馏水溶解 ,于 -20 ℃反复冻融 8次 , 3 000 r/min离心 20
min除蛋白。
2.4 　超滤分离当归多糖组分 除蛋白后的当归多糖液加两倍量
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的蒸馏水稀释 , 用 0.45 μm的微孔滤膜过滤 , 以 10 kD的超滤膜
透析除去小分子杂质 ,然后依次用 300 kD, 100 kD和 30 kD的超
滤膜分离。将分离的组分液减压浓缩 , 冷冻干燥 ,得到分子量分
别为 10 ～ 30kD, 30 ～ 300kD和 >300 kD3个当归多糖组分。超
滤得到的当归多糖组分 , 随分子量的增加 , 其颜色逐渐变浅;当归
多糖中以大分子的当归多糖为主 , 其中分子量 >300 kD组分占
当归干重的 5.48%。结果见表 1。
表 1　当归多糖组分的性状及收率
组分 颜色 收率(%)
粗多糖 淡黄 /
10 ～ 30kD 棕褐 0.48
30 ～ 300kD 淡米黄 2.76
>300kD 类白 5.48
收率以所得多糖占干当归渣干重的百分比表示。
2.5　总糖含量测定方法 采用改良的苯酚 -硫酸法测定总糖含
量 [ 8] 。重蒸苯酚用蒸馏水配成 60 g/L的溶液。精密称取 105 ℃
干燥至恒重的无水葡萄糖 15 mg, 用蒸馏水定容至 100 ml, 使成
150μg/ml的葡萄糖储备液。
2.5.1　标准曲线制备 分别精密量取葡萄糖储备液 0.1, 0.2,
0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml于 10ml具塞圆底试管中 , 各加蒸馏水
至 1 ml, 振摇混匀 , 使成 15.00, 30.00, 45.00, 60.00, 75.00,
90.00, 105.00 μg/ml的葡萄糖标准工作液。 于各管中分别加入
60 g/L的苯酚溶液 0.6 ml,浓硫酸 3ml, 漩涡振荡器振荡均匀 ,放
置 15min,于 490nm处测定吸光度 ,每个浓度平行做 3组 , 计算
平均吸光度值。空白校正用蒸馏水 1 ml按上法平行操作。以测
得的平均吸光度值(Y)对葡萄糖标准工作液的浓度(X, μg/ml)
作线性回归 ,得测定总糖含量的标准曲线回归方程为 Y=0.013 6
X+0.019 4, r=0.999 6, 线性范围 15.40 ～ 107.80 μg/ml。
2.5.2 　准确度和精密度实验 分别配制 23.10, 61.60, 100.10
μg/ml的葡萄糖溶液 ,按标准曲线制备方法操作 , 同 1日内连续
测定 5次 , 计算平均回收率及日内 RSD;3个浓度每天各测定 1
次 , 连续测定 5d, 计算日间 RSD。结果见表 2。
表 2　总糖含量测定方法的准确度和精密度
葡萄糖溶液浓度
C/μg· ml-1
平均回收率
(%)
日内 RSD
(%)
日间 RSD
(%)
23.10 102.3 2.5 3.3
61.60 98.2 2.7 3.2
100.10 99.4 1.8 2.2
　　n=5
2.6　蛋白含量测定方法 采用 Servablue-G染料结合法 [ 9]测定
当归多糖中的蛋白含量。 Servablue-G储备液的配制:称取 Ser-
vablue-G-250 70 mg, 用 95%乙醇 20 ml溶解 , 加入 85%磷酸
40 ml,摇匀 , 于室温存放。 Servablue-G工作液的配制:取 Serva
blue-G储备液 3ml, 95%乙醇 1.5 ml, 85%磷酸 3 ml,用双蒸水
定容于 50ml, 棕色瓶存放 , 室温保存 , 用前过滤。牛血清白蛋白
(BSA)储备液配制:精密称取 BSA4mg, 用生理盐水溶解并定容
于 100 ml容量瓶中 ,使之成浓度为 40 μg/ml的 BSA储备液。
2.6.1　标准曲线制备 取 BSA储备液用生理盐水分别配制浓度
