全 文 ：文章编号:0490-6756(2003)03-0590-04
盐生杜氏藻 cbr 基因的克隆
郑鸣 ,白林含 ,马梵辛 ,贺庆华 ,蒋彦 ,曹毅 ,乔代蓉＊
(四川大学生命科学学院 ,成都 610064)
摘要:首先对其他物种 cbr/ el ip 基因的同源序列进行相似性分析 ,设计一对简并引物 ,利用
T R-PCR技术获得一 250bp 的片段 ,经克隆测序分析发现其同 D .bardwai l 的 cbr 基因有
67.0%的同源性 ,然后再以此片段为模板设计引物 ,通过 RACE技术构建盐生杜氏藻 cbr 基因
的全长序列.
关键词:同源克隆;简并引物;cbr;RACE
中图分类号:Q785　　　文献标识码:A
类胡萝卜素作为光合色素的辅助色素在光合生物中起着重要角色 ,不仅能同相关蛋白质结合成复合物 ,
而且可淬灭机体内反应活性很高的自由基[ 1] ,从而使光合作用得以正常进行.近几年来 ,对于类胡萝卜素的
合成途径及代谢调节有了一定的了解[ 2～ 5] ,资料显示 ,类胡萝卜素的形成与叶绿体的发育之间能协同调节 ,
但调节机制尚不清楚[ 6 ,7] .
杜氏藻(Dunaliella.)是一种单细胞真核绿藻 ,属于真绿藻纲 、团藻目 、杜氏藻科[ 8] .它广泛分布于世界
各地的盐湖和海洋中 ,可在 0.1 ～ 5.5 mol/L 的 NaCl溶液下生存[ 9 ,10] .同其他光合生物一样 ,杜氏藻有一个
大的叶绿体 ,并能合成类胡萝卜素 ,有些杜氏藻(如 D .bardwai l)能积累相当于细胞干重 10%的 β-类胡萝
卜素 ,在强光 、高盐 、营养饥饿等环境下还能超表达 β-类胡萝卜素[ 11 , 12] .1990年 , Lers等[ 13] 人成功地从
D .bardwail中克隆出一条类胡萝卜素合成的相关基因 ,即 cbr(carotene biosynthesis related)基因 ,该基因的
丰度同 β-类胡萝卜素的表达量成正相关性 ,进一步的研究显示 , cbr 与高等植物的早期光诱导蛋白(Elips ,
early light-induced protein)同源 ,而且与叶绿素 a , b结合蛋白(Cabs , chlorophy ll a/ b-binding proteins)结构
相似[ 14] .因此 , D.salina cbr 基因的克隆对于阐明D .salina 的发育以及类胡萝卜素的形成同叶绿体发育共
调节的机制具有重要意义.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验用藻种 、工程菌和克隆载体　杜氏盐藻由本实验室保存的盐生杜氏藻(D .Salina),克隆用宿主
菌为大肠杆菌 JM 109 ,克隆载体为 T/A克隆载体(购自 Takara公司).
1.1.2　实验用试剂盒 、工具酶和其它试剂　5′- RACE 试剂盒和反转录酶购自 Clontech公司 , 3′- RACE试
剂盒 、Taq酶和 DNA Marker购自 Takara公司 ,胶回收试剂盒购自华舜公司 , Trizol试剂购自 Invit rogen公
司 ,其他试剂均为分析纯试剂.
1.1.3　引物和测序　实验中所用的引物(见表 1)的合成以及克隆的测序均由上海生物工程公司完成.
1.2　方法
1.2.1　盐生杜氏藻的培养　将 10%接种量在 28℃士 1℃和 16/8h(光照/黑暗)的环境中培养.培养液成分
收稿日期:2003-03-27
基金项目:国家转基因植物与产业化及“ 863”项目基金
作者简介:郑呜(1975-), 男 , 2000 级硕士研究生.
＊通讯作者
　　　
2003年 6月
第 40卷第 3期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
Jun.2003
Vol.40　No.3
参照文[ 16 ,17]的方法略作修改.
1.2.2　盐生杜氏藻总 RNA 的提取　离心收集培养至生长期的盐生杜氏藻细胞 1×107 个 ,加入 1mL Trizol
试剂 ,按照使用说明操作分离总 RNA ,并增加用乙酸铵/乙醇来沉淀总 RNA.提取的总 RNA经 1%非变性琼
脂糖凝胶电泳和 260nm ～ 280nm波长的紫外光扫描来分析其质量.
