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收稿日期: 2012-01-31
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项（201004055）资助。
作者简介: 张红梅，女，硕士研究生。E-mail：zhanghm211@126.com
* 通讯作者: 项 艳，女，博士，教授。E-mail：xiangyan@ahau.edu.cn
安徽农业大学学报, 2012, 39(3): 412-416
Journal of Anhui Agricultural University
网络出版时间：2012-4-28 8:10
[URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20120428.0810.026.html
多花黄精 ISSR反应体系的建立及正交优化设计

张红梅 1，邵元华 1，龙甜甜 1，项 艳 1*，王 进 2，汤 锋 2
(1. 安徽农业大学林学与园林学院，合肥 230036；2. 国际竹藤网络中心，北京 100102)

摘 要：通过对多花黄精 ISSR-PCR反应中的 Taq酶、buffer (Mg2+)、模板 DNA、dNTP以及引物 5个关键因
素进行了 5 因素 4 水平的正交设计试验，确立了适合多花黄精基因组 DNA 的稳定性强、扩增最多数量谱带的
ISSR-PCR最优反应体系，即 25 µL的反应体系中含有 1.0 U Taq DNA聚合酶，3.5 mmol·L-1 buffer (Mg2+)，80 ng模
板 DNA，0.08 mmol·L-1 dNTP和 0.16 µmol·L-1引物。采用建立的多花黄精 ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯
度试验，确定了引物 UBC841的最适退火温度为 54.8℃, 且最适退火温度因引物而异。这一优化的 ISSR-PCR反应
体系的建立为今后利用 ISSR技术进行黄精种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了良好的技术基础。
关键词：多花黄精；ISSR；正交设计；反应体系；优化；退火温度
中图分类号：S567.23 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2012)03041205

Establishment and optimization of an ISSR reaction system
for Polygonatum cyrtonema Hua using orthogonal design

ZHANG Hong-mei1, SHAO Yuan-hua1,LONG Tian-tian1, XIANG Yan1, WANG Jin2, TANG Feng2
(1. School of Forestry and Landscape Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;
2. International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102)

Abstract: In this paper, the orthogonal design of five factors (Taq DNA polymerase, buffer (Mg2+), DNA tem-
plate, dNTP, and primer) in four levels was used to optimize the ISSR-PCR amplification system on Polygonatum
sibiricum. Finally, a satisfactory ISSR（Inter Simple Sequence Repeat) reaction system for Polygonatum sibiricum
with desirable repeatability and polymorphic bands was established. It contained 1.0 U Taq DNA polymerase, 3.5
mmol·L-1 buffer (Mg2+), 80 ng DNA template, 0.08 mmol·L-1 dNTP and 0.16 µmol·L-1 primer respectively in a 25 μL
ISSR reaction system. The optimal annealing temperature of every prime for ISSR-PCR reaction was proposed by
gradient PCR with established ISSR reaction, the optimal annealing temperature was 54.8℃ for primer UBC841,
and different primers had different annealing temperatures. This optimized ISSR reaction system would provide the
basis for the analysis of classification, map construction and gene localization of Polygonatum sibiricum.
Key words: Polygonatum cyrtonema Hua; ISSR; orthogonal design; reaction system; optimization；
annealing temperature

多花黄精[1]( Polygonatum cyrtonema Hua)属于
百合科黄精属植物，是一种重要的野生中药资源，
有着极为丰富的药用价值。黄精种质资源也尤为丰
富，但种质鉴别始终停留在形态鉴别的水平，由于
环境、气候条件等差异的影响，形态鉴别往往不具
备高度准确性，因此，一种有效的黄精品种鉴别方
法迫在眉睫。而 ISSR(inter simple sequence repeat)[2]
分子标记方法，以单一引物为主要引物，具有多态
性水平高，可重复性好，DNA用量少，耗时少，成
本低等优点，近年来在品种鉴定、分子检索、种质
资源和遗传多样性研究中得到了广泛的应用，并成
为构建遗传图谱的工具[3-5]。周晔等人利用 ISSR分
子标记对中药黄精和卷叶黄精进行了鉴别[6]，但利
用分子标记进行全面系统的黄精种质资源鉴定、分
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2012.03.024
39卷 3期 张红梅等: 多花黄精 ISSR 反应体系的建立及正交优化设计 413


