全 文 ：分子标记在兰花遗传育种中的研究进展
黄有凯1，2，陈 程1，汪 天1，张水明1* (1．安徽农业大学园艺学院，安徽合肥 230036;2．合肥一中，安徽合肥 230036)
摘要 综述了 RFLP、RAPD、SCAR、ISSR、SRAP、AFLP、SSR等分子标记的基本原理和主要特点，从遗传多样性分析、亲缘关系研究、种质
资源鉴定、遗传图谱构建与辅助选择育种等方面介绍了分子标记在兰花遗传育种工作中的现状及其研究进展，并提出展望。
关键词 分子标记;兰花;遗传育种
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)12 －06996 －05
Research Advances in the Application of Molecular Markers in the Genetic Breeding of Orchid
HUANG You-kai et al (College of Forestry and Landscape，Anhui Agricultural University，Heifei，Anhui 230036)
Abstract This paper reviews the basic principle and main characteristics of several molecular markers，including RFLP，RAPD，SCAR，IS-
SR，SRAP，AFLP and SSR，then introduced the research status and advances of these molecular markers in the genetic breeding of orchids
from genetic diversity，genetic relationship，germplasm resources appraisal，construction of genetic map and assisted selection breeding，and
finally forecasted the future of molecular markers research．
Key words Molecular markers;Orchids;Genetic breeding
基金项目 安徽省自然科学基金项目(11040606M95)。
作者简介 黄有凯(1970 － ) ，男，安徽宣城人，硕士，中教一级，从事生
物物理研究，E-mail:huangyoukai@ sohu． com。* 通讯作者，
副教授，博士，硕士生导师，从事园林植物与观赏园艺研究，
E-mail:zhangshuiming@ ahau． edu． cn。
收稿日期 2012-01-17
分子标记技术是一种新型的遗传标记，它以 DNA 分子
的多态性为基础，是反映生物个体或种群间基因组中某种差
异特征的 DNA 片段，是分子水平上遗传变异的直接反映。
20世纪80年代以来，该技术得到了飞速的发展，现已有数10
种标记技术，与传统的遗传标记相比，其优越性体现在:直接
以 DNA形式表现，在植物体的各个组织、不同发育时期均可
检测到，不受季节、环境条件限制，不存在表达与否的问题;
数量极多，遍及整个基因组;多态性高，自然存在着许多等位
变异，不需专门创造特殊的遗传材料;表现为“中性”，即不影
响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁;有许多分子
标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，
提供完整的遗传信息［1］。由于其有众多优点，近年来已广泛
应用于园艺植物分子育种研究［2］。
兰花(Orchid)是整个兰科植物(Orchidaceae)的总称，它
是有花植物中科最大的植物种类之一，全世界约有 800 多
属，25 000多种，分布于世界各地，大多数种类分布于东南
亚、澳大利亚、中南美洲、非洲和马达加斯加。我国野生兰花
资源丰富，约有 173属 1 200多种以及大量的变种，在南北各
地均有分布，但以云南、台湾、海南最为丰富［3］。由于兰科植
物变异大，中间类型多，种的界限不清楚，且目前主要的育种
方法仍是传统的驯化育种，导致我国兰花品种选育进展缓
慢，不能满足日益增长的市场需求［4］。
利用兰花分子标记技术进行遗传育种，将有助于对我国
兰花种质资源的分类鉴定。研究其遗传多样性，可揭示品种
间的亲缘关系，为分子标记在兰花遗传育种上的应用奠定基
础。该研究综述了几种分子标记的基本原理、主要特点以及
其在兰花遗传育种中的研究进展。
1 主要的分子标记种类和基本原理
1． 1 以分子杂交为核心的标记技术———限制性片段长度多态
性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
RFLP的概念于 1980 年由人类遗传学家 Botstein 等首次提
出［5］，是最早应用的分子标技术。其基本原理是基因组 DNA
在限制性内切酶作用下，由于不同物种中酶切位点的差别，
或是酶切位点上的核苷酸的变化，产生大小不等的 DNA 片
段，用特异 DNA探针进行 Southern杂交，通过放射显影来揭
示 DNA的多态性。该标记呈孟德尔式共显性遗传，结果稳
定可靠，重复性好。目前其主要应用于遗传图谱构建、基因
定位及遗传多态性分析，但该标记对 DNA的要求较高，涉及
探针标记和分子杂交等，操作繁琐，技术复杂;多态性较少;
成本高;有放射性;其多态性依赖于内切酶的使用。这些在
很大程度上影响了该标记在育种领域的推广应用。
1． 2 以 PCR技术为核心的标记技术 1985年，美国 PE-Ce-