为 5.00, 10.00, 15.00, 20.00, 25.00, 30.00 μg/ml的 BSA系列标
准溶液。取 BSA系列标准溶液各 1 ml, 分别置于 1次性聚乙烯
试管中 , 每管均加入 Servablue-G工作液 1 ml, 漩涡振荡器混
匀。空白校正用生理盐水 1 ml平行操作。 2 min后于 595 nm测
定吸光度 , 1h内测定完毕。每个浓度平行做 3组 ,求出平均吸光
度值。以测得的平均吸光度值(Y)对 BSA系列标准溶液浓度
(X, μg/ml)作线性回归 , 得到测定蛋白的标准曲线回归方程为 Y
=0.014 3X+0.064 3, r= 0.999 8, 线性范围 5.24 ～ 31.42
μg/ml。
2.6.2　准确度和精密度实验 取 BSA储备液用生理盐水分别配
制浓度为 8.38, 16.76, 25.14 μg/ml的 BSA溶液 , 按标准曲线制
备方法操作 , 同 1日内连续测定 5次 , 计算平均回收率和日内
RSD;3个浓度每天测定 1次 , 连续测定 5d,计算日间 RSD。结果
见表 3。
2.7　各组分总糖含量和蛋白含量的测定 精密称取当归多糖各
组分 25mg,分别用蒸馏水溶解定容至 50 ml, 使成 500 mg/ml的
样品溶液。取样品溶液 0.2 ml按总糖含量测定方法项下方法操
作 , 于 490 nm测定吸光度 ,每个样品平行做 3组 ,同时以蒸馏水 1
ml平行做空白校正。以测得的平均吸光度值代入测定总糖含量
的标准曲线回归方程 ,计算各组分总糖含量。 取样品溶液 1 ml,
按蛋白含量测定方法项下方法操作 ,于 595 nm测定吸光度 ,每个
样品平行做 3组 , 计算平均吸光度值 ,同时以生理盐水 1 ml平行
做空白校正。以测得的平均吸光度值代入测定蛋白含量的标准
曲线回归方程 ,计算各组分蛋白质含量。 测定结果表明 , 随着当
归多糖组分分子量的增大 ,其总糖含量增加 , 蛋白含量降低 ,其中
分子量大于 300kD组分的总糖含量高达 80.33%, 蛋白含量仅为
0.74%。结果见表 4。
表 3　蛋白含量测定方法的准确度和精密度
BSA溶液浓度
C/μg·ml-1
平均回收率
(%)
日内 RSD
(%)
日间 RSD
(%)
8.38 99.3 2.3 2.3
16.76 100.5 1.8 2.8
25.14 98.6 1.6 2.2
　　n=5
表 4　当归多糖组分的总糖含量及蛋白含量 %
组分 总糖含量 蛋白含量
未超滤多糖 65.10 1.60
10 ～ 30kD 40.15 2.88
30 ～ 300kD 62.12 0.98
>300 kD 80.33 0.74
表中的未超滤多糖为反复冻融除蛋白后的冻干品。
3　讨论
当归为块状根茎类 ,在干燥过程中由于其所含的酶类可能会
使多糖的组分发生变化 ,因此市售干当归提取的多糖其质量不易
控制。有些药商在炮制过程中采用了硫磺熏制的办法 ,在当归切
片时为了防止粘连还涂抹了油性物质 ,用这种饮片提取的当归多
糖性状较差 ,醇沉后粘性大 , 总糖含量低 , 质量难以控制。鉴于
此 , 我们选用了新鲜当归 , 将新鲜当归药材绞碎后 ,以无水乙醇浸
泡的方法对当归药材进行预处理。无水乙醇浸泡可以除去一部
分脂溶性成分 ,破坏细胞脂膜 , 有利于水提时当归多糖的浸出 , 同
时还能破坏当归药材中的酶类 , 使多糖的组分保持稳定 , 最大程
度上保证了提取的当归多糖的质量可控性。
当归多糖提取纯化的关键步骤是除色素和蛋白 ,乙醇预处理
虽可除去一部分色素 ,但提取的多糖依然有较深的颜色。我们最
初考虑用活性炭脱色 ,但在实验过程中发现 ,当归多糖溶液粘性
较大 , 加入的活性炭很难除去。另外加活性炭处理得到的当归多
糖总糖含量较低 ,可能是活性炭吸附了大量的多糖 ,而对其它杂
质的吸附较少所致 ,这可能对其组成产生很大影响。因此 , 我们
认为活性炭不适合于当归多糖的脱色。当归多糖中含有的植物