1.2.3.盐生杜氏藻 cbr 基因部分 cDNA 片段的克隆　取盐生杜氏藻总 RNA进行反转录 ,反转录体系各组分
按反转录酶的使用说明添加 ,反转录条件为 72℃水浴 2min ,冰上急冷 2min , 42℃反应 1.2h.反转录后对其进
行PCR分析 ,PCR引物为兼并引物 ,PCR体系各组分按 Taq酶的使用说明添加 , PCR条件为 94℃预变性
1min ,94℃变性 30s ,55℃退火 50s , 72℃延伸 2min ,35个循环.PCR反应液经 1%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电
泳分离 ,用胶回收试剂盒回收目的片段 ,回收的目的片段用 T/A 克隆载体进行连接转化大肠杆菌 JM109 ,挑
选阳性克隆子测序.
1.2.4　盐生杜氏藻 cbr基因全长 cDNA的构建　3′末端的克隆:3′RACE反应按 Takara 3′RACE 试剂盒的
说明进行 ,完成后用 1%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳分离 ,回收目的片段 ,克隆 、测序.
5′末端的克隆:5′RACE 反应参照 Clontech 5′RACE 试剂盒的说明并略作改进 ,完成后用 1%琼脂糖
(0.5×TBE)凝胶电泳分离 ,回收目的片段 ,克隆 、测序.
cbr 基因全长 cDNA 的构建及开放读框的获得:利用 VectNT I软件包对 cbr 基因的 3′末端和 5′末端序
列结果进行拼接 ,获得全长的 cDNA ,对其进行 ORF 分析 ,并在 OFR的两端设计一对引物进行 RT-PCR ,从
而获得 cbr 基因的 ORF.
表 1　实验用引物序列＊
引　　物 序　　列　　　
兼并引物 上游引物 5′-AA(T/ C)GGNCGNCTNGCNATG-3′下游引物 5′-NCC(A/G/ T)ATCATNGC(G/ A)AANCT-3′
RACE 引物 3′RACE 引物 5′-CTATGCTGGGATT TGTGGCT-3′
5′RACE 引物 5′-CCAGGGATGCTAGGGTGAAT-3′
ORF引物 上游引物 5′-CGGGATCCATGATGATGACCAAGAACAC-3′下游引物 5′-CGAGCTCTTAGAACAGAGCAGTCCCCT-3′
　　　　　　＊N 代表 A/ T/G/ C)
2　结果
2.1　盐生杜氏藻总 RNA的质量分析
由图 1可以看出 , Trizol试剂提出的盐生杜氏藻总 RNA ,在电泳条件下未发现有基因组 DNA和蛋白质
的污染 ,23S 核糖体 RNA与 18S 核糖体 RNA 的带型比较清晰 ,无拖尾现象 ,两条带的亮度比基本上呈 2∶1
的关系 ,由此说明此 RNA完整性比较好.为了进一步确定此 RNA 的质量 ,还对其进行了 220nm ～ 320nm 波
长的紫外光扫描(表 2),其 O.D值为 260/230>2.00 ,260/280在 1.90 ～ 2.00之间 ,表明 RNA的纯度很高 ,
不存在蛋白质 、多糖和酚类的污染.
2.2　盐生杜氏藻 cbr 基因部分 cDNA片段的克隆
利用 RT-PCR技术 ,成功地获得一条约 250bp的片段(如图 2),测序分析显示其同 D.bardwail 的 cbr
基因有 67.0%的相似性.
2.3　盐生杜氏藻 cbr 基因全长 cDNA的构建
通过 3′, 5′RACE技术分别克隆了盐生杜氏藻 cbr 基因的 3′, 5′末端片段 ,如图 3 和图 4 ,测序后利用
VectNTI软件包对 cbr 基因的 3′末端和 5′末端序列进行拼接获得一条 1026bp的片段 ,并成功地利用 RT-
PCR技术获得了 cbr 的ORF(如图 5).
591第 3期 郑鸣等:盐生杜氏藻 cbr基因的克隆
表 2　总 RNA 的紫外分析结果
230A 260A 280A 320A 260/ 230 260/ 280 Conc.(×10-6g/μL)
0.651 1.321 0.685 0.015 2.029 1.928 0.104
图 1　总 RNA电泳　　 图 2　RT/ PCR结果 图 3　3′RACE 结果 图 4　5′RACE 结果 图 5　cbr基因的 ORF
(M 表示 DNA Marker ,各条带的大小为 2000bp , 1000bp, 750bp , 500bp , 250bp ,100bp)
3　讨论
3.1　盐生杜氏藻总 RNA的提取
高质量的 RNA既要求尽可能保持 RNA的完整性 ,同时又要求诸如 EDTA , SDS 等反转录酶抑制剂的
含量尽可能的少 ,因此 ,如何获得高质量的 RNA是分子生物学研究的关键.Trizol试剂是目前应用最广的总
RNA 抽提试剂 ,能够应用于各种生物总 RNA的提取 ,我们在利用 Trizol提取盐生杜氏藻总 RNA 时 ,却出现
很严重的基因组 DNA和蛋白质的污染 ,而且酚类污染也很严重.针对以上问题 ,我们在实验室中特别增加
了乙酸铵/乙醇来沉淀总 RNA , 并取得了良好的效果 , 完全可以运用于 RT-PCR , RACE 等实验 ,
如图 1和表 2.