tus公司的 Mullis 等发明了聚合酶链式反应(Polymerase
Chain Reaction，PCR) ，该技术的出现使得体外扩增 DNA 片
段成为可能。由于 PCR具有检测快速、对模板 DNA需要量
小等特点，基于该技术的分子标记技术相继出现。
1． 2． 1 随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphic
DNA，RAPD)标记。RAPD 标记是 1990 年由 Williams 和
Welsh同时提出［6 －7］，其基本原理是以一个随机的寡核苷酸
序列为引物(通常为 10 bp) ，通过 PCR扩增基因组 DNA，产
生不连续的 DNA产物，经电泳分离后检测扩增产物的多态
性。该技术操作简单;模板 DNA用量少(15 ～25 ng) ;无放射
性。目前 RAPD标记已广泛用于种质资源鉴定与分类、目的
基因的标记等研究中。其缺点是标记多为显性标记，不能鉴
别杂合子和纯合子;试验稳定性差。
1． 2． 2 序列特异性扩增区域(Sequence Characterized Ampli-
fied Region，SCAR)标记。SCAR 标记是由 Paran 和 Michel-
more在 RAPD标记基础上提出的［8］。其基本原理是先对特
异 RAPD等片段进行回收、克隆和测序，再依据其两端的特
异序列设计特异引物进行 PCR 扩增。该标记为共显性遗
责任编辑 王春艳 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(12):6996 － 7000
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.12.211
传;稳定性和可重复性高。目前已被广泛用于辅助选择育
种、抗病基因连锁定位、构建 QTL、种质鉴定和种子纯度检验
等方面。
1． 2． 3 ISSR标记。简单重复序列间扩增由 Zietkiewicz等于
1994年提出［9］。该技术检测的是 2 个 SSR 之间的一段短
DNA序列上的多态性，其基本原理是利用真核生物基因组中
广泛存在的 SSR设计引物，对基因组 DNA 进行多位点 PCR
扩增。该标记为显性标记，具有无需预知基因组序列、DNA
样品用量少、多态性丰富、操作简单、试验稳定性较高等特
点，已被运用于种质收集、品种鉴定、遗传多样性分析、遗传
作图、基因定位、标记辅助选择等研究中。
1． 2． 4 相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified
Polymorphism，SRAP)标记。2001 年 Li 和 Quiros 正式提出
SRAP为新一代分子标记［10］。它是针对基因外显子里 GC含
量丰富而启动子和内含子里 AT含量丰富的特点来设计引物
对 ORFs(Open Reading Frames)进行扩增，SRAP引物包括一
个 17个碱基的正向引物(F-primer)和一个 18个碱基的反向
引物(R-primer) ;扩增结果因不同个体的内含子、启动子以及
间隔区长度不等而产生多态性［11］。该标记具有简便、稳定、
中等产率、便于克隆目标片段等特点。目前，SRAP已用于植
物的遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位、比较基因组
学等领域。
1． 2． 5 扩增片段长度多态性(Amplified Fragments Length
Polymorphism，AFLP)标记。AFLP是 1992年由 Zabeau和 Vos
发明的一项 DNA 指纹技术［12］。其基本原理是选择性扩增
基因组 DNA的酶切片段。技术流程是先对基因组 DNA 进
行酶切，所得酶切片段上连接双链人工接头作为模板，再通
过接头序列和 PCR 引物 3端选择性碱基序列的识别，进行
选择性 PCR扩增。由于不同材料的 DNA酶切片段长度存在
差异而产生了扩增产物的多态性，最后经聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测DNA片段多态性。AFLP技术实质上是RFLP和 PCR
两项技术的结合［13］。该标记为共显性或显性，稳定性强，重
复性好;结果可靠;多态性丰富。AFLP标记技术已经在生物
遗传连锁图谱构建、指纹图谱绘制与品种鉴定、遗传多样性
分析及基因定位等方面得到了广泛应用。但该标记对 DNA
纯度和内切酶的质量要求较高;涉及酶切和连接，步骤繁琐，
对技术要求相对较高。
1． 2． 6 简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)标记。
SSR也称微卫星(Microsatellite)DNA［14］，由人类遗传学家 Litt
等建立的一种新型分子标记技术［15］。它是以 1 ～4个碱基为
重复单元的简单重复序列，如(GA)n，(AC)n，(GAA)n 等。
SSR在真核生物基因组 DNA 中分布广泛，其基本原理是根
据 SSR两端保守序列设计一对特异性引物来扩增 SSR片段，
由于基因组中 SSR重复长度和次数的不同而引起扩增产物
的大小差异，最后经电泳检测多态性。SSR 为共显性标记，
采用 PCR检测时 DNA样品用量少，且对 DNA的质量要求不
高，同时，该标记还具有数量丰富、多态性高、试验程序简单、
特异性强、重复性好，易于用 PCR检测等优点。目前主要用
于资源鉴定、遗传多样性分析、连锁图的绘制、基因定位、
DNA指纹图的绘制、标记辅助育种等方面。缺点是必须依赖
测序设计引物。然而近年来，随着公共数据库的发展，大量
的 SSR引物序列已经可以直接在公共数据库中查找到，因此
SSR分子标记的应用越来越广泛。
1． 3 新型的分子标记技术
