全 文 ：2 0 0 9 年 5 月
第 4 6 卷 第 3 期
四 川大学学报 (自然科学版 )
J o u r n a l o f S i e h u a n U n iv e r s it y ( N a t u r a l S e ie n e e E d i t io n )
M
a y 2 0 0 9
V o l
.
4 6 N
o
.
3
d
o
i
: 1 0 3 9 6 9 / j
.
i
s s n
.
0 4 9 0
一
6 7 5 6
.
2 0 0 9
.
0 3
一
0 6 3
攀枝花苏铁愈伤组织的诱导与褐变抑制研究
周 浩` , 王 皎 ` ,
(1
. 四川大学生命科学学院 ,成都 6 1 0 0 6 4 ,
黄 荣“ , 纳海燕`
2
. 攀枝花市园林绿化处 , 攀枝花 6 1 7 0 0 0)
摘 要 : 以攀枝花苏铁的羽 叶作为外植体 , 在含有不 同激素的培养基上诱导愈伤 组织 . 结果
表明 : 以 M S + 2 , 4一 D o . Z m g / L + B A l m g / L 为 最适宜培养基 ; 2 , 4一 D 有利 于诱导率的提高 ;
细胞分裂素 / 生长素的 比值高有利 于愈伤 组织的诱 导 . B A + K T 的 双因子组合没有单 因子 的
诱导效果显著 ; 采用 0 . 1% H g CI : 消毒 的外植体灭菌效果最佳 ; 0 . 1% 的 活性炭抑制 揭 变效果
最好 .
关键词 : 攀枝花苏铁 ;愈伤组织诱导 ; 激素 ; 杀菌剂 ; 褐变
中图分类号 : Q 9 4 s 文献标识码 : A 文章编号 : 0 4 9 0 一 6 7 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 3一 0 5 4 9一 0 4
C a l l u s i n d u c t i o n a n d b r o w n i n g i n h i b i t i o n i n
yC
c a s P a n z h i h u a e n s i s L
.
Z h o u e t 5
.
Y
.
Y a n g
Z H O U H ao
’ ,
W竹 N G J ia 。 ` , H L 7A N G R on g Z , N A H ia 一ya n ’
( 1
.
C o ll e g e o f L if e S e i e n e e s
,
S i
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u a n
U
n iv e r s it y
,
C h
e n g d
u 6 1 0 0 6 4
,
C h in a ;
2
.
G a r d e n O f f ie e o f P a n z h i h u a C i t y
,
P a n z h ih
u a 6 1 7 0 0 0
,
C h in a )
A b s t r a e t
:
T h e y o u n g l e a t h e r l e a v e s o f C夕 c a s P a n z h i h u a e n s i s L . Zh o u e t 5 . Y . Y a n g w e r e u s e d a s e x -
p l a n t s f o r e a l l u s i n d u e t i o n o n m e d i a w h i e h h a d d i v e r s e h o r m o n e s
.
T h e e x p e r im e n t s i n d i e a t e d t h a t t h e
b e s t m e d i u m f o r e a l l u s i n d u e t i o n w a s M S + 2
,
4
一
D 0
.
2 m g / L + B A I m g / L
.
2
,
4
一
D w a s p r o p i t i o u s t o i n
-
e r e a s e i n d u e t i v i t y
.
C a l l u s i n d u e t i o n h a d t h e b e n e f i t o f h i g h r a t i o o f e y t o k i n i n / a u x i n
.
T h e r e s u l t s h o w e d
t h a t e f f i e i e n e i e s o f d o u b l e e y t o k i n i n f a e t o r s o f B A a n d K T w a s n o t m o r e e f f e e t i v e t h a n t h e s i n g l e
.
T h e
e x p l a n t s w e r e m a r i n a t e i n 0
.
1% H g C I
: w a s u s e d f o r s t e r i l i z a t i o n
.
0
.
1% a e t i v e 。 a r b o n c o u ld m a r k e d l y i n
-
h i b i t e a l l u s b r o w n i n g
.
K e y w o r d s
:
C少 e a s P a n z h i h u a e n s i s , e a l l u s i n d u e t i o n , h o r m o n e , b a e t e r i e id e , e a l l u s b r o w n in g
1 引 言
攀枝花苏铁 ( C夕 e a s P a n z h i h u a e n s i : L . Z h o u
et 5
.
Y
.
