全 文 ：第 45 卷　第 2 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol. 45　No. 2
　2006 年 3 月 Journal of Xiamen Universi ty (Natural Science) M ar. 2006　
耐高温巴氏杜氏藻突变株的诱变和鉴定
　　
收稿日期:2005-04-30
基金项目:福建省科技计划重点项目(2003N053)资助
作者简介:黄瑞芳(1979 -),女 ,硕士研究生.
*通讯作者:liu gfl s@xmu. edu. cn
黄瑞芳 ,刘广发* , 周　韬 ,高亚辉
(厦门大学生命科学学院 , 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005)
摘要:采用紫外线辐射的方法对巴氏杜氏藻(Dunaliel la bardawi l)进行诱变. 经过夏日高温(42～ 52℃)筛选 , 得到一耐
高温的突变株 , 命名为 Dunalie lla bardawi l var. H-42 H uang & Liu(简称 H-42). 研究结果表明 , 在每天 42 ℃处理6 h 的
条件下 ,H-42 达到生长平衡期时藻细胞密度为初始密度的 4. 5 倍 , 而对照在第 5 天时细胞密度几乎降为零. 通过显微镜
观察并测量 ,证明突变株的细胞体积为(0. 65 ～ 1. 27)×10 - 15m3 ,是原出发株的 3. 0 ～ 3. 4 倍 .蛋白质 SDS-PAGE 电泳表
明 ,H-42 在大约 24 kD 和 30 kD处分别比对照多出一条新的蛋白带 ,同时在大约 26 kD处缺失一条蛋白带. RAPD 分析表
明两者的遗传相似系数为 0. 726. 由此我们认为 H-42 确为一耐高温的巴氏杜氏藻突变株.
关键词:巴氏杜氏藻;诱变;耐高温;遗传相似系数
中图分类号:Q 341　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:0438-0479(2006)02-0272-04
　　巴氏杜氏藻(Dunal iella bardawil)是一种单细胞
真核绿藻 ,属于绿藻纲(Chlorophyceae),团藻目(Vo l-
vocales),杜氏藻科(Dunaliellaceae), 杜氏藻属(Du-
naliel la).杜氏藻天然没有细胞壁 ,是迄今为止发现的
少数极端耐盐的真核生物之一. 巴氏杜氏藻富含 β-胡
萝卜素 、甘油和蛋白质 ,因此成为人类主要的养殖藻类
之一 ,在商业开发中具有很高的利用价值.巴氏杜氏藻
最适生长温度为25 ～ 30 ℃,当温度超过 35 ℃时 ,生长
完全被抑制 ,细胞逐渐死亡[ 1] . 我国南方夏季炎热高
温 ,巴氏杜氏藻难以露天养殖 ,如果能通过诱变获得耐
受高温的藻株 ,将对我国南方地区巴氏杜氏藻养殖具
有重要意义.
1　材料与方法
1. 1　藻种及培养方法
巴氏杜氏藻(Dunal iella bardawil),简称 Ba ,由
以色列 M . Ginzburg 博士惠赠 , 本实验室保存;D.
bardawil var. H-42 Huang &Liu(简称 H-42)系D.
bardawil经紫外线诱变并经高温筛选后获得 ,本实验
室保存.巴氏杜氏藻培养液为 Ben-Amotz人工海水培
养基[ 2] ,其中 N aCl 的浓度为 1. 5 mol /L. 在 24 h 光
照 ,光强 4 000 lx 的室温下培养. 在培养液中加入 0.
8%的琼脂即为巴氏杜氏藻固体培养基.
1. 2　试　剂
25个 10聚核苷酸随机引物 、丙烯酰胺 、甲叉双丙
烯酰胺均购自上海生工生物工程技术服务公司;Taq
DNA 聚合酶 、RNase A 购自大连宝生物公司;其它试
剂为国产分析纯试剂.