类、构建分子遗传图谱和基因定位尚未见报道。
ISSR扩增结果易受 Taq DNA聚合酶、buffer (Mg2+)、
模板 DNA、dNTP和引物等因素的影响，为此，建
立一个适合于黄精的 ISSR-PCR 反应体系，提高
ISSR分析的可靠性和重复性，将为黄精种质资源研
究利用奠定重要的试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料及地点 以2011年5月采自安徽省
林科院的多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)的
叶片为试验材料；同年 5～11月在安徽农业大学林
学与园林学院生物技术实验室进行黄精基因组
DNA的提取及 ISSR分子标记试验。
1.1.2 设备和仪器 凝胶成像系统(美国 UVP)、
PCR扩增仪(德国 Biometra)、琼脂糖凝胶电泳仪(北
京六一厂)、电泳槽、小型高速离心机(HemaTGL-
16H)、高速冷冻离心机(LCJ-64-01，SCR20B)、恒
温水浴锅、常温冰箱、－20℃低温冰箱、－70℃超
低温冰箱(Sanyo)、手提式紫外检测仪、移液器及其
它分子生物学实验所需用的常用设备。
1.1.3 试剂 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β-巯
基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、石英砂、饱和酚、
氯仿/异戊醇(24:1)、NaAc (3 mol·L-1)、无水乙醇、
TE(含 RNA酶)、引物(UBC841:gAg AgA gAg AgA
gAg AYC)、Taq酶(5 U·µL-1)、dNTPs(10 mmol·L-1)、
buffer(Mg2+)等。


表 1 PCR扩增体系各成分因素一水平正交设计(L1645)
Table 1 ISSR–PCR orthogonal design (L1645)
编号
Code No
Taq酶/U·25 µL-1
Taq enzyme
Buffer (Mg2+)
/mmol·L-1
Template DNA
/ng·25 µL-1
dNTP
/mmol·L-1
引物/µmol·L-1
Primer
1 0.5 2.5 40 0.06 0.08
2 0.5 3.0 60 0.08 0.12
3 0.5 3.5 80 0.10 0.16
4 0.5 4.0 100 0.12 0.20
5 1.0 2.5 60 0.10 0.20
6 1.0 3.0 40 0.12 0.16
7 1.0 3.5 100 0.06 0.12
8 1.0 4.0 80 0.08 0.08
9 1.5 2.5 80 0.12 0.12
10 1.5 3.0 100 0.10 0.08
11 1.5 3.5 40 0.08 0.20
12 1.5 4.0 60 0.06 0.16
13 2.0 2.5 100 0.08 0.16
14 2.0 3.0 80 0.06 0.20
15 2.0 3.5 60 0.12 0.08
16 2.0 4.0 40 0.10 0.12

1.2 方法
1.2.1 黄精基因组 DNA 的提取及检测 采用改进后
的 CTAB法提取黄精基因组 DNA，具体步骤如下：
（1）称取 1 g处理后的多花黄精叶片置于研钵中，
并在叶片上均匀撒上 0.2 g石英砂，在液氮中研磨成
粉末；（2）将粉末装入 2 mL的离心管中，加入 650
uL的 2×CTAB和 20 uL的 β-巯基乙醇，轻轻摇匀，
放入 65℃水浴锅中 45 min，每隔 5 min轻轻摇匀 1
次；（3）加 500 µL饱和酚，轻轻摇匀，室温下 12 000
r·min-1，离心 10 min; （4）取上清液转入另一 2 mL
离心管中，加 70 µL 10 % CTAB (60℃水浴)，650 µL
氯仿/异戊醇(24:1)轻轻摇匀，室温下离心 12 000
r·min-1，离心 10 min；（5）重复第 4步 2次；（6）
取上清液转入另一 2 mL离心管中，加 1/10体积(pH
5.2) NaAc、2 倍体积无水乙醇，轻轻摇匀至絮状
DNA出现，室温下离心 12 000 r·min-1，离心 10 min，
－20℃保存 30 min；（7）弃上清液，用 75%乙醇洗
2~3次，倒置晾干；（8）加 50 µL TE（含 RNA酶）
溶解，－20℃保存。利用核酸定量仪测定浓度和纯
度，并将提取的 DNA稀释至 10 ng·µL-1备用。
1.2.2 PCR 正交试验设计与分析 通过 L16(45)正交
试验设计，对 Taq酶、dNTP、buffer (Mg2+)、引物
及模板 DNA进行 5因素 4水平的筛选分析(表 1)，
共有 16个处理，表中编号即为正交表中 16个处理
的编号，按表中各处理的数据加样，每处理设 2个
重复，共 32管。在 PCR扩增仪上进行扩增，反应
414 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012年