Y a n g ) 系苏铁科苏铁属多年生木本植物 ,
是我国西南 的特有种 ,分布在攀枝花市的西郊 , l[]
属重要珍稀的濒危植物 . 茎粗壮 , 圆柱形 ,一般高 1
一 3 m ,密披暗褐色宿存 的叶基和叶痕 ,雄雌异株 .
攀枝花苏铁具有较大观赏价值 , 顶生的翠绿树
叶状如凤凰的尾羽 ,是庭院 、 室内常见 的大型盆栽
观叶植物 . 攀枝花苏铁 的树干及其种子都可 以人
药 ,具有药用价值 . 2j[ 同时作为我 国特有的古老残
遗种具有重要的研究价值 ,对研究植物 区系 、 植物
地理 、 古气候 、 古地理及冰川都有重要的意义 . 〔 3〕
国内外对于攀枝花苏铁的研究大多集中于地
理分布 、 化学成分 、 生态学以及生物学特性方面 ,川
对其还未进行过组织培养的研究 . 因此 , 有必要进
收稿 日期 : 20 0 7一 1 2一1 3
作者简介 : 周浩 ( 19 8 2一 ) ,男 ,重庆市荣昌人 ,硕士研究生 , 主要从事园林植物方面研究 .
通讯作 者 : 纳海燕 . E一m a i l : h a y a n a @ s e u . e d u . c n
四川 大学学报 ( 自然科学版 ) 第 46 卷
行本文的研究 .
2
.
1
材料和方法
材 料
4月份取四 川大学文科楼前攀枝花苏铁的 当
年生幼嫩羽叶 .
2
.
2方
2
.
2
.
1
法
培养基配制 按照 MS , B S 的基本配方配
制培养基 , 添加不 同种类 以及浓度的激素 ,并 附加
3%蔗糖 , 0 . 8 %琼脂 , p H 为 5 . 8 . (表 1)
1 5 0 0 ~ 2 0 0 0 l x
,光照时间 l o h / d . 3 5 d 后统计各培
养基中愈伤组织 的数量 , 出愈天数以及诱导率 ,并
观察其生长势 .
2
.
2
.
5 抗揭变剂处理 以诱导出的愈伤组织为试
材 , 在诱导率最高的培养基的基础上进行激素浓度
减半 ,并分别加人 0 . 1% 的活性炭 ( A C ) ,抗坏血酸
( V 。 )
,聚乙烯毗咯烷酮 ( P V P ) , 以不加抗褐变剂为
对照 ,在不同光照条件下 (黑暗 , 全光照 ) 进行抑制
褐变处理 . 其计算公式为 : 褐变率 ( % ) ~ 褐变数 /
接种数 x l o o .
表 1 诱导培养基
T
a
b
.
1 C
u』t u r e m e d ia f o r e a ll u s i n d u e t lo n
培养基编号 激素种类及浓度
( m g / )L
2
, 4一 D N A A B A
C K
2 0
.
2
3 结果与分析
3
.
1 不同杀菌剂灭菌效果比较
本试验 中对 0 . 1% H g C I: 和 10 % N a C IO 两
种杀菌剂的灭菌效果和对诱导率的影响进行了 比
较 . (表 2)
表 2 0 . 1% H gC I: 和 10 % N aC OI 消毒灭菌效 果比较
T a b
.
2 S t
e r ili z a t i o n e f fe t s o f 0
.
1% H g C1
2 a n
d 1 0 % N
a C IO
4 0 4 灭菌剂 接种数
(块 )
出愈数
(块 )
出愈率
( % )
污染
块数
污染率
( % )
污染时
间 ( d )
5 0 4
627l040156
6 0
.
4
H g C 12
N a C IO
7 0
.
6
8 0
.
6
出愈率 (% ) 一 出愈块数 /接种块数 x lo 。 ;
污染率 (% ) 一污染块数 /接种块数 X 10 O
0
.
2 2
l 1
1 2
0 4
O 4
1 4 一 0
.
6 2 0
,
6
C K 为对照 , 1 ~ 8 号基本培养基为 M S , 9一 14 号基本培养基
为 B S
2
.
2
.
2 外植体的处理 选取健壮羽叶 ,除去羽片 ,
在 自来水下冲洗 10 m in , 洗去表面灰尘 ,再用滤纸
吸干水分 ,放于事先灭菌过的烧杯中 . 先用 70 %酒
精经 30 5 表 面 消 毒后 , 再置 于 0 . 1% H g CI : 或
1 0% N a C IO 中 ,并加入吐温 8 0 数滴 , 消毒 1 0 m i n ,
最后用无菌水 漂洗数次 ,用无 菌纸吸干水分后 接
种 .