1． 3． 1 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，
SNPs)标记。Lander于 1996第一次正式提出 SNPs为新一代
分子标记［16］。SNPs是由染色体基因组水平上单个核苷酸的
变异(替换、插入、缺失等)引起的基因序列多态性。该标记
的开发首先需要对全基因组测序(公用数据库的发展，节省
了测序的工作) ，然后根据测序结果确定特定的序列标记位
点，对 STS(sequence taged site)进行扫描寻找 SNPs位点，最
后确定 SNPs，将其定位到染色体上。
SNPs标记分布广泛，在人类基因组中大约 1 000 bp 中
出现一次［17］，其具有多态信息量大;稳定性高;易于快速、高
通量地进行基因型分析;检测速度快;为功能型分子标记等
特点。随着关联分析方法和芯片技术的发展，奠定了该标记
在种质资源的 DNA 指纹分析、品种鉴定、分子标记辅助选
择、遗传图谱构建、关联分析及其在解析不同作物复杂数量
性状遗传网络等方面的应用。
1． 3． 2 表达序列标签(Expressed Sequence Tags，ESTs)标记。
ESTs是指通过对 cDNA 文库中随机克隆进行测序所得的
cDNA5或 3端序列，一般长度为 150 ～ 500 bp［18］。自从 Ad-
ams等［19］首次提出 EST概念后，EST技术取得了飞速发展，
1991年各个公共数据库中的 EST 数目不足 2 000 条。1993
年，美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotech-
nology Information，NCBI)建立了一个专门的 EST 数据库
dbEST(data base of EST)来收集和保存所有的 EST数据。到
2011年 11月 1日，NCBI中的 dbEST数据库已收集 2 323 种
物种的 ESTs，共 71 235 293条。
EST标记依据其开发的方法不同可分为 5 类:EST-SSR
标记;EST-PCR 标记;EST-SNP 标记;EST-AFLP 标记;EST-
RFLP标记。以 EST为基础的分子标记具有信息量高，易于
开发和通用性好等特点［20］。由于 EST标记表现出的巨大潜
力，目前已在遗传图谱的构建、基因定位、生物群体多态性研
究等工作中广泛运用。
综上所述，各种分子标记技术都有其自身的优缺点。随
着生物信息学、基因芯片等新技术的快速发展以及各种分子
标记技术相互结合使用，必将不断地开发出分析速度更快、
信息量更大、成本更低的分子标记用于植物遗传育种领域。
2 分子标记技术在兰花遗传育种中的研究进展
2． 1 遗传多样性分析 物种的遗传多样性是长期进化的产
物，也是种质资源创新和品种改良的物质基础。利用分子标
记技术对种或品种间 DNA水平上的多态性信息进行统计分
析，可从分子水平提供遗传变异的证据，较为全面地掌握现
有种质资源的遗传多样性。国内外对兰花遗传多样性的研
究也开展了很多工作。
799640 卷 12 期 黄有凯等 分子标记在兰花遗传育种中的研究进展
谢伟等［21］用 RAPD技术对兰属 7 个种的 9 个品种进行
遗传多样性和亲缘关系分析。从 60 个随机引物中筛选出 6
个引物，检测到 64 个位点，其中多态位点 61 个(95． 3%)。
聚类分析结果表明，不同兰花品种之间存在明显的遗传差
异。胡薇等［22］应用 RAPD标记对建兰 38个品种的遗传多样
性和亲缘关系进行分析。用筛选的 18 个 10 bp随机引物对
其 DNA进行 PCR扩增，共扩增出 116个位点，其中多态位点
103个(88． 79%) ，表明建兰 38 个品种具有丰富的遗传多样
性。甘娜等［23］利用 RAPD标记系统评价了大花蕙兰 20个品
种的遗传多样性。在 50 个 RAPD 引物分析中，有 36 个
(72. 0%)引物能揭示材料间的多态性。根据遗传相似系数
进行聚类分析表明，RAPD标记能将所有材料区分开。
赵谦等［24］采用 ISSR分子标记技术对 14 个蝴蝶兰品种
进行品种间遗传关系的研究。筛选出的 14个引物共扩增出
179条带，其中多态性条带 147 条(82%)。吴振兴等［25］将
ISSR技术应用于 16种兰属的遗传多样性分析，15 个引物共
扩增出 836条带，其中有 227 条多态带(27． 2%)。UPGMA
聚类结果显示:春兰与春剑的亲缘关系最近，而兔耳兰与其
他 15种兰属植物的距离最远。
Lu FB等［26］用 SRAP标记分析蝴蝶兰“Frigdaas Oxford”
自交后代的遗传多样性。蝴蝶兰“Frigdaas Oxford”花朵黄
色，带有红紫色斑点，自交后代个体在数量、大小及斑点分布
上均有很大的差异。用 SRAP 标记分析后代中的 159 个个
体，从 594个供试的 SRAP引物组合中共筛选出 14个多态性
引物组合，扩增出 80条多态性条带。经 UPGMA树状图谱显
示，159个个体可被分成 12 簇。Cai XY 等［27］用 SRAP 标记
分析了中国濒危兰花“Dendrobium loddigesii Rolfe”的遗传多
样性和种群结构。利用 SRAP 标记来评估 D． loddigesi 的 7
个种群的遗传多样性水平和模式，17 个 SRAP的引物组合共
扩增出 231 条清晰的带，其中 187 条(80. 95%)为多态性条
带。在物种水平上检测出的遗传多样性的高水平是多态性
为 80. 52%。UPGMA聚类将种群分为 2大簇。
朱根发等［28］对来源于日本、韩国和美国的 42个大花蕙
兰品种和 2个国产兰属原生种进行了遗传多样性和亲缘关
系的 AFLP分析，9对多态性引物共扩增出 1 597 条带，其中
