全 文 ：第 27卷第 2期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 27, No. 2
2005年 4月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis A pr. , 2005
文章编号:1000 - 2286(2005)02 - 0257 -05
长筒石蒜花被片 DNA的提取
及 ISSR体系的建立
邓传良 ,周 坚*
(南京林业大学 森林资源与环境学院 ,江苏 南京 210037)
摘要:以长筒石蒜为例 , 探讨了花被片 DNA的提取方法。并在此基础上 , 确立其 ISSR反应程序及体系 。反应
程序为:94 ℃预变性 3 m in, 进入 38个 PCR循环(94 ℃变性 30 s, 58 ℃复性 30 s, 72 ℃延伸 90 s), 最后于
72 ℃延伸 7 m in。扩增反应总体积为 20 μL:1 ×Taq酶扩增缓冲液 , 1. 5 mm o l /LM g2+, 200 μmo l /L dNTP, 0. 5
μm o l /L随机引物 , 0. 5 U Taq聚合酶 , DNA模板 10 ～ 30 ng。
关键词:长筒石蒜;花被片;ISSR
中图分类号:Q813. 4　　文献标识码:A
A Study on the Perianth DNA Extraction and Optmi ization of
ISSR Reaction System in Lycoris long ituba
DENG Chuan - L iang, ZHOU Jian*
(Co llege of Forest Re sources and Environment, Nan jing Fo re stry University, N an jing 210037, China)
　　Abstract:The perianth DNA ex traction me thod w as de lved into tak ing Lycoris longituba as example.
Based on this, su itable ISSR reaction programme and sy stem we re established. DNA amplifica tion w as pro-
grammed fo r an in itia l 94 ℃ 3m in, follow ed by 38 cycles of 94℃ 30 s, 58℃ 30 s and 72 ℃ 90 s, and en-
ded w ith 72℃ 7m in. The ISSR reaction system , name ly 20μL reaction system con tained 1 ×PCR bu ffe r,
1. 5mmo l /LM gC l2 , 200μmol /L dNTP, 0. 5 μmo l /L primer, 30 ng DNA temp late and 0. 5 U Taq DNA po l-
ymerase.
Key words:Lycoris longituba;perianth;ISSR
ISSR( inter - simp le sequence repea t)技术主要是以一条与微卫星(SSR s)序列互补的并在 3’或 5’端
含有 2 ～ 4个随机碱基的 DNA序列为引物对基因组 DNA进行 PCR扩增的一种新型分子标记技术[ 1] 。
与 RAPD技术相比 , ISSR标记的实验稳定性更好 、检测到的多态性更高[ 2] 。目前 ,它已经广泛应用于玉
米 、油菜 、小麦 、水稻 、葡萄 、红薯 、小米 、柑橘等植物的遗传多样性或品种鉴定等研究 [ 3 ～ 8] 。
石蒜属 (Lycoris)植物是单子叶植物中颇为特殊的类群 ,主要表现在:不同种的发叶期存在着显著差
异 ,一部分种于秋末发叶而另一部分则于初春展叶 ,物候期相差数月 ,故区分为秋出叶种和春出叶种两
类 ,但他们的开花期却基本一致 。并且 ,石蒜属植物不但具有很高的药用价值 ,而且是很好的地被和切
花植物 [ 9] 。因此 ,要对其进行开发和利用 ,其野生种质资源的研究势在必行。而传统的采集叶片进行
收稿日期:2004 - 11 - 09