2
.
2
.
3 接 种 无菌条件下将中脉切成 1一 3 。 m
长的小段 ,然后从小段 中间垂直切开 ,将切面一边
接种在诱导培养基上 .
2
.
2
.
4 培养条件 培养温度 25 士 2 ℃ ,光照强度
采用 H g 1C 2 消 毒 的外 植 体诱 导 率 达 到 了
1 0 %
, 可见 H g CI 。 对外 植体本身并没 有产生 损
伤 ,在接种 21 d 后污染率只有 6% ,说 明 H g CI : 能
够很好的对外植体表面进行消毒 .
采用 N a 1C 0 消毒的外植体在接种 7 d 后 出现
污染 , 然后污染率逐渐扩大 27 % , 说 明 N a CI O 的
杀菌 效 果 不 如 H g CI : , 而 且 出 愈 率 远 远 低 于
H g CI
。 ,只有 40 % ,这应该是由于部分外植体组织
受到杀菌剂伤害的原因所致 .
3
.
2 愈伤组织的诱导
不 同培养基条件下愈伤组织的诱导结果见表
3
. 从表中可以看到 ,培养基 M S 和 B S 诱导出愈伤
组织的时间都在 15 d 以上 , 观察到 的愈伤组织颜
色是黄色或者黄绿色 ,较早出现的愈伤组织质地相
比较晚的要致密 . M S 的最高诱导率为 67 % , 最多
出愈块数为 10 块 , 高于 B S 的 60 % 和 9块 ,各个处
理差异不及 B S 明显 . 就 出愈时间来看 , M S 最早
出愈的 1号培养基 比最晚出愈 的 6 号培养基在时
间 上要 提前 1 6 d , 各个 处理 之间差异 大 . B S 的 出
第 3 期 周浩等 :攀枝花 苏铁愈伤 组织的诱导与揭变抑制研究
图 1 M S (左 )和 B 5(右 )培养基上的愈伤组织
F ig
.
1 C
all u s o nM S (l
e f t )a nd BS (r ig h t )m e d iu m
图 2 V c (左 )与 V P P (右 )对褐 变抑制 的 比较
F ig
.
2 E ff e t s o f b r o wn ing
一r e s is t a nt ag e nt s o nV e (l e f t )a nd V P P (r ig h t )
愈时间则相对集中在 20 d 左右 .
表 3
T ab
.
3
不同培养基诱导愈伤组织结果
E f f e t s o f d if f e r e nt e u l t u r e tr ie d iao n
e al lu s ind u e t io n
编号 接种数
(块 )
出愈数
(块 )
出愈时
间 (d )
诱导率
(% )
颜色 质地
K C1 50
一 0
1 5
l 5
1 7
1 5
67
53
l 5
1 5
2 l
2 2
3 3
2 0
1 5
l 5
30
3 3
l 5
l S
黄绿
黄绿
黄
黄
黄
黄绿
黄
致密
致密
稍疏松
稍疏松
疏松
疏松
稍疏松
108 53
203 510
10
11
1 5
1 5
60
2 7
l 2
1 3
l 5
1 5
2 1
2 2
1 4 1 2 5
1 9
2 0
黄
黄绿
黄
黄绿
黄绿
黄绿
致密
稍疏松
致密
致密
稍疏松
稍疏松
Ot
才`
2
9自
63 61
00曰气月1
诱导率 (% )” 出愈数 / 接种数 x lo 。
从 l , 2 , 4 , 5 , 7 号培养基对照 9一 1 3 号培养基
的诱导率和出愈块数可以看出 , 2 , 4一D 的诱导率在
13 %一 67 %之间高于 N A A 的 6% 一 60 %之间 ,相
同浓度下 2 , 4一 D 的诱导率要高于 N A A , 可见 2 , 4 -
D 有利于诱导率的提高 . 出愈率随着 两种生长素
浓度的增加而降低 .
从 1一 6 号培养基与 9一 12 号培养基的诱导率
和出愈块数可以看出 ,加人 B A 的培养基诱导率最
高为 67 %高于 K T 的 53 % . 并且 B八 与 2 , 4 一D 的
比例在 5一 20 之间 , K T 与 N A A 的比例在 1一 1 . 5
之间 , 即细胞分裂素 /生长素的较高 比值有利于愈
伤组织的诱导 . l m g / L B A 和 。 . 4 m g / L K T 对于
愈伤组织的诱导 比高浓度的 2 m g / L B A 和 1 m g /
L K T 诱导效果好 ,
7
,
8
,
1 3
,
1 4 号培养基采用 了 B A + K T 的细胞
分裂素组合 ,相对于单 因子的其余培养基 ,组合 因
子对愈伤组织诱导的效果差的多 ,特别是 8 号培养
基诱导率为 。 .