多态性带 1 565条(98． 0%) ，表明大花蕙兰品种间的遗传多
样性丰富。Duffy KJ 等［29］用 AFLP 标记和 4 个质体 SSR 标
记检测来自爱尔兰的兰花 P． albida的种内和种间遗传差异，
并且把该兰花品种的 SSR数据与 P． straminea做比较。AFLP
结果分析显示 P． albida有高度的多态性;在种内和种间有显
著差异，这种差异伴随着距离上的种群遗传隔离而增加。
SSR标记分析显示无种内、种间差异，但所有的爱尔兰个体
与 P． straminea有相同的等位基因。因而，要评价 P． albida /
P． straminea的分类地位，需要进一步的研究。
2． 2 分类与亲缘关系研究 研究兰花的分类及亲缘关系对
育种有着重要的指导意义。在育种上，通常选择亲缘关系较
远的材料，以增加后代的遗传变异，从而选育出杂交优势强、
综合性状好的优良品种。分子标记所代表的是基因组 DNA
水平上的差异，因而利用分子标记研究兰花的分类及亲缘关
系具有结果客观、稳定的优点。
孙彩云等［30］利用 RAPD 分子标记分析中国兰属(Cym-
bidium)的 28个原生种，3个变种，16个品种及 3个杂交种共
50个材料间的亲缘关系，获得 250 条可明显区分的 DNA 扩
增片段。UPGMA进行聚类分析显示，RAPD 的聚类树状图
所呈现出的亲缘关系大体与 ITS 系统发育树一致。建兰亚
属可能为一个自然类群。大花亚属并非自然类群，其成员之
一文山红柱兰偏离出去而与兰亚属聚在一起。兰亚属则为
一个高度异质性的类群，分散成互不关联的 3 支。李冬梅
等［31］利用 RAPD分子标记对 10个墨兰叶艺品种进行亲缘关
系分析。从 100 个随机引物中筛选出 17 个多态性高的引
物，共扩增出 159 条 DNA 带。UPGMA 聚类分析结果表明，
墨兰叶艺品种间的亲缘关系与形态学分类结果基本一致，且
与品种来源地密切相关。李冬梅等［32］利用 RAPD标记方法
对来自日本、韩国、中国和美国的 48个大花蕙兰品种和 2 个
国产兰属原生种的种质资源亲缘关系进行了检测。从 100
个 10 bp随机引物中筛选出 20个多态性高的引物，共扩增出
258条 DNA带。UPGMA聚类分析将 50 份种质划分为 5 大
类群。供试 50份种质间的遗传亲缘关系与其来源地、花色、
花枝类型和杂交系谱有一定的相关性。
Shen TsaiMu等［33］利用 RAPD和 ISSR分析了 11个台湾
当地登入的蝴蝶兰和 17个菲律宾蝴蝶兰的遗传差异和内部
关系。结果从 200个 RAPD引物和 100 个 ISSR引物中分别
筛选到12和3个引物，获得了95个RAPD标记和50个 ISSR
标记，根据所得的 RAPD和 ISSR数据进行聚类分析，可把它
们分为 6组。
吴振兴等［34］利用 RMAPD技术对兰属 16种植物进行了
亲缘关系研究，所得结论与 Du Puy＆Cribb 分类系统基本一
致，表明该标记能在分子水平上对传统兰属分类进行补充。
李敏等［35］利用 ISSR技术分析 16 个蝴蝶兰品种的亲缘
关系，筛选出的 8个引物共扩增出 193 条片段。聚类分析结
果表明，来源于不同地域的16个品种在遗传距离 L =0． 222 5
处可分为 2个类群;来源于日本、台湾的品种聚类为一簇，新
育成的品种为一簇。严华等［36］以 5种国兰的 38个品种为试
验材料，进行了 ISSR 分子标记分析。从 100 条随机引物中
筛选出 10条引物，共扩增出 89 条 DNA片段。利用 UPMGA
法对遗传相似系数进行分析并构建系统树，聚类结果与传统
分类基本一致。
张俊祥等［37］采用 AFLP技术对云南兰属的 14 个种和 3
个变种的 38个样本进行亲缘关系分析，在相似系数 0． 58 的
水平下，将 38个样本分成 3组。
2． 3 种质资源鉴定 种质资源是遗传育种和品种改良的基
本材料。近 10年来，随着兰花育种新方法新技术的不断出
现，育种进程明显加快，品种急剧增加，这就对品种鉴定提出
了更高的要求。用传统的植物鉴别方法来对一些疑难种、易
混种进行鉴别，往往很难得出正确有效的结论。而分子标记
技术以其稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变
8996 安徽农业科学 2012年
异及试验结果的可靠性等优点为品种鉴定提供了新手段。
季祥彪等［38］采用 272 个 RAPD 标记，对贵州 12 种兰属
植物进行研究。结果表明，引物 S13，S26及 S139扩增的谱带
多、清晰、多态性明显，它们单独及结合使用，能有效地将所
有供试种类区分开来。蹇黎等［39］应用 ERAPD(延长随机引
物扩增)对 21 个中国兰花品种进行分子鉴定。结果表明，
RAPD分析中共有 8 个(10%)引物和 88 条(83． 81%)多态
性带纹;ERAPD 分析中能获得 1 条 2． 5 kb RAPD 特异性
片段。
Yung WS等［40］将基于 ITS(internal transcribed spacer)序
列开发的 SCAR标记用于蝴蝶兰濒危物种 P． armeniacum、P．
micranthum、P． delenatii及其杂种的鉴定。由于这 3个物种和
它们的杂种很难从形态学上区分开来，故利用 rDNA-ITS 序
列设计物种专一性的 SCAR 标记对其进行鉴定。结果显示
在 P． armeniacum上开发出的标记有效的扩增出的 DNA产物
大小为 600 bp，在 P． micranthum上扩增出的为 700 bp，在 P．
delenatii上扩增出的为 300 bp。通过将开发出的 3 种 SCAR
标记用于 PCR扩增试验，进一步证实了物种专一性标记的
有效性。
赵谦等［24］采用 ISSR分子标记技术对 14 个蝴蝶兰品种