体系为 25 µL。反应程序为：94 ℃ 预变性 5 min ，
94 ℃ 变性 45 s，退火 1 min（温度因引物而异），
进行 35个循环，72 ℃延伸 1.5 min, 72 ℃终延伸
10 min。扩增产物经凝胶电泳， 在凝胶成像系统中
观察并拍照，记录结果，并用统计软件 DPS3.01进
行方差分析。得到黄精 ISSR-PCR 反应体系各因素
的最佳水平。
1.2.3 退火温度梯度试验 ISSR 引物是根据加拿
大 British Columbia大学公布的序列设计，由上海生
工公司合成。根据正交优化试验结果的反应体系和
反应程序，采用退火温度梯度试验，逐一确定每个
引物的退火温度。为摸索引物 UBC841的最适退火
温度，在 PCR扩增仪上将退火温度设置为 12个梯
度，最小为 48.0℃，最大为 60.0℃，PCR产物进行
电泳检测。
2 结果与分析
2.1 正交设计试验结果的直观分析评分
2.1.1 电泳结果评分 按表 1设计的 16个处理进行
PCR 反应后，将得到的产物进行电泳，参照何正文
等[7]和汪结明等[8]的正交设计直观分析方法，依扩增
出的谱带特异性与敏感性即谱带的多少、亮度的强
弱和杂带的有无评分，谱带越多、亮度越强、又无
杂带则评分越高。最好的处理定为 16分，最差的处
理定为 1 分，以这 2 个处理的结果为比较标准，再
将其他处理的谱带结果与这 2个标准比较依次评分。
图 1为 16个处理中一个重复的 PCR产物电泳结果，
依照上述评分标准图中各处理的重复记分结果依次
为：6, 5.5; 10, 9; 15, 14; 5, 6; 2, 1.5; 12, 11; 12, 11; 16,
14; 1, 1; 16, 16; 11, 11; 11, 10; 8, 7; 6, 5; 10, 11; 9, 8。


M：Marker 2000 PLUS
图 1 PCR产物电泳结果
Figure 1 Electrophoresis result of PCR products

表 2 方差分析表
Table 2 The variance analysis
Source SS DF MS F P
Taq enzyme 18.156 25 3 6.052 08 13.356 32 0.000 13
Buffer (Mg2+) 293.093 75 3 97.697 92 215.609 2 0.000 00
Template DNA 17.156 25 3 5.718 75 12.620 69 0.000 17
dNTP 67.406 25 3 22.468 75 49.586 21 0.000 00
Primer 185.156 25 3 61.718 75 136.206 9 0.000 00
Error 7.25 16 0.453 13
Total 588.218 75 31



图 2 Taq酶量与结果均值关系
Figure 2 Relationship between quantities of Taq polymerase
and the mean of results

2.1.2 各因素对 PCR 反应影响的差异分析 将上述
处理和评分结果用统计软件 DPS进行方差分析，结
果见表 2。由 F值可知，Buffer (Mg2+)和引物的量对
反应结果影响较大，均达到了极显著；Taq 酶和
dNTP的影响也达到了显著水平；模板 DNA浓度的
影响最小，其各个水平之间影响不显著。对达到显
著水平的 4个因素利用 Tukey法进一步进行因素内
多重比较分析。
2.1.3 因素内各水平对 PCR 结果的影响 Taq 酶浓
度对 PCR结果的影响。 通过对 Taq酶用量进行因
素内多重比较，发现在 25 μL 反应体系中，Taq 酶
不同的反应梯度在 1.0 U至 1.5 U之间差异不显著，
其余梯度之间差异均达到了显著水平。从 Taq酶量
与结果均值的关系图(图 2)可以看出，酶量在 0.5 U
至 1.0 U之间时，均值随酶量的增加而增加，在 1.0
39卷 3期 张红梅等: 多花黄精 ISSR 反应体系的建立及正交优化设计 415