外植体在出愈后 20 d 开始 出现干涸 ,组织质
地变致密 . 采用诱导率最高的 1 号 培养基并对其
激素浓度作 出减半处理进行继代培养 ,没有出现愈
伤组织的再分化 以及继续生长 .
四川 大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6 卷
3
.
3 不同抗褐变剂的处理结果
从表 4 中可 以看到 ,加人相同浓度不同种类的
抗褐变剂 , 抑制褐变的效果有显著差异 . 没有加人
任何抗褐变剂的对照 C K 在 7 d 后开始褐变 ,最后
褐变率为 10 % , 褐变程度最严重 ; A C 抑制褐变的
效果最为明显 ,褐变率为 34 % , 开始褐变天数为 19
d
,效果好于 V 。 的 8 9%和 14 d ; P V P 抑制效果一
般 ,虽然开始褐变天数在 23 d 以后 ,但最终褐变率
为 61 %没有 A C 好 . 各个不同的抗褐变剂在黑暗
条件下抑制褐变 的效果都 比光照条件下好 . 总体
来说 0 . 1% 的 A C 抑制褐变效果优于其他抗褐变
剂 .
表 4
T a b
.
4
不 同抗揭变剂 对褐变抑制的效果
E ff e t s o f b r o w n i n g
一 r e s is t a n t a g e n t s o n
e a
ll
u s b r o w n in g
抗褐变 剂 最 初褐变天数 ( d )
褐变率
( % )
褐变等级
(黑暗 /光照 )
比值高有利于愈伤组织的诱导 .
4
.
2 褐变抑制
褐变在许多植物的组织培养中相当普遍 , 轻则
抑制愈伤组织的生长 ,严重的会导致外植体的迅速
死亡 , 因而抑制褐变是许多组织培养研究的重要内
容 ,但在攀枝花苏铁 的组织培养上鲜见报道 . 本文
研究表明在加人 0 . 1%的 A C 后褐变率为 34 % ,低
于相同浓度下 P V P 和 V 。 的褐变率 , 并且大多数
愈伤组织得以存活 , 开始褐变天数为 19 d , 能够在
一定程度上有效抑制褐变 的发生 . 光照对于褐变
也有一定的影响 ,适 当的暗处理有利于抑制褐变 ,
这是因为导致褐变的酚类化合物 的合成和氧化中
需要许多酶系统的参与 ,其中一部分酶系统的活性
是受光诱导的 sj[ . 要从根本 上解决组织培养中的
褐变问题 ,应进一步从褐变发生的原 因 、 生理生化
以及遗传等方面进行更深人的研究 .
参考文献 :
+ + + /十 + 十
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布格局及采挖历史〔J〕. 生态学报 , 1 9 9 9 , ( 1) : 23 .
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D a v i e s M E
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刁JJ weJ119口厂ìresJ
+ / + +
103489
7
1 9
14 十 + / + 十 +
CKAvc
6 1 十 + / + + +
, IJ一 IJ六jA`rlJL.L
“ 十 ” 越多表明褐变程度越严重
, .lJ esJ比J只U厂.LL
4 讨 论
4
.
1 组织培养
攀枝花苏铁为木本裸子植物 ,组织培养难度较
大 , 因此适宜的培养基对于外植体愈伤组织的诱导
起着关键的作用 . 本文研究表明 M S 和 B5 作 为基
本培养基均能成功诱导出愈伤组织 . M S 培养基的
诱导率较高 ,出愈时间普遍早于 B5 培养基 . BS 培
养基含有较低浓度的按 ,木本植物适合在 B S 培养
基上生长 , M S 培养基含有较高 的无机盐浓度 , 对
保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的
生长十分有利 . 阁 通过不同培养基组合的诱导结果
分析得出 ,诱导率最高 , 出愈时间最早的是 M S +
2
,
4
一
D 0
.
2 m g / L + B A 1 m g / L 的培养基组合 . 2 ,
4
一
D 有利于诱导率的提高 ; 细胞分裂素 /生长素 的
[ 7〕
〔8 ]
[责任编辑 : 白林含 ]