基金项目:国家科技部 “ 863”项目(2002AA241051)
作者简介:邓传良(1975 -), 男 ,博士生 , 主要从事植物发育生物学研究。 * 通讯作者:周坚 , E -m a il:zjian@publi-
clp t.t js. cn。
DOI牶牨牥牣牨牫牳牫牰牤j牣j jau牣牪牥牥牭牥牭牳
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 27卷
表 1　PCR正交设计
Tab. 1　Orthoronal design for PCR
编号
因素
M g2+
/mm o l L - 1
dNTP
/μm o l L - 1
引物
/μm o l L - 1
1 2. 5 250 0. 50
2 2. 5 200 0. 25
3 2. 5 150 0. 75
4 2. 0 250 0. 25
5 2. 0 200 0. 75
6 2. 0 150 0. 50
7 1. 5 250 0. 75
8 1. 5 200 0. 50
9 1. 5 150 0. 25
DNA提取的方法 ,一是时间跨度大 ,需要春秋两个季节;二是不能很好地反映其变异类型 ,因为其变异
主要表现在花色与花型上 。因而 ,为了快捷有效地进行石蒜属种质资源分析 ,本实验以长筒石蒜为例 ,
探讨了花被片 DNA提取的方法 ,并在此基础上 ,建立了其 ISSR扩增体系 。
1　材料与方法
1. 1　材料
长筒石蒜花被片采集于江苏句容 ,材料分两种方法保存:一种是硅胶干燥室温保存 ,另一种是新鲜
花被片用冰壶拿回实验室 ,放置于 - 70 ℃冰箱中 。
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA的提取　采用改良 CTAB[ 10]和硅珠悬浮[ 11]两种方法分别对不同保存方式的材料进行
DNA提取 。
(1)改良 CTAB法 。取适量样品液氮研碎 ,移入离心管 ,加适量提取液 (2 ×CTAB)摇匀 ,提取液预
热到 65 ℃(在加样前 ,往提取液中加 φ=2%巯基乙醇 )。水浴 30 m in ,每隔 5 m in摇动离心管 1次。取
出离心管 , 4 ℃ 10 000 r /m in离心 10m in。取上清液 ,加等体积的氯仿∶异戊醇 (24∶1),摇匀成乳白色 ,
10 000 r /m in离心 10m in。取上清液 ,再加等体积的氯仿∶异戊醇 (24∶1), 10 000 r /m in离心 10m in。
然后再取上清加 1 /10体积的 NaAC ,摇匀后加二倍体积的无水乙醇 ,于 - 20 ℃放置 1 ～ 2 h(过夜 )沉淀
核酸。取出 10 000 r /m in离心 2 m in。弃上清 ,用 500μL φ=70%乙醇洗涤 2次 ,每次 10 m in, 500 μL
无水乙醇洗涤 1次 ,自然晾干至无酒精味 。然后溶于 100 μL 0. 1 ×的 TE中 ,于 -20 ℃冰冻保存 。
(2)硅珠悬浮法。取适量样品液氮研碎 ,移入离心管 ,加适量提取液(2×CTAB)摇匀 ,提取液预热
到 65 ℃(在加样前 ,往提取液中加 φ=2%巯基乙醇)。水浴 45m in,每隔 5 m in摇动离心管 1次 。冷却
至室温 , 4 ℃ 10 000 r /m in离心 10 m in。取上清液 ,加等量酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1),混匀 , 10 000 r /
m in离心 10 m in。再取上清液 ,加硅珠悬浮液 (1 /10体积 ),轻轻涡旋。静置 15 m in, 6 000 r /m in,离心
15 s,弃上清液 。加 300 μL漂洗液 , 6 000 r /m in,离心 15 s,弃上清液 ,将沉淀弹开。然后再次加 300 μL
漂洗液 , 6 000 r /m in,离心 15 s,弃上清液 ,将沉淀弹开。在沉淀中加入 φ=70%乙醇 300 μL,涡旋混
匀 , 6 000 r /m in,离心 15 s。然后再在沉淀中加入 φ=70%乙醇 300 μL, 涡旋混匀 , 6 000 r /m in离心
15 s。弃上清液加 φ=100%乙醇 300 μL,涡旋混匀 , 6 000 r /m in离心 15 s。弃上清液 ,自然风干 ,加