U 时达到最高，当继续增量时，均值下降。可见酶
量过低时 PCR反应的敏感性差，产生的信号较弱；
酶量过高，反应的特异性降低，产生弥散条带。所
以选择 1.0 U·25 μL-1作为黄精 ISSR-PCR反应体系
中酶的最佳浓度。



图 3 Mg2+浓度与结果均值关系
Figure 3 Relationship between concentrations of Mg2+ and the
mean of results

Mg2+浓度对 PCR结果的影响。分析结果表明，
反应体系中的Mg2+浓度对反应体系的影响较大，说
明Mg2+的浓度是影响 ISSR-PCR的重要因素，Mg2+
浓度是 Taq DNA 聚合酶实现聚合反应的必须条
件[9]，Mg2+浓度过低，酶活力显著下降；浓度过高
时，产生大量非特异性的弥散带。通过对Mg2+用量
进行因素内多重比较，结果表明，在 25 μL反应体
系中，Mg2+的不同反应梯度在 3~3.5 mmol·L-1之间
差异不显著，其余梯度之间差异均达到了显著水平。
从 Mg2+浓度与结果均值的关系图(图 3)可以看出，
Mg2+浓度在 2.5~3.5 mmol·L-1之间时，结果均值随
着Mg2+浓度的增加而递增，在 3.5 mmol·L-1时达到
最高，当Mg2+浓度继续增加时，均值下降。所以在
25 μL 反应体系中选择 3.5 mmol·L-1 作为黄精
ISSR-PCR反应体系中Mg2+的最佳浓度。
dNTP浓度对PCR结果的影响。dNTP 作为PCR
反应体系的组成部分，其量的多少直接影响产物的
产量，浓度过低就会影响扩增产量，甚至扩增不出
来；浓度过高会对Mg2+产生抑制作用，使实际反应
中 Mg2+ 浓度下降从而影响聚合酶的活力。通过对
dNTP用量进行因素内多重比较，发现 dNTP不同的
反应梯度在 0.10~0.12 mmol·L-1之间差异不显著，其
余梯度之间差异达到了显著水平。从 dNTP 浓度与
结果均值的关系图(图 4)可以看出，dNTP 浓度在
0.06~0.08 mmol·L-1之间时，结果均值随着 Mg2+浓
度的增加而递增，在 0.08 mmol·L-1时达到最高，当
dNTP 浓度继续增加时，均值下降。所以在 25 μL
反应体系中选择 0.08 mmol·L-1作为黄精 ISSR-PCR
反应体系中 dNTP的最佳浓度。



图 4 dNTP浓度与结果均值关系
Figure 4 Relationship between dNTP concentrations and the
mean of results



图 5 引物浓度与结果均值关系
Figure 5 Relationship between primer concentrations and the
mean of results

模板 DNA浓度对 PCR结果的影响。由(表 2）
的方差分析可见，模板 DNA浓度在 40~100 ng的范
围内对 ISSR-PCR 反应影响较小，没有显著变化。
本实验选择 DNA模板用量为 80 ng·25 μL-1。
引物浓度对 PCR 结果的影响。ISSR 扩增条带
的数量与清晰度和引物浓度密切相关，浓度过低不
能进行有效的扩增，而浓度过高会出现非特异性扩
增，产生模糊小片段和引物二聚体[8,10]，导致条带
不稳定及清晰度下降。从引物浓度与结果均值关系
图(图 5)可以看出，当引物浓度为 0.08 μmol·L-1和
0.16 μmol·L-1时，扩增结果均值较好。通过对引物
用量进行因素内多重比较，结果表明，引物不同的
反应梯度差异未达极显著水平。为了进一步确定最
适引物浓度，利用已筛选出的最适 Taq 酶量、
buffer(Mg2+)浓度、dNTP浓度和 DNA量，将引物浓
度作为单因素进行了梯度分析。从电泳结果图（图
6）可以看出，当引物浓度为 0.16 μmol·L-1，扩增效
果最好，既出现了较多的条带，也没有产生模糊小
片段和引物二聚体，与正交设计试验结果相符。因
此，在 25 μL选择引物浓度为 0.16 μmol·L-1作为黄
精 ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。