进行品种间遗传关系的研究。筛选出的 14个引物组合可区
分该 14个品种，并且检测到 20 条品种特异性条带，这些品
种特异条带可用于鉴定供试蝴蝶兰中的 10个品种。UPGMA
聚类分析表明，14个品种可聚为 2类。
陈惠云等［41］利用 AFLP分子标记技术对 18种名贵春兰
品种进行了DNA指纹图谱分析，筛选出的16对引物在18个
名贵春兰品种中共扩增出 345 条带，其中有多态性带 169 条
(48． 99%) ;通过这些多态性条带的不同组合，对供试春兰品
种的区分率为 100%。
2． 4 遗传图谱构建 遗传图谱既是遗传研究的重要内容，
又是种质资源分析、遗传育种及分子克隆等许多应用研究的
理论依据和基础。近年来，分子标记的迅速发展大大促进了
遗传连锁图的构建和应用。各种分子标记技术的出现使各
种植物的遗传图谱越来越完整，在建立起完整的高密度的分
子图谱后，可将其有效地应用于质量、数量性状的基因定位、
图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研
究中，加速植物育种进程。
兰花遗传图谱的构建工作已经开展，谢伟等［42］利用随
机扩增多态 DNA技术(RAPD)对兰属的 3 个品种春兰、春
剑、蕙兰进行了分析研究，建立了它们之间的 DNA 指纹图
谱，找到了参试样品的特征谱带，并探讨了它们之间的亲缘
关系。结果从 20条 BA系列引物中筛选出能稳定扩增的 10
个引物，对 3个品种的植株进行扩增，共扩增出 257 条，其中
243条具有多态性，结果分析表明春剑与春兰的相似系数高
于其与蕙兰的相似系数。黄少玲［43］利用 RAPD标记构建了
一张包含 9个连锁群、由 121个标记位点组成的春石斛分子
遗传图谱，图谱总长度 6 568． 7 cm，标记间平均距离为 50． 11
cm，连锁群长度变动在 128． 8 ～ 1 043． 0 cm之间。标记最多
的连锁群有 21个标记，最少的有 3个。
谭文澄等［44］采用 LZF-1 寡核苷酸探针和限制性内切酶
Hinf 1，检测兰属23个样株和石斛属1个样株的DNA酶解片
段，获得了由 6 ～ 15 条带组成的清晰的特异性遗传指纹
图谱。
2． 5 辅助选择育种 分子标记辅助选择育种(Molecular
Marker Assisted Selection，MAS)是利用与目标性状基因紧密
连锁的分子标记对个体进行优势基因型的筛选。作为辅助
育种的分子标记可以通过连锁标记对目的性状进行早期间
接选择，对某些不期望性状能及时发现和淘汰，减少回交育
种时的连锁累赘，大大缩短育种周期，实现多个重要性状和
基因的累加，这是在常规育种中不可能实现的。
王健等［45］采用 BA 系列的 100 条随机引物，对 16 种有
香和无香春兰进行 RAPD 分析，结果显示其中引物 BA0088
(G08)对香花春兰的扩增产物中具有一条 370 bp的特异性
条带，带型清晰，重复性较好，这为进一步确定与香味成分相
关基因连锁的 RAPD标记打下了基础。
3 展望
分子标记已经被广泛应用于遗传育种中。随着分子生
物学的进一步发展，分子标记技术在兰花育种领域的运用将
更加广泛和深入，该技术准确、可靠和高效率的优点也在实
践中充分表现出来。在与传统育种技术相结合的基础上，利
用和开发更为高效的分子标记方法(例如 EST-SSR标记)成
为兰花分子标记育种研究的重点之一。
应用分子标记技术从遗传多样性分析、分类与亲缘关系
研究、种质资源的分子鉴定、遗传图谱构建、辅助选择育种等
各个方面对兰花品种进行深入广泛的研究，可为兰花新种发
现与名品鉴赏、育种和杂交亲本的选择提供丰富的分子水平
上的依据。各种分子标记技术相互渗透使用及其与特异基
因的分离克隆和转基因等技术的相结合，将为兰花育种工作
奠定技术基础。
参考文献
［1］贾继增．分子标记种质资源鉴定和分子标记育种［J］．中国农业科学，
1995，29(4):1 －10．
［2］方宣钧，吴为人，唐纪良．作物 DNA标记辅助育种［M］．北京:科学出版
社，2001:721．
［3］陈心启，吉占和．中国兰花全书［M］．北京:中国林业出版社，2003:70 －
99．
［4］王卜琼，李枝林，余朝秀．兰花育种研究进展［J］．园艺学报，2005，32
(3):551 －556．
［5］BOSTEIN D． Construction of a genetic linkage map in man using restriction
fragment length polymorphisms［J］． Am J Hum Cenet，1980，32:314 －331．
［6］WILLIAMS J G，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al． DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］． Nucleic
Acids Research，1990，18(22):6531 －6535．
［7］WELSH J，MCCLELLAND M． Fingerprinting genomes using PCR with ar-
bitrary primers［J］． Nucleic Acids Research，1990，18(24):7213 －7218．
［8］PARAN I，MICHELMORE R W． Development of reliable PCR-based mark-
ers linked to downy mildew resistance genes in lettuce［J］． Theor Appl
Genet，1993，85:985 －993．