1. 3　巴氏杜氏藻的紫外线诱变和高温筛选
在培养皿中倒上一层培养至指数生长中期的 Ba ,
使之刚盖住皿底 ,置于 30 W紫外灯下 13 cm 处 ,照射
65 s后暗培养 48 h ,再移入盛有新鲜培养液的锥形瓶
中 ,正常光照培养 12 d. 将对照和诱变株各取 100 mL
藻液分别装在 250 mL 的锥形瓶中 ,每天从 10时至 17
时置于室外夏季强光下进行高温筛选 ,每隔 1 h 用温
度计测藻液温度 ,连续 7 d.将高温筛选下存活的藻细
胞扩大培养 ,吸取少量藻液涂布到巴氏杜氏藻固体培
养基上.挑取若干生长迅速的黄色单藻落扩大培养 ,检
测其诱变效果.
1. 4　突变株的形态观察与测量
将对照和突变株藻液分别制成简易装片 , 在
O LYMPUS显微镜下观察 、测量各 50个细胞的长径和
短径 ,根据文献[ 3]计算其体积.
1. 5　巴氏杜氏藻总 DNA 提取及 RAPD扩增
参照文献[ 4]的方法提取巴氏杜氏藻总 DNA ,并
以 25个 10聚核苷酸随机引物进行 RAPD扩增.
1. 6　巴氏杜氏藻总蛋白提取及 SDS-PAGE 电
泳
采用冻融裂解法提取藻蛋白 ,将提取的蛋白质进
行 SDS-PAGE 电泳[ 5] .分离胶浓度为 10%,浓缩胶浓
度为 4%,电泳结束后用考马斯亮蓝 R220染色 ,扫描并
记录结果.
1. 7　测定巴氏杜氏藻突变株在高温下的生长
曲线
将突变株与对照一同置于 24 h 光照培养箱中 ,每
天42 ℃处理6 h ,取样以血球记数板在 OLYMPUS显
微镜下直接计数藻细胞 ,每株藻计 3次 ,取平均值.
2　结果与分析
2. 1　高温筛选与藻株变化情况
突变巴氏杜氏藻的高温筛选从 2004 年 8月 4日
开始到 8月 10 日结束共 7 d. 期间测得午后最高培养
液温度达 52℃,每天 48. 0 ℃以上高温可维持至少 2. 5
h ,到 17时放回室内时藻液的温度仍在 38 ℃以上.高
温筛选时 ,前 2天对照 Ba藻液由绿色逐渐变为淡绿
色 ,第 3天 Ba藻液几乎无色 ,并出现大量白色絮状沉
淀 ,显微镜下未能发现完整的藻细胞 ,说明 Ba经受不
了高温考验大量死亡.突变株藻液第 2天绿色才变浅 ,
第 3天藻液变为黄绿色 ,以后逐渐成为浅黄色.镜检表
明 ,突变株中尚有少数耐高温的藻细胞存活.
2. 2　H-42和 Ba的细胞形态差异
将高温筛选下存活且经涂布在琼脂培养基上生长
最快的单藻落命名为 D. bardawil var. H-42 Huang
&Liu (简称 H-42). 连续培养 H-42 10 代以上 ,在
O LYMPUS显微镜下对细胞长径和短径的显微测量结
果见表 1.
表 1　H-42和 Ba的细胞形态比较
Tab. 1　Cell morpho log ical compa rison between H-42 and Ba
藻株 藻液颜色　　 细胞短径(a) /μm 细胞长径(b) /μm 细胞体积 /( 10 - 15 m3)
D. bardawil 绿色 7. 0～ 8. 5 8. 5～ 10. 0 0. 218 ～ 0. 378
D. bardawil va r. H-42 黄绿色 10. 0～ 12. 5 12. 5～ 15. 5 0. 654 ～ 1. 267
　　　　　　注:巴氏杜氏藻细胞体积公式[ 3] :Cell volume = 4 /3π[ a /2] 2[ b /2] .
从表 1 可见 ,突变株 H-42无论是细胞短径还是
细胞长径都比对照长一半左右.经计算 ,前者的细胞体
积相当于后者的 3. 0 ～ 3. 4倍 ,增大的效果非常明显.