416 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012年



1~8: 依次为 0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20、0.24 和
0.28 μmol·L-1
Lane 1-8 corresponding to 0.04, 0.08, 0.10, 0.12, 0.16, 0.20,
0.24 and 0.28μmol·L-1, respectively; M: Marker 2000 PLUS
图 6 不同引物浓度电泳结果
Figure 6 Effects of different primer concentrations on ISSR
amplifications



1~12: 依次为 60.0、59.7、58.8、57.6、56.2、54.8、53.2、
51.8、50.4、49.2、48.3和 48.0 ℃
Lane 1~12 corresponding to 60.0 , 59.7 , 58.8 , 57.6 , 56.2 ,
54.8 , 53.2 , 51.8 , 50.4, 49.2 , 48.3 and 48.0 ℃, respectively; M:
Marker DL2000
图 7 PCR梯度退火电泳结果
Figure 7 Effects of annealing temperature on ISSR amplification

2.2 最适退火温度的确定
退火温度不仅与引物序列有关，还与物种 DNA
的序列有密切关系，因此在进行 ISSR 扩增优化之
前确定引物的退火温度非常重要[11]。根据正交优化
试验结果的反应体系和反应程序，对 ISSR 引物
UBC541 进行退火温度梯度试验，扩增产物进行电
泳检测，结果(图 7)表明，退火温度过低时扩增特异
性差，背景深；退火温度过高时引物与模板结合差，
PCR产物峰度低，电泳条带亮度弱，最终确立引物
UBC541最适退火温度为 54.8℃。
3 小结与讨论
有关 PCR反应体系优化的报道很多，但大多采
用简单的梯度试验方法对每个因素的最佳水平进行
摸索，通过多次试验最终得到最佳反应体系。近年
来正交设计逐渐用于各种反应体系的优化，其主要
根据统计学原理，从复因子试验结果中，挑选几个
处理进行部分试验，了解全面实验的情况和因素之
间的内在规律，能较快地找到最优水平组合。在单
因素设计的基础上，正交设计减少了许多的处理组
合，通过一次试验就得到了最佳反应体系，不仅大
大地节约了时间，而且降低实验费用[12]。
本研究以多花黄精叶片基因组 DNA为模板，通
过对影响黄精 ISSR-PCR 反应的 5 个主要因素(Taq
酶、buffer (Mg2+)、模板 DNA、dNTP以及引物)进行
了 5 因素 4 水平的正交试验设计优化，根据电泳结
果对试验中的各因素及因素内各水平进行了分析，
由于引物的结果均值出现了 2 个峰值，因此对引物
浓度进行了进一步的单因素分析，建立了重复性和
可靠性高的黄精 ISSR-PCR反应体系，即在 25 μL反
应体系中含有：1.0 U Taq DNA聚合酶，3.5 mmol·L-1
buffer (Mg2+)，80 ng模板 DNA，0.08 mmol·L-1 dNTP
和 0.16 µmol·L-1引物。由于 ISSR-PCR 所用的每条
引物碱基组成和数量是不同的，因此，每条引物都
有适合自己的退火温度。退火温度有时候并不严格
等于其 Tm 值，而是在 Tm 值附近波动[13]。因此，
适宜的温度会提高反应的特异性，减少非特异性产
物的生成。本试验通过利用梯度 PCR试验，确立了
ISSR-PCR引物 UBC541的最适退火温度为 54.8℃。
这一优化的黄精 ISSR-PCR 反应体系为进一步利用
ISSR 分子标记对黄精种质资源分类、遗传图谱构建
和基因定位奠定了良好的技术基础，同时也为中药
材的识别提供了一种准确、高效的方法。
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