蛋白会影响其内在质量。常规除蛋白多采用三氯乙酸法和鞣酸
法 , 但在酸性条件下可能造成多糖的降解;Sevag法在避免多糖降
解方面效果较好 ,但试剂消耗量大 , 也可能造成氯仿等有机溶剂
的残留 。商澎等 [ 10]将当归多糖液置于 -20 ℃反复冻融除蛋白 ,
因此我们采用了反复冻融的方法除蛋白。超滤结果表明 ,分子量
小的组分颜色较深 ,而分子量 300 kD以上组分为类白色;蛋白含
量测定表明 ,随分子量组分的增大 , 蛋白含量降低 , 300 kD以上
组分所含的蛋白是反复冻融除蛋白后当归多糖的 46.25%,是 10
～ 30 kD组分的 25.69%, 因此超滤有利于除去大分子量多糖组
分中的色素和游离蛋白。从总糖含量测定结果可以发现 ,高分子
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.12　
量当归多糖组分的总糖含量高 , 而分子量越低的组分 ,其总糖含
量越低 , 说明当归多糖的杂质主要是低分子量的物质。超滤分离
当归多糖组分的收率表明 , 当归多糖中以分子量 300 kD以上组
分为主 ,达到药材干重的 5%以上 , 且该组分的总糖含量亦高达
80%以上。
综上所述 , 超滤可用于分离当归多糖组分 ,并且可以起到去
除主要组分(>300 kD)中色素和蛋白的作用 , 而且超滤法操作
简单 , 适于规模化生产。
参考文献:
[ 1] 　杨铁虹 , 卢保华 , 贾　敏 , 等.当归多糖对小鼠免疫功能的影响
[ J] .中国药理学通报 , 2003, 19(4):448.
[ 2] 　李　静 , 王亚平.当归多糖对骨髓巨噬细胞的影响及其与造血调
控的关系 [ J] .中草药 , 2005, 36(1):69.
[ 3] 　操　刚 ,赵　骥 ,陈红光 , 等.当归多糖对小鼠实验性肝损伤的影
响 [ J] .咸宁学院学报(医学版), 2004, 18(5):332.
[ 4 ] 　左增艳 ,柳钟勋 ,李键蕊 ,等.新型生物反应调节剂:当归多糖(AS-
DP)抗肿瘤作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响 [ J].中国免疫学杂
志 , 2000, 16(10):545.
[ 5 ] 　洪　艳 , 刘君燕,王红玲 ,等.当归多糖对放射损伤小鼠细胞免疫
的调节作用 [ J] .武汉大学学报(医学版), 2001, 22(1):26.
[ 6 ] 　ChoCH, MeiQB, ShangP, etal.Studyofthegastrointestinalprotec-
tiveefectsofpolysaccharidesfromAngelicasinensisinRats[ J] .Plan-
taMedica, 2000, 66:348.
[ 7 ] 　刘新友 ,周四元 ,程建峰 , 等.地塞米松当归多糖前体药在大鼠体
内的结肠靶向释药研究 [ J] .中国临床药理学与治疗学 , 2006, 11
(5):505.
[ 8 ] 　董　群 ,郑丽仪 ,方积年.改良的苯酚 -硫酸法测定多糖和寡糖的
含量 [ J] .中国药学杂志 , 1996, 31(9):550.
[ 9 ] 　BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmi-
crogramquantitiesofproteinsutilizingtheprincipleofproteindyebind-
ing[J].AnalBiochem, 1976, 72:248.
[ 10]　商　澎 ,杨铁虹 ,贾　敏 , 等.当归多糖的分离纯化及分析鉴定
[ J] .第四军医大学学报, 2001, 22(14):1311.
收稿日期:2007-03-20;　修订日期:2007-05-10
基金项目:新疆维吾尔自治区高等学校科学研究计划资助项目(No.
