全 文 :第54卷 第6期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.54 No.6
2015年11月 Journal of Xiamen University(Natural Science) Nov.2015
http:∥jxmu.xmu.edu.cn
doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2015.06.011
碳源对巴氏杜氏藻生长及其脂类含量的影响
余亚岑1,2,钱 领2,刘广发2,高亚辉1,2,贾立山3,梁君荣2,陈长平1,2*
(1.厦门大学深圳研究院,广东 深圳 518057;2.厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361102;
3.厦门大学化学化工学院,福建 厦门 361005)
摘要:如何提高微藻的生长速度,获取高生物量的产出,同时保持较高的脂类含量是目前微藻生物质能源开发中面临
的普遍问题.本实验以巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)突变株 HL-1为对象,研究了不同浓度的碳酸氢钠、葡萄糖、甘
油、醋酸钠4种碳源对其生长和脂类含量的影响.结果表明:1)4种碳源对巴氏杜氏藻的生长及生物量的增加均有促进
作用,高浓度的碳源对藻生长的促进作用有所减弱,但不抑制生长,其中不同浓度的碳酸氢钠对藻生长的影响差异最明
显(最高细胞密度1.18×107 mL-1,比对照组提高32.8%),而不同浓度的醋酸钠对藻生长的影响最不明显.2)添加低
浓度的不同碳源都能相应提高巴氏杜氏藻的生物量,其中生物量最大值为1.24g/L(葡萄糖1mmol/L),比对照组增加
了21.6%,但是随着浓度的升高,生物量有降低趋势.3)不同浓度的甘油、醋酸钠对巴氏杜氏藻细胞的脂类含量差异不
显著(p>0.05);一定浓度范围内碳酸氢钠对巴氏杜氏藻细胞的脂类含量差异也不显著(p>0.05),但当浓度升高到12
mmol/L时,与其他浓度组的差异极显著(p<0.01);添加葡萄糖时脂类含量反而更低.但添加碳源能显著促进藻的生
长,提高生物量,相应地增加了单位体积内的总脂类含量.4)正交试验中,各试验组的结果差异不大,细胞比生长速率在
0.131~0.154d-1间变化,生物量在0.78~1.03g/L间变化,脂类含量在17.5%~21.4%间变化,脂类产率在6.8~
11.0mg/(L·d)间变化.其中细胞比生长速率最高的试验组硝酸钠、尿素、碳酸氢钠、葡萄糖的浓度依次为15,1,6,4
mmol/L.因此很有必要在微藻培养中补充碳源,可提高生长速率,缩短生产周期,又可获得相对较高的脂类含量.
关键词:碳源;巴氏杜氏藻;生长;脂类
中图分类号:Q 494 文献标志码:A 文章编号:0438-0479(2015)06-0812-07
收稿日期:2014-10-31 录用日期:2015-04-28
基金项目:福建省科技计划重点项目(2009N0052);深圳市科技研发资金招研引智项目(ZYD201111080010A);厦门市海洋经济发展专项
(14CZP046HJ20)
*通信作者:chencp@xmu.edu.cn
引文格式:余亚岑,钱领,刘广发,等.碳源对巴氏杜氏藻生长及其脂类含量的影响[J].厦门大学学报:自然科学版,2015,54
(6):812-818.