［9］ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D． Genome fingerprinting by
simple sequence repeat(SSR)anchored polymerase chain reaction amplifi-
cation［J］． Genomics，1994，20:176 －183．
［10］LI G，QUIROS C F． Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)． a
new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to
mapping and gene tagging in Brassica［J］． Theor Appl Genet，2001，103
999640 卷 12 期 黄有凯等 分子标记在兰花遗传育种中的研究进展
(2):455 －461．
［11］张彤，屈淑平，崔崇士． SRAP标记在蔬菜作物遗传育种中的应用［J］．
东北农业大学学报，2009，40(1):119 －122．
［12］ZABEAU M，VOS P． Selective restriction fragment amplification:a general
method for DNA fingerprinting:European，0534858A1［P］． 1993．
［13］VOS P R，HOGERS M，BLEEKER M． AFLP:a newconcept for DNA fin-
gerpinting［J］． Nucleic Acids Res，1995，23:4407 －4414．
［14］RAFALSKI J A，TINGEY S V． Genetic diagnostics in plant breeding:
RAPDs、microsatellites andmachines［J］． Trends Genet，1993，9(8):275 －
279．
［15］LITT M，LUTY J A． A hypervariable microsatellite revealed by in vitro
amplification of dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene
［J］． Am J Hum Cenet，1989，44:397 －401．
［16］LANDER E S． The new genomics． global views of biology［J］． Science，
1996，274:536 －539．
［17］CHASMAN D，ADAMS R M． Predicting the functional consequences of
non-synonym single nucleotide polymorphism:structurebased assessment
of aminoacid variation［J］． J Mol Biol，2001，307:683 －706．
［18］LUO M，JIA J Z． Progress in expressed sequence tags(EST)project of
plant genome［J］． Progress in Biochemistry and Biophysics，2001，28(4):
494 －497．
［19］ADAMS M D，KELLEY J M，GOCAYNE J D，et al． Complementary DNA
sequencing:expressed sequence tags and human genome project［J］． Sci-
ence，1991，252(5013):1651 －1656．
［20］ CHUBERT R，STARCK G M，RIEGEL R． Development of EST-PCR
markers and monitoring their intra populational genetic variation in Picea
abies(L．)Karst［J］． Theor Appl Genet，2001，103:1223 －1231．
［21］谢伟，乐超银，林直，等．兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分析［J］．
江苏农业学报，2005，21(4):369 －373．
［22］胡薇，黄儒珠，潘晓华，等．建兰 38个品种的 RAPD分析［J］．园艺学
报，2008，35(2):289 －294．
［23］甘娜，谭向红，陈其兵，等．应用 RAPD 标记和细胞质基因组 PCR-
RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性［J］．园艺学报，2006，33(2):
349 －355．
［24］赵谦，杜虹，庄东红，等． 14个蝴蝶兰品种遗传关系的 ISSR分析［J］．
植物研究，2008，28(2):227 －231．
［25］吴振兴，王慧中，施农农，等．兰属 Cymbidium植物 ISSR遗传多样性分
析［J］．遗传，2008，30(5):627 －632．
［26］LU F B，YU N，ZHAO X L，et al． Genetic diversity analysis of Phalaenop-
sis‘Frigdaas Oxford’using SRAP markers with reference to those genes
responsible for variations in the pigmentation of petals and sepals［J］．