XJEDU2005G07);
　　　　 塔里木大学校长青年基金资助项目(No.TDZKQN06003)
作者简介:赵小亮(1982-),男(汉族),甘肃灵台人 ,现任塔里木大学新疆
生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室助教 ,学士学位 ,
主要从事资源植物化学研究工作.
杜梨果实热水提取物对 H22小鼠的抗肿瘤作用
赵小亮 , 周忠波 , 白红进 , 张国锋
(塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室 ,新疆 阿拉尔　843300)
摘要:目的 探讨杜梨果实热水提取物对 H22小鼠的抗肿瘤作用。方法 以 H22(肝癌实体型)移植小鼠为模型研究杜梨果
实热水提取物体内抗肿瘤作用 ,以及对脾脏 、胸腺指数的影响。结果 杜梨果实热水提取物对 H22有显著的抑制作用 , 使
荷瘤小鼠的脾脏 、胸腺指数明显升高。结论 杜梨果实热水提取物具有一定的抗肿瘤活性。
关键词:杜梨果实;　热水提取物;　肝癌 H22小鼠;　抗肿瘤
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)12-2897-02
AntitumorEffectoftheHotWaterExtractfromFruitsofPyrusbetulaefoliaBge.inH22
HepatomaMice
ZHAOXiao-liang, ZHOUZhong-bo, BAIHong-jin, ZHANGGuo-feng
(XinjiangProduction＆ ConstructionCorpsKeyLaboratoryofProtectionandUtilizationofBiologicalResources
inTarimBasin, TarimUniversity, Alar, Xinjiang, 843300, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheantitumorefectofthehotwaterextractwaterfrom PyrusbetulaefoliaBge..
MethodsH22 tumor-bearingmicemodelwasestablishedandtheafectiononspleenandthymusindexwasobserved.ResultsTheexperimentindicatedthattheextractbyhotwatershowedsignificantinhibitoryefectsonH22 , andprominentlyimprovedspleenandthymusindexes.ConclusionThehotwaterextractfromPyrusbetulaefoliaBge.hasantitumoractivity.
Keywords:FruitsofPyrusbetulaefoliaBge.;　Hotwaterextract;　H22 hepatomamice;　Antitumor
　　杜梨 PyrusbetulaefoliaBge.属蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus
L.)乔木 , 在微酸性和碱性土壤中生长良好 , 尤其能耐盐碱 , 在瘠
薄和干燥土壤中也能生长。其种子发芽率高 , 能抗病虫害 , 是防
护林及沙荒地造林的珍贵树种 。杜梨药用称棠梨 ,主治功用为敛
肺涩肠 、止咳止痢。常用于治疗久咳 、久泻 、久痢等 [ 1] 。 《本草纲
目》记载棠梨(即杜梨)“味酸 、甘 、涩 、寒;无毒。烧熟食用 , 可治
泄泻痢疾。[ 2] ”根据文献检索 , 目前杜梨主要作为砧木 、园林树种
以及重要的木材来源广泛分布在我国的北部 、东北部和中部各省
(区), 以黄河流域分布较多 [ 1] 。
关于杜梨的研究主要集中在种子萌发与幼苗生长 、幼苗根系
生长状况 ,作为砧木嫁接梨树等方面 [ 3 ～ 5] ,对于杜梨果实活性方
面的研究未见相关报道。本实验对杜梨果实热水提取物对 H22
肝癌荷瘤小鼠抗肿瘤作用进行了研究 ,为杜梨资源的进一步开发
利用提供理论依据。
1　器材与方法
1.1　仪器 旋转蒸发仪 、剪刀 、镊子 、电子天平 、等。
1.2　材料 杜梨果实样品于 2005-11采自塔里木盆地 , 经鉴定为
蔷薇科梨属植物杜梨 PyrusbetulaefoliaBge.的果实 , 自然风干 , 去
除种子及果柄 ,粉碎后过 40目筛备用。
实验用昆明小鼠 , 购于长春市实验动物中心 , 5 ～ 6周龄 , 雄
性 , 体重 18 ～ 22 g。
1.3　药品 5-氟尿嘧啶(5 -fluorouracil, 5-Fu), 购于吉林省肿
瘤医院;生理盐水 、吐温 -80等。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.12 时珍国医国药 2007年第 18卷第 12期