3.2　盐生杜氏藻 cbr 基因部分 cDNA片段的克隆
在强光照 、高盐 、营养饥饿等逆境条件下 ,光和生物会产生大量自由基 ,从而损伤光合系统 ,这对于光和
生物来说是致命的.cbr/ Elip 则在光合单位的天线系统与玉米黄素结合成光保护复合物 ,能有效地抑制自
由基的产生 ,因而 cbr/ Elip 对于光合生物来说具有重要意义 ,同时也是一种进化相对缓慢的蛋白质.分析
D .bardawil 的 cbr 及拟南芥 、大麦 、豌豆等高等植物的 Elips发现 , cbr/E lips同 Cabs在结构上具有高度的
相似性 ,都有一个结合叶绿素 a , b的保守结构域 ,这就为盐生杜氏藻 cbr 基因的同源克隆创造了条件.根据
保守结构域内的两段氨基酸序列(NGRLAM 和 RFAM IG),设计了一简并引物 ,长度均为 18bp.经 RT-PCR
扩增 ,得到一条约 250bp的特异扩增带 ,与所设计的两条引物间的距离相吻合 ,克隆测序分析发现其同 D.
bardawil的 cbr 基因具有 67.0%的同源性 ,表明这样一条克隆路线是可行的.
3.3　盐生杜氏藻 cbr 基因全长 cDNA的构建
筛选文库和 RACE(Rapid Amplification Of cDNA End)是两种常用的获得全长 cDNA 的方法 ,但相对于
筛选文库 , RACE具有简便 、快捷 、廉价等优点 ,是目前普遍采用的克隆全长 cDNA的技术.Clontech公司发
明的 SMART-RACE 专利技术借助于其公司独特的 SMART Ⅱ寡核苷酸引物和逆转录酶 ,反转录后获得完
整的 5′和 3′末端的 cDNA ,然后再利用合成的第一链 cDNA为模板直接进行 RACE反应 ,这样 ,不仅能方便
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快捷克隆基因的 5′和 3′末端 ,同时又避免了连接接头的问题 ,现已成为克隆全长基因的一项有效手段.为了
增加 RACE的特异性 ,根据 1.2.3步骤所克隆的 cDNA片段又重新设计了一对特异引物 ,利用 RACE试剂
盒分别进行 5′和 3′RACE反应 ,在进行 5′RACE时 ,考虑到引物 Tm 值的大小 ,故相应的降低了 PCR的退火
温度.两次 RACE 结果经克隆测序后 ,利用 VectNTI 软件包对其进行拼接 ,从而成功地构建了盐生杜氏藻
cbr 基因全长 cDNA.序列分析发现 ,这一全长 cDNA包含一个长为573bp的ORF ,翻译产生一条 190个氨基
酸的蛋白质 ,与 D.bardawil 的 cbr 具有 45.7%的相似性.为了方便以后的功能鉴定及转基因表达研究 ,还
以ORF 两端各 20bp为引物 ,并在引物的两端加上限制性酶切位点 ,利用 RT-PCR技术 ,获得了盐生杜氏藻
cbr 基因的编码区.
杜氏藻是一种极端耐盐的真核绿藻 ,是研究藻类植物耐盐机制的较好模型 ,而 D .sal ina cbr 基因的克
隆 ,为研究盐胁迫条件下杜氏藻叶绿体的发育及光合作用的特性提供了条件 ,同时也为耐盐机制的研究奠定
了基础.
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Molecular Cloning of cbr Gene in Dunaliella .Salina
ZHENG Ming ,BAI Lin-han , MA Fan-xin , HE Qing-hua , J IANG Yan , CAO Y i , QIAO Dai-rong
(College of Life Science ,Sichuan Universi ty ,Chengdu 610064 ,China)
Abstract:At f irst , the degenerate primers were designed based on the homologous gene of cbr/elip in other or-
ganisms.Then , using RT-PCR technique , the authors obtained a cDNA fragment of 250bp from D .sal ina.
After cloning and DNA sequencing , the result indicated that 67.0%of the sequence of the f ragment was homol-
ogous to the cbr in D .bardwail.Based on this sequence , the autho rs new ly designed a pairs of primers.By the
RACE technique , the full-leng th cDNA of cbr was successfully const ructed in D .salina.
Key words:homologous cloning ;degenerate primer;cbr(carotene biosynthesis related);RACE(rapid amplifica-
tion of cDNA end)
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