2. 3　42 ℃处理 H-42和 Ba藻细胞密度的变化
实验观察 ,在每天 42 ℃处理 6 h的条件下 , H-42
藻细胞的密度逐渐增大 ,到第 7天藻细胞的密度达到
最高值为 3. 68×106 个 /mL ,是起始密度的 4. 5倍 ,以
后细胞密度稍有下降(图 1).而对照 Ba 除了在第 1天
藻细胞的密度稍有增长外 ,从第 2天开始细胞密度急
剧下降 ,到第 5天细胞密度几乎接近于零.因此我们认
为 ,诱变得到的巴氏杜氏藻 H-42 是能耐相对高温的
藻株.
　　t /d
　图 1　每天 42 ℃处理 6 h H-42 和 Ba 的生长曲线
　F ig . 1　The g row th curv e o f H-42 and Ba exposured to
42 ℃ fo r 6 h per day
　图 2　H-42 和 Ba的蛋白质 SDS-PAGE 电泳图谱
　F ig . 2　SDS-PAGE analy sis of total pro tein of H-42 and
Ba
2. 4　H-42和 Ba的蛋白质 SDS-PAGE 电泳分
析
通过两者的蛋白电泳图谱(图 2)可以看到 , H-42
在大约24 kD和 30 kD处分别比对照多出一条新的蛋
白带 ,同时在大约 26 kD 处缺失一条蛋白带(箭头指
处).
2. 5　RAPD扩增结果
利用 25个随机引物进行扩增 ,每个引物至少重复
进行两次 PCR反应 , 7个引物产生不清晰和无法检测
的产物 ,18个能产生多态性条带. 从中遴选条带清晰 、
273 第 2 期　　　　　　　　　　　　　　　黄瑞芳等:耐高温巴氏杜氏藻突变株的诱变和鉴定
　图 3　H-42 和 Ba的 RAPD扩增图谱
M:Marke rs;每个引物下对应的左侧泳道为 Ba ,右侧为 H-42
　Fig . 3　RAPD profile of H-42 and Ba
重复性良好的 12个引物进行正式扩增.实验共检测到
146个位点 ,扩增所得到的条带大小在 250 ～ 2 000 bp
之间 ,其中 10条引物扩增出差异条带(图 3).
根据 Nei M 等[ 6 ] ,计算相关株系间遗传相似系数
I =2N ij /(N i +N j). 式中 N i +N j 为两样品经过随
机引物扩增后总显示的带数 , N ij为两样品共有的显示
带数.根据表 2计算 H-42和 Ba的遗传相似系数 I 为
0. 726.
表 2　10 聚核苷酸随机引物序列及其扩增结果
　Tab. 2　A list o f the sequences of random primer s and the
amplification results
引物 序列 总扩增带数 共有带数
S260 ACAGCCCCCA 15 6
S262 ACCCCGCCAA 20 7
S263 GTCCGGAGTG 14 6
S264 CAGAAGCGGA 14 5
S265 GGCGGATAAG 10 4
S266 AGGCCCGATG 8 4
S267 CTGGACGTCA 10 5
S275 ACACCGGAAC 14 4
S276 CAGCCTACCA 15 4
S277 GTCCTGGGT T 10 3
S278 TTCAGGGCAC 4 1
S279 CAAAGCGCTC 12 4
总计 12 146 53
由于 H-42 和 Ba 的蛋白电泳图谱和总 DNA 的
RAPD的分析结果都具有较高的相似性 ,可见 H-42
的确源自 Ba ,但两者也存在着明显的差异. 按照 Lane
M A
[ 7] 的观点和张会勇等[ 8] 的研究结果 ,把 H-42称
为 Ba 的变种是合理的.