100 μL 0. 1×TE溶解弹开 ,涡旋混匀 。 56 ℃水浴 15 m in , 12 000 r /m in离心 2m in,取上清液 ,置于另一
小离心管中 ,于 - 20 ℃保存。
(3)DNA检测 。取适量样品 , 于 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,天能 UV - 2000系列紫外分析仪中
300 nm紫外灯下观察并照相。
1. 2. 2　 ISSR扩增 　参考张露等[ 12] RAPD扩增程
序 ,而略有改动 ,确定初始程序:94 ℃预变性 3m in,
进入 40个 PCR循环 (94 ℃变性 30 s, 52 ℃复性
30 s, 72 ℃延伸 90 s),最后于 72 ℃延伸 7 m in。扩
增反应总体积为 20 μL:10 ×Taq酶扩增缓冲液
2 μL, 3 μL M g2+ ( 20 mmo l /L ), 0. 4 μL dNTP
(dATP、dCTP、dGTP、 dTTP各 10mmol /L), 1 μL随
机引物 (O peron公司产 , 10μmmo l /L), 0. 75 U Taq
聚合酶 (上海 Promega公司), DNA模板 10 ～ 30 ng。
(1)Mg2 +、 dNTP、引物浓度的优化 。在确定最
佳退火温度的情况下 ,参考文献 [ 13]确定 Mg2+、
dNTP、引物浓度 3种因素。选用正交表 ,设计 PCR
各反应成分的因素水平及正交试验表 (表 1)。
258
第 2期 邓传良等:长筒石蒜花被片 DNA的提取及 ISSR体系的建立
改良 CTAB法提取 DNA 硅珠悬浮法提取 DNA
图 1　花被片 DNA提取的两种不同方法
F ig. 1　Two d iffe rent DNA ex traction m e thods o f Lycoris longituba
图 2　 ISSR - PCR正交试验设计结果
F ig. 2　E lectropho re sis of ISSR -PCR o rthoronal design (using prim er ISSR - 5)
表 2　PCR正交实验设计
Tab. 2　O rthoronal design for PCR
编号
因素
循环次数 /次 Taq酶浓度 /U
1 40 0. 50
2 40 0. 75
3 40 1. 00
4 38 0. 50
5 38 0. 75
6 38 1. 00
7 35 0. 50
8 35 0. 75
9 35 1. 00
　　以上 9个处理 ,每个处理 3次重复 ,共 27个 PCR管 ,按表 1加样。反应体系总体积为 20 μL,除上
述变化因素外 ,每管中还含有 1×PCR Buffer, 1 μL随机引物 , 0. 75 U Taq聚合酶 , DNA模板 10 ～ 30 ng。
(2)退火温度的优化。设定退火温度:60℃、58 ℃、56 ℃、54 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃,共计 7个温
度梯度 ,每个梯度重复 3次 。
(3)Taq酶浓度与循环次数的优化。在确定上述变
化因素的基础上 ,进一步确定 Taq酶浓度与循环次数 。
由于这两个因素都与条带的清晰有关 ,作者设计这两个
因素的正交实验 (表 2)。
以上 9个处理 ,共计 9个反应。反应体系总体积为
20 μL,除上述变化因素外 ,每管中还含有 1×PCR Bu ff-
er, 1 μL随机引物 , DNA模板 10 ～ 30 ng。
1. 2. 3　DNA的两种不同提取方法对 PCR扩增的影响　
在对 ISSR体系优化的基础上 ,本文比较了不同 DNA提
取方法对 PCR扩增的影响 。
2　结果与分析
2. 1　DNA提取方法比较
对于长筒石蒜花被片硅胶干燥材料 ,改良 CTAB和
硅珠悬浮法都能很好地进行 DNA的提取 ,其结果见图 1。而直接从冷冻保存的叶片中提取的 DNA含
量低 ,电泳条带模糊不清(图略 ),质量不如前种 。说明野外冷藏 、冷冻保存的材料并不能保证 DNA不
受损伤 。因此 ,长筒石蒜花被片材料的保存以硅胶干燥为佳 。
2. 2　ISSR体系的建立