Citation:Yu Yacen,Qian Ling,Liu Guangfa,et al.The influence of carbon resources on the growth and lipid content of Dunaliel-
la bardawil[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(6):812-818.(in Chinese)
生物质能源是以植物或有机废物为主要原料,经
物理、生物、化学途径转化得到的一种新兴能源[1].生
物质能源相对于化石能源具有可再生[2]、原料来源
广、储藏量大[3-4]、环保[5]等优点,开发生物质能源将成
为今后能源发展的重要趋势之一.而相对于其他生物
质而言,微藻具有细胞结构简单、适应性强、易培养、
生长速率快[6-7]、不占用耕地等特点,并且微藻可作为
原料生产生物柴油、甲烷、乙醇等多种能源物质[8],最
重要的是多数微藻的胞内脂类含量较高,能达到干质
量的50%~70%[9-10],在适宜环境下脂类含量最高能
达到干质量的90%[8].其中,杜氏藻(Dunaliella)细胞
各组分含量丰富,生物质产量较高.杜氏藻细胞灰分
含量低于其他绿藻,脂类、蛋白含量较高.盐生杜氏藻
(D.salina)灰分仅占细胞干质量的4.83%~7.60%,
糖类占31.6%,蛋白占57%[11].大部分杜氏藻的脂类
含量超过干质量的10%,与硅藻相近,远高于海洋大
型藻类[12].在饱和盐水中杜氏藻胞内累积甘油量达其
干质量的80%以上[13].同时,杜氏藻对光照[11]、温
度[14]、盐度[15-16]等环境因子具有很强的适应能力.其
中,巴氏杜氏藻 HL-1(D.bardawil HL-1)是巴氏杜
氏藻 H-42的高脂突变株,其细胞总脂含量可达细胞
干质量的21.1%,比出发藻株提高了31.1%[17],因此
是极具开发潜力的能源微藻.
碳源是促进藻类生长的一类重要营养物质,大多
数微藻利用CO2 作为碳源进行光合营养,然而有些种
类的微藻在生长过程中可以像细菌一样利用葡萄糖、
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甘油、蔗糖等有机营养作为碳源促进生长[18].如小球
藻(Chlorella)[19-21]、柵藻(Scenedesmus)[22]、红球藻
(Haematococus)[23]、螺旋藻(Spirulina)[24]可以利用
葡萄糖、醋酸盐等有机营养进行异养生长,而某螺旋
藻(Spirulinasp.)能利用葡萄糖进行混合营养,并且
研究发现通过添加有机营养可提高微藻生物量[19,25],
同时微藻脂类产量最高能达到光合营养的20倍[25].
本文以巴氏杜氏藻突变株 HL-1为对象,重点研究了
碳酸氢钠、葡萄糖、甘油、醋酸钠4种碳源对其生长及
胞内脂类含量的影响.
1 材料与方法
1.1 藻种、试剂及培养基
实验藻种为由本实验保存的巴氏杜氏藻 H-42诱
变而来的高脂、耐高温突变株 HL-1.碳酸氢钠、葡萄
糖、甘油、醋酸钠、硝酸钠、尿素均为国产分析纯试剂.
实验中所用培养基主要为Ben-Amotz人工海水培养
基[26],此培养基用蒸馏水配制,灭菌后使用.
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计
1)碳源单因子试验
取对数期藻液50mL,4 000r/min离心3min,去
上清后等量接种到装有100mL Ben-Amotz人工海水培
养基的250mL锥形瓶中,分别添加4种碳源母液.碳酸
氢钠设3,6,9,12mmol/L 4个浓度梯度,葡萄糖设1,2,
4,8mmol/L 4个浓度梯度,甘油设5,50,100,200
mmol/L 4个浓度梯度,醋酸钠设1,5,10,20mmol/L 4
个浓度梯度.每个浓度均设3个重复.对照组不加碳源.
2)碳源、氮源正交试验
根据单因子试验结果,以及前期研究结果中最佳
的氮源硝酸钠和尿素,对碳酸氢钠、葡萄糖、硝酸钠、
尿素进行四因子三水平正交试验,根据正交表L9(43)
(表1)得到9个试验组(表2).
表1 正交试验因子及水平
Tab.1 Factors and levels of
the orthogonal test of cultural conditions
水平
浓度/(mmol·L-1)
碳酸氢钠 葡萄糖 硝酸钠 尿素
1 3 1 1 1
2 6 4 5 3
3 12 8 15 5
表2 正交试验设计
Tab.2 The orthogonal test of cultural experiments
编号
浓度/(mmol·L-1)
碳酸氢钠 葡萄糖 硝酸钠 尿素
1 3 1 1 1
2 3 4 5 3
3 3 8 15 5
4 6 1 5 5
5 6 4 15 1
6 6 8 1 3
7 12 1 15 3
8 12 4 1 5
9 12 8 5 1
将对数期的藻液50mL,4 000r/min离心3min,
去上清后等量接种到的装有100mL Ben-Amotz人工
海水培养基的250mL锥形瓶中,按照表2添加各种
氮源及碳源.每个试验组设3个重复.
1.2.2 实验操作
1)细胞培养及生长曲线的绘制
藻细胞用Ben-Amotz人工海水培养基进行培养,
培养温度28 ℃,光源为日光灯,光照强度1 400~
1 500lx,光暗周期14h∶10h,每天定时摇瓶4次.由
于实验藻种呈绿色,叶绿素是其主要色素,而在溶液
中,叶绿素的吸收峰主要为430~450nm的蓝紫光和
630~700nm的红光[27],故本实验选取630nm利用
分光光度法测定巴氏杜氏藻 HL-1的生长速率.隔天
取样2.5mL,在630nm下测定吸光值[28-30],并取1
mL藻液用鲁格氏碘液固定,稀释到一定浓度后用血
球计数板计数(×104 得到细胞密度).确定细胞密度
与吸光值之间的线性关系式,根据线性关系式,通过
测定藻液吸光值D630即可通过计算得到细胞密度,绘
制生长曲线.利用公式μ=(lnNt-lnNt0)/(t-t0)计
算细胞比生长速率.Nt0为t0 时间的细胞密度;Nt为t
时间的细胞密度;t-t0 为间隔的天数(d).
2)生物量的测定
取适量稳定期藻液于离心管中,4 200r/min离心
4min后去上清.再用0.01g/mL氯化钠溶液将藻细
胞洗下,3 500r/min离心3min去上清.冻干后称干
质量测定生物量(g/L).
3)脂类含量的测定
称取500mg上述冻干的藻粉,利用索氏提取法
(无水乙醚为溶剂)测定细胞脂类含量[31-33].
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1.3 统计分析方法
本研究每个试验组分别设置3个重复.统计学分
析采用SPSS 17.0单因素方差分析来判断不同试验
组间的差异性.差异性分析采用 Duncan检验法,单因
素方差分析显著性差异水平为p<0.05,极显著性差
异水平为p<0.01.
2 结 果
图1 4种碳源对巴氏杜氏藻 HL-1生长的影响
Fig.1 Effects of four carbon sources on the growth of D.bardawil HL-1
2.1 4种不同碳源对巴氏杜氏藻 HL-1生长
的影响
添加碳源后藻的生长明显快于对照组,20d后细
胞密度仍在增加(图1).在各试验浓度范围内,高浓度
的碳源对藻生长的促进作用有所减弱,但均未抑制藻
的生长.不同浓度的碳酸氢钠对藻生长的影响差别最
明显,最高细胞密度1.18×107 mL-1(碳酸氢钠6
mmol/L).添加葡萄糖的各组在前4d的生长几乎没
有差异,到第6d差异开始出现,细胞密度最高为1.11
×107 mL-1.甘油对藻的生长有着十分明显的促进作
用,尤其是在培养前期,细胞密度最高1.03×107
mL-1.不同浓度的醋酸钠对藻生长的影响最不明显,
细胞密度最高1.00×107 mL-1.
2.2 4种不同碳源对巴氏杜氏藻 HL-1生物
量的影响
添加碳源均可进一步提高生物量(图2),生物量
最大值为1.24g/L(葡萄糖1mmol/L),比对照组增
加了21.6%.在低浓度下,随着碳酸氢钠、葡萄糖、醋
酸钠浓度的升高,巴氏杜氏藻 HL-1的生物量也相应
增加,试验组之间及试验组与对照组间具有显著差异
(p<0.05),超过一定范围后,生物量随着浓度的升高
较对照组没有明显升高甚至有下降趋势.甘油的添加
同样能提高藻的生物量,但是,随着浓度的升高,各试
验组间无显著性差异(p>0.05).
2.3 4种不同碳源对巴氏杜氏藻 HL-1脂类
含量的影响
不同碳源浓度下脂类含量差异不大(图3).碳酸
氢钠对脂类含量的影响不大,最高为23.0%,仅比对
照组提高5.0%,但浓度为12mmol/L时,脂类含量
占干质量的17.1%,比对照组降低了22.0%,与其他
组具有极显著差异(p<0.01).葡萄糖培养下藻细胞
的脂类含量均低于对照组,浓度为4mmol/L时与对
照组存在极显著差异(p<0.01).添加甘油和醋酸钠
时,各试验组间及试验组与对照组间的脂类含量无显
著差异(p>0.05).可见添加碳酸氢钠、醋酸钠、甘油
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不同的字母分别表示4种碳源不同浓度处理间有显著性差异(p<0.05),下同.
双字母表示该组与组成其两个单字母的组之间均无显著差异(p>0.05).
图2 4种碳源对巴氏杜氏藻 HL-1生物量的影响
Fig.2 Effects of four carbon sources on the biomass of D.bardawil HL-1
图3 4种碳源对巴氏杜氏藻 HL-1脂类含量的影响
Fig.3 Effects of four carbon sources on the lipid content of D.bardawil HL-1
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对藻细胞的脂类含量影响不大,且添加葡萄糖时脂类
含量反而更低.但添加碳源都能显著促进藻的生长,
提高生物量.
硝酸钠、尿素、葡萄糖、碳酸氢钠的正交试验结果
(表3)表明各试验组之间差异不大,细胞比生长速率
在0.131~0.154d-1间变化,生物量在0.78~1.03
g/L间变化,脂类含量在17.5%~21.4%间变化,脂
类产率在6.8~11.0mg/(L·d)间变化.细胞比生长
速率最高的是5号试验组,硝酸钠、尿素、碳酸氢钠、
葡萄糖的浓度依次为15,1,6,4mmol/L.4号试验组
在生物量、脂类含量、脂类产率上都获得了最大值,硝
酸钠、尿素、碳酸氢钠、葡萄糖的浓度依次为5,5,6,1
mmol/L.不同培养条件对巴氏杜氏藻生长、生物量和
脂类含量影响结果表明,碳源和氮源对藻的生长速度
和生物量的影响结果一致,影响大小的次序为:碳酸
氢钠>硝酸钠>尿素>葡萄糖,对脂类含量影响大小
的次序为:硝酸钠>葡萄糖>碳酸氢钠>尿素.因此,
对生长影响最大的是碳酸氢钠,对脂类含量影响最大
的是硝酸钠.
表3 不同培养条件下巴氏杜氏藻 HL-1收获时的平均
比生长速率、生物量、脂类含量和脂类产率
Tab.3 Cel growth rate,biomass,lipid content and lipid
productivity of D.bardawil HL-1under different conditions
编号
比生长速率/
d-1
生物量/
(g·L-1)
脂类含量/
%
脂类产率/
(mg·L-1·d-1)
1 0.146 0.87 19.8 8.6
2 0.151 0.93 20.5 9.6
3 0.141 0.83 19.3 8.0
4 0.152 1.03 21.4 11.0
5 0.154 1.02 19.0 9.6
6 0.146 0.97 18.8 9.1
7 0.131 0.82 21.2 8.1
8 0.134 0.78 17.5 6.8
9 0.149 0.92 20.4 9.3
3 讨 论
杜氏藻可吸收利用CO2、HCO3 及各种形式的有
机碳.添加一定量的碳源能促进杜氏藻的生长.安彩
华[34]发现添加不同的有机碳源和无机碳源对杜氏藻
的生长都起着明显的促进作用,其中促进最明显的为
2.0g/L醋酸.本研究也同样发现添加几种碳源后都
能不同程度促进巴氏杜氏藻 HL-1的生长,在 6
mmol/L的碳酸氢钠浓度下获得最大细胞密度1.18
×107 mL-1,比对照组提高32.8%.在有机碳源中,汪
本凡[27]及孙俊楠等[13]研究发现葡萄糖对杜氏藻的促
进作用更明显,而魏娟等[35]认为葡萄糖对杜氏藻细胞
数量的增加效果不明显,但对其胞内甘油积累有显著
促进作用.本研究结果表明添加葡萄糖、甘油、醋酸钠
都能促进巴氏杜氏藻的生长,但醋酸钠的促进效果不
及葡萄糖和甘油.Hard等[36]证明在光照条件下,甘油
通过主动运输被细胞吸收利用,并且甘油为杜氏藻细
胞内甘油循环的重要底物;而葡萄糖被藻细胞吸收
后,既能为藻提供碳源和能量,又能转化为果糖或其
他小分子参与细胞各个代谢过程.
胞内脂类物质的积累是当藻细胞遭遇营养盐限
制等外界环境胁迫时产生的一种保护措施[37-39].微藻
在适宜环境条件下可利用碳源合成蛋白质,而当氮源
等营养盐缺乏时,藻细胞就会减少甚至阻断非必需蛋
白质和核酸的合成而增加脂类物质的合成[40],因此,
脂滴作为碳源和能源的储存场所,是藻细胞生存和抵
御恶劣环境的机制.本试验中,巴氏杜氏藻的培养条
件较为理想,培养基各组分含量丰富,因此,藻细胞吸
收营养重点用于生长增殖和增加生物量,而胞内脂类
含量变化不大;在添加葡萄糖为碳源的试验组中,由
于葡萄糖可能更容易被巴氏杜氏藻吸收造成了生物
量大幅增加(较对照组增加了21.6%),而脂类物质呈
下降趋势的结果.正交试验结果表明,通过碳源及氮
源的组合互补,虽然不能显著提高脂类含量,但有利
于巴氏杜氏藻的生长.在微藻大规模生产中,提高生
长速率既缩短了生产周期,又降低了培养过程中不可
预知的风险,而脂类含量的提高则相对比较容易获
得,所以微藻培养中补充碳源十分重要.
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The Influence of Carbon Resources on the Growth
and Lipid Content of Dunaliellabardawil
YU Ya-cen1,2,QIAN Ling2,LIU Guang-fa2,GAO Ya-hui 1,2,
JIA Li-shan3,LIANG Jun-rong2,CHEN Chang-ping1,2*
(1.Shenzhen Research Institute of Xiamen University,Shenzhen 518057,China;
2.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China;
3.Colege of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)
Abstract:For mass production of bio-fuel,the economic feasibility of microalgal culture greatly depends on the productivity of bio-
mass and lipids.We have studied the effects of sodium bicarbonate,glucose,glycerin and sodium acetate on the growth and lipid con-
tent of Dunaliella bardawil HL-1.The results showed as folows:1)Carbon could promote the growth of the D.bardawil HL-1
and the promotion effect would diminish in high concentration instead of inhibiting the growth.The effects of concentrations of sodi-
um bicarbonate on growth were significant,with an increase by 32.8%compared to the control.2)The biomass of D.bardawil HL-
1could increase with low concentrations of different carbon sources,and when the concentration of glucose was 1mmol/L,the maxi-
mum biomass was obtained,which was 21.6%higher than the control.However,with the increase of concentrations,biomass turned
to decrease.3)The lipid content of D.bardawil HL-1was slightly effected by glycerol,sodium acetate and sodium bicarbonate at low
concentrations,while with concentrations up to 12mmol/L,the difference was extremely significant compared to other cases.4)In
the orthogonal test,there was no significant difference between those treatments.The growth rate ranged from 0.131to 0.154d-1,
biomass ranged from 0.78to 1.03g/L,and lipid content fluctuated between 17.5%and 21.4%.The concentrations of sodium ni-
trate,urea,sodium bicarbonate,and glucose were 15,1,6,4mmol/L respectively for the highest growth rate.Therefore,it was neces-
sary to add carbon sources to obtain both high growth rate and lipid productivity during Dunaliellaculture.
Key words:carbon sources;Dunaliella bardawil;growth;lipid
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