3　讨　论
巴氏杜氏藻具有很高的经济价值 ,迄今为止其养
殖方式仍以露天浅池为主. 在华南(厦门)盛夏室外光
照十分强烈(可达 10 000 lx),每天强光下水温超过 42
℃的时间长达 6 h左右.我们将突变株置于室外光照
下进行筛选 ,其作用因子包括极强的光照 、高温和紫外
线 ,这是实验室内筛选难以做到的.所获得的能够耐受
42 ℃达 6 h的巴氏杜氏藻 H-42 , 将可能适应夏季室
外养殖的要求 ,为在我国南方露天养殖巴氏杜氏藻奠
定了良好的基础.
我们取指数生长期中期的巴氏杜氏藻进行诱变 ,
是因为这段时期正是藻细胞分裂旺盛的时期.在细胞
分裂的 S期 ,染色体松散成极细的染色丝 , DNA 解旋
进行复制[ 9 , 10] ,此时以紫外线辐射细胞 ,容易形成胸腺
嘧啶二聚体 ,再经 48 h 暗培养 ,获得了良好的诱变效
果.
在高温筛选过程中 ,突变株藻液由绿色逐渐转为
黄色 ,橘黄色 ,其主要原因是因为在高温下藻液蒸发使
溶液盐度显著升高 ,满足了巴氏杜氏藻转向大量合成
β-胡萝卜素代谢三要素中的两项(强光 、高盐),从而导
致胞内 β-胡萝卜素的累积.
H-42之所以能耐高温 ,原因可能有两个:一方面 ,
细胞膜中饱和脂肪酸含量升高 ,降低了膜的流动性 ,增
加了膜的稳定性 ,从而提高了 H-42耐高温的能力;另
一方面可能是突变株在遇到高温时产生了热休克反
应 ,迅速在转录水平上表达一系列热休克基因 ,进一步
翻译成热休克蛋白 ,使细胞酶系受到保护并促使细胞
从热休克中恢复[ 11] .其中不排除某些热休克蛋白本身
可能就是细胞膜上饱和脂肪酸代谢所需的酶类.也许 ,
后者是前者发生的原因.
274 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2006 年
H-42的体积比对照大 3倍多 ,这是一个令人感兴
趣的问题.体积大 ,表面积与体积的相对比例(比表面
积)则小 ,从而使细胞内外的代谢水平较低 ,这或许也
是 H-42能耐受较高温度的一个原因. 此外 ,收获微藻
是微藻养殖中一个比较棘手的问题 ,较大的藻细胞将
使其收获更加容易些.
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Mutation and Identification of the Mutant of Dunaliel la bardawil
Resistant to High Temperature
HUANG Rui-fang , LIU G uang-fa* , ZHOU Tao , GAO Ya-hui
(Key Labora tory of the M inistry o f Education fo r Ce ll Bio lo gy and Tumor Cell Engineering ,
School of Life Science s , Xiamen Univer sity , Xiamen 361005 , China)
Abstract:A mutant str ain o f Dunaliella bardawil resistant to high tempera ture (42 ℃) has been iso lated and evalua ted by ultra-
violet radia tion and high temperature screening under summer strong sunlight. The mutant is denomina ted as Dunaliella bardaw il
var. H-42 Huang & Liu. The re sult of the detection o f g rowth curve under 42 ℃ fo r 6 h pe r day indica ted tha t the cell concentration
of the mutant at the stationary phase w as about 4. 5 times that of it s initia l cell density . Meanw hile the control w as almost died when
it w as cultivated 4 day s under the same condition. The data o f micro-measurement indicated tha t the cell vo lume of the mutant str ain
was (0. 65～ 1. 27)×10- 15 m3 , which was 3. 0 to 3. 4 times tha t of the contro l. I n contr ast to the contro l , the mutant w as de tected
two new electropho resis bands with about 24 kD and 30 kD and one disappearing band w ith 26 kD by SDS-PAGE. The RAPD test
revealed that the genetic similarity between D. bardawi l and its mutant strain w as 0. 726. So all the ev idence mentioned above
proved that the D. bardaw il var. H-42 w as a mutant strain f rom D. bardaw il and prov ided a new cha racter of resistant to high tem-
pera ture.
Key words:Dunalie lla bardawi l;mutant;resistant to high tempera tur e;genetic similarity
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