2. 2. 1　正交试验确定 Mg2 +、dNTP及引物浓度的最佳组合　由图 2可以看出 , Mg2+浓度对扩增的影响
是非常明显的。当 Mg2+浓度为 2. 5 mmo l /L时 ,特异性弱 ,背景强 (1 ～ 3)。当 Mg2 +浓度为 2. 0mmo l /L
时 ,扩增条带增多 ,特异性也较弱 (4 ～ 6)。当 Mg2+浓度为 1. 5mmol /L时 ,扩增特异性强 ,条带清晰 (7
～ 9)。因此 ,确定本次实验 Mg2 +浓度为 1. 5mmol /L。
259
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 27卷
图 3　不同退火温度对扩增的影响(引物 ISSR -5)
F ig. 3　The effect o f annea l temperatu re on ISSR amp lifica tion
(using prime r ISSR - 5)
图 4　循环次数与 Taq酶浓度组合对扩增的影响(引物 ISSR - 5)
F ig. 4　The effec t of cyc le size and Taq enzym e concen tra tion on ISSR
amp lification (using prim er ISSR - 5)
图 5　DNA不同提取方法对扩增的影响( ISSR -5)
F ig. 5　The effe ct of different DNA ex traction m ethods on ISSR
amp lification (using prim er ISSR - 5)
　　在确定 Mg2 +浓度的基础上 ,我们比
较 dNTP浓度与引物浓度的组合 ,表明
dNTP为 200 μmol /L, 引物浓度为 0. 50
μmo l /L时 ,条带多而清晰 。
2. 2. 2　不同退火温度对扩增的影响　
由图 3可见 ,退火温度较低时 ,除主带
外 ,杂带较多 ,背景很高(48 ～ 56 ℃);随
着退火温度的升高 ,引物与模板的特异
性增强 , 但扩增条带减少 (60 ℃)。因
此 ,确定退火温度为 58 ℃。
2. 2. 3　循环次数与 Taq酶浓度组合对
扩增的影响　由图 4可知 ,当循
环次数为 40时 (1 ～ 3),非特异
性产物增多 ,背景强。而当循环
数为 36时(7 ～ 9),分子量小 、拷
贝少的片段不清晰。因此 ,我们
选定 38为本次实验的循环数 。
而比较 Taq酶浓度 ,当浓度为 0. 5
U时(4),条带最为清晰。因此 ,
确定 Taq酶浓度为 0. 5 U。
2. 3　DNA两种不同提取方法对
扩增的影响
由图 5可知 ,两种 DNA提取
方法对 ISSR扩增反应影响挺大
的 。从扩增结果来看 ,硅珠悬浮
法与改良 CTAB法比较起来 , 前
者条带丰度明显高于后者 。对于
RAPD , DNA的纯度与浓度影响
不大 [ 14] ;而对于 ISSR,其 DNA的
纯度对扩增的影响是非常明显
的 。因此 ,在用改良 CTAB法进
行 DNA提取中 ,要先纯化 ,然后再进行 ISSR扩增 。
3　讨　论
M g
2 +浓度 、dNTP及引物浓度都是 PCR扩增中非常重要的影响因素 。Mg2+是 Taq DNA聚合酶实现
其聚合反应所必需的。但 Mg2 +最终反应浓度还会受到体系中其它成分尤其是 dNTP的影响 ,因此 ,
M g
2 +浓度的确定应同时考虑这些因素 。 dNTP会对 Mg2+产生拮抗作用 ,主要原因是 dNTP分子中的磷
酸基团能定量地与 Mg2+结合 ,使实际反应中 M g2 +的浓度下降。另外 Mg2+浓度对反应的特异性和扩增
效率都有影响。Mg2+浓度过高会使非特异性扩增产物增加 ,过低则使扩增产物减少 。而 dNTP是 PCR
的原料 ,浓度过高产生错误掺入 ,浓度过低效率过低 。而引物浓度太低不能扩增 ,浓度太高产生新的扩
增带。如何优化这些因素是成功的关键 ,本次实验经过综合比较 , Mg2+浓度为 1. 5mmol /L、dNTP为
200 μmo l /L、引物浓度为 0. 50 μmo l /L。
循环数决定着扩增程度 ,在其它参数已优化的条件下 ,最适循环数取决于靶序列的初始浓度 ,过多
的循环会增加非特异性扩增产物的数量和复杂性(平台效应),循环数太少 , PCR产物量就会极低 ,扩增
带太弱而不利于观察