Journal of Horticultural Science ＆ Biotechnology，2011，86(5):486 －492．
［27］CAI X Y，FENG Z Y，ZHANG X X，et al． Genetic diversity and population
structure of an endangered Orchid(Dendrobium loddigesii Rolfe)from
China revealed by SRAP markers［J］． Cientia Horticulturae，2011，129
(4):877 －881．
［28］朱根发，李冬梅，郭振飞．大花蕙兰遗传多样性及亲缘关系的 AFLP分
析［J］．园艺学报，2007，34(2):417 －424．
［29］DUFFY K J，FAY M F，SMITH R J，et al． Population genetics and conser-
vation of the small white orchid，pseudorchis albida，in irland［J］． Biology
and Environment Proceedings of the Royal Irish Academy，2011，111(2):
73 －81．
［30］孙彩云，张明永，叶秀粦，等．中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的
RAPD分析［J］．园艺学报，2005，32(6):1121 －1124．
［31］李冬梅，朱根发，叶庆生．墨兰“达摩”芽变叶艺品种亲缘关系的 RAPD
分析［J］．热带作物学报，2007，28(3):74 －77．
［32］李冬梅，叶庆生，主根发．大花蕙兰种质资源亲缘关系的 RAPD分析
［J］．中国农业科学，2007，40(4):800 －806．
［33］ZHUANG H T，SHEN Z M，YAN Y F，et al． Phylogenetic analysis of five
Phalaenopsisspecies native to Taiwan or the Philippines by using RAPD
and ISSR molecular markers［J］． Journal of the Chinese Society for Horti-
cultral Science，2004，50(2):175 －185．
［34］吴振兴，施农农，赵艳．应用 RMAPD分子标记技术研究兰属植物间的
亲缘关系(简报)［J］．分子细胞生物学报，2008，41(2):145 －149．
［35］李敏，王尧峰，明凤．用 ISSR分子标记技术分析16个蝴蝶兰品种的亲
缘关系研究［J］．中国农业科技导报，2010，12(1):60 －65．
［36］严华，张冬梅，罗玉兰，等． 38种国兰亲缘关系的 ISSR分析［J］．分子
植物育种，2010，8(4):736 －741．
［37］张俊祥，李枝林，范成明，等． 云南野生兰属主要种间亲缘关系的
AFLP分析［J］．园艺学报，2006，33(5):1141 －1144．
［38］季祥彪，王国鼎，康继川，等．贵州12种兰属植物资源形态学和 RAPD
标记的比较分析［J］．种子，2008，27(2):56 －59．
［39］蹇黎，武海，张以忠，等． 21 个兰花品种的延长 RAPD(ERAPD)和
PCR-RFLP分析［J］．中国农学通报，2010，26(14):232 －237．
［40］YUNG W S，YU J L，YIN S H，et al． Development of ITS sequence based
SCAR markers for discrimination of Paphiopedilum armeniacum，Paphio-
pedilum micranthum，Paphiopedilum delenatii and their hybrids［J］． Sci-
entia Horticulturae，2011，127:405 －410．
［41］陈惠云，张志栋，孙日飞，等． AFLP分子标记技术在名贵春兰鉴别中
的应用［J］．中国农学通报，2007，23(2):70 －73．
［42］谢伟，乐超银，郭政宏．兰花基因组 DNA多态性 RAPD分析［J］．湖北
农业科学，2006，45(1):24 －26．
［43］黄少玲．春石斛兰品种的倍性鉴定及 RAPD 分子遗传图谱的构建
［D］．武汉:华中农业大学，2007:36 －37．
［44］谭文澄，方盛国，谢海，等．兰属植物DNA指纹图的研究［J］．四川师范
大学学报:自然科学版，1999，23(4):407 －411．
［45］王健，乐超银，谢伟，等．兰花香味相关基因的 RAPD分子标记［J］．江
苏农业科学，2006(5):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
78 －79．
(上接第 6992页)
［18］AHSAN N，LEE D G，LEE S H，et al． Excess copper induced physiological
and proteomic changes in germinating rice seeds［J］． Chemosphere，2007，
67(6):1182 －1193．
［19］肖清铁，戎红，周丽英，等．水稻叶片对镉胁迫响应的蛋白质差异表达
［J］．应用生态学报，2011，22(4):1013 －1019．
［20］汤华，向福英，柳晓磊，等．植物铝离子胁迫的研究方法综述［J］．武汉
植物学研究，2007，25(5):494 －499．
