全 文 ：·论著· 文章编号:1007-8738(2004)01-0099-05
采用简并引物克隆 草花粉过敏原全长同源 cDNA
陶爱林1 , 何韶衡1＊ , 张利达2 , 陈章权1 , 李东栋1(1 汕头大学医学院变态反应与炎症研究所 , 广东 汕头 515031;2 上海
交通大学复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研究中心 , 上海 200030)
收稿日期:2003-08-04;　修回日期:2003-09-30
基金项目:广东省自然科学基金课题资助(No.034617)
作者简介:陶爱林(1968-), 男 , 湖北浠水人 , 讲师 , 博士.
Tel:(0754)8900405;Email:shoahenghe@hotmail.com
＊Corresponding author
Cloning full-length homologous cDNAs of
pollen allergens in Humulus Scandens
(Lour.)Merr by degenerate primer
TAO Ai-l in 1 , HE Shao-heng 1＊ , ZHANG Li-da 2 ,
CHEN Zhang-quan 1 , LI Dong-dong 1
1Allerg y and Inflammation Research Institute , Shantou Universi-
ty Medical College , Shantou 515031;2Fudan-SJTU-No ttingham
Plant Biotechnolo gy R&D Center , Plant Biotechnology Research
Center, School of Agriculture and Biology , Shanghai Jiao Tong
University , Shanghai 200030 , China
Abstract
AIM:To establish a stable and reliable method for fast cloning
homologous genes of pol len allergens in allergen-containing
plants.METHODS:Degenerate primers were designed based
on the bioinformatic analysis of numerous allergens available
from the database.Subsequent amplification of the allergen
genes was conducted in the weed pollen cDNA pool by a selec-
tive PCR profile.Following the truncated gene cloning , RACE
method was used to isolate full-length cDNA.Gene function was
deduced by sequence al ignment in GenBank database.The de-
generate ability of the primer was compared with the full-length
cDNA sequences.RESULTS:Three full-length cDNAswere ob-
tained.Sequence analysis showed that these new genes shared
as high as 79%～ 85% homology with a large amount of known
allergen profilins and were hence regarded as members of
panal lergen profilin family.Compar ing these genes with the de-
generate primers that were initially used in truncated gene
cloning revealed that alternative nucleotide degeneracy occurred
beyond the degenerate site predesigned, suggesting that further
degeneracy was expanded by Touchdown-gradient PCR.CON-
CLUSION:Cloning of homologous genes or allergen genes can
be efficiently achieved by using the combination of degenerate
pr imer with Touchdown-gradient RT-PCR in the species such as
Humulus scandens that has not yet been investigated.
Keywords:gene cloning;degenerate primer;gradient PCR;
Homologous gene;allergen
摘要
目的:建立一套稳定可靠的方法 , 对过敏原性物种中的过敏
原同源基因进行快速克隆。方法:在分析生物信息数据库中
积累的大量过敏原序列同源性的基础上 , 设计简并引物 , 基
于高质量 草花粉 RNA , 逆转录合成 cDNA。 采用 Touch-
down 方式在 cDNA 池中进行选择性 PCR扩增。同时借助梯
度 PCR程序 , 对引物扩增的简并性作进一步强化 , 并结合
RACE 技术获取全长 cDNA , 进而对 草花粉中的过敏原同源
基因进行克隆。结果:成功地获得 3 个全长 cDNA 克隆。序
列分析显示 , 这些基因与已知过敏原的基因序列相似性高达
79%～ 85%, 初步认定其为泛过敏原肌球蛋白抑制蛋白(pro-
filin)的同源基因。对比 RACE 技术获得的相应基因的全长序
列发现 , 这些序列在引物结合处与简并引物序列之间存在 4
个碱基的差异 , 提示采用 Touchdown 方式的梯度 PCR程序, 可
使引物的简并性得到进一步扩展。 结论:简并引物与 Touch-
down 梯度 PCR相结合的方法 , 能够对以 草为代表的基因
组未曾深入研究的物种中的过敏原同源基因进行有效克隆。
关键词:简并引物;梯度 PCR;基因克隆;过敏原;同源基因
中图分类号:R282.71　　　文献标识码:A
99ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2004 , 20(1)
DOI :10.13423/j.cnki.cjcmi.003469
100 ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2004 , 20(1)
101ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2004 , 20(1)
102 ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2004 , 20(1)
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刊综合评价数据库统计源期刊 ,国内外公开发行。 1973 年创刊 , 主要刊登国内外医学 、微生物学 、免疫学 、生物化学 、遗传工程 、
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103ISSN1007-8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2004 , 20(1)