［21］YANG Q，WANG Y，ZHANG J，et al． Identification of aluminum-respon-
sive proteins in rice roots by a proteomic approach:cysteine synthase as a
key player in Al response［J］． Proteomics，2007，7(5):737 －749．
［22］AHSAN N，RENAUT J，KOMATSU S． Recent developments in the appli-
cation of proteomics to the analysis of plant responses to heavy metals
［J］． Proteomics，2009，9(10):2602 －2621．
［23］LEE D G，AHSAN N，LEE S H，et al． A proteomic approach in analyzing
heat-responsive proteins in rice leaves［J］． Proteomics，2007，7(18):3369
－3383．
［24］HAN F，CHEN H，LI X J，et al． A comparative proteomic analysis of rice
seedlings under various high-temperature stresses［J］． Biochimica et Bio-
physica Acta(BBA)-Proteins ＆ Proteomics，2009，1794(11):1625 －1634．
［25］周伟辉，薛大伟，张国平．高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因
型和生育期差异［J］．作物学报，2011，37(5):820 －831．
［26］CUI S，HUANG F，WANG J，et al． A proteomic analysis of cold stress re-
sponses in rice seedlings［J］． Proteomics，2005，5(12):3162 －3172．
［27］LEE D G，AHSAN N，LEE S H，et al． Chilling stress-induced proteomic
changes in rice roots［J］． J Plant Physiol，2009，166(1):1 －11．
［28］IMIN N，KERIM T，WEINMAN J J，et al． Low temperature treatment at
the young microspore stage induces protein changes in rice anthers［J］．
Molecular ＆ Cellular Proteomics，2006，5(2):274 －292．
［29］颜华，贾良辉．植物水分胁迫诱导蛋白的研究进展［J］．生命的化学，
2002，22(2):165 －168．
［30］SALEKDEH G H，SIOPONGCO J，WADE L J，et al． Proteomic analysis of
rice leaves during drought stress and recovery［J］． Proteomics，2002，2
(9):1131 －1145．
［31］ALI G M，KOMATSU S． Proteomic analysis of rice leaf sheath during
drought stress［J］． J Proteome Res，2006，5(2):396 －403．
［32］SHEN S，JING Y，KUANG T． Proteomics approach to identify wound-re-
sponse related proteins from rice leaf sheath［J］． Proteomics，2003，3(4):
527 －535．
［33］ZANG X，KOMATSU S． A proteomics approach for identifying osmotic-
stress-related proteins in rice［J］． Phytochemistry，2007，68(4):426 －
437．
［34］KOMATSU S，MUHAMMAD A，RAKWAL R． Separation and characteriza-
tion of proteins from green and etiolated shoots of rice(Oryza sativa L．):
towards a rice proteome［J］． Electrophoresis，1999，20(3):630 －636．
［35］YANG P，CHEN H，LIANG Y，et al． Proteomic analysis of de-etiolated
rice seedlings upon exposure to light［J］． Proteomics，2007，7(14):2459
－2468．
［36］KIM D H，SHIBATO J，KIM D W，et al． Gel-based proteomics approach
for detecting low nitrogen-responsive proteins in cultivated rice species
［J］． Physiology and Molecular Biology of Plants，2009，15(1):31 －41．
0007 安徽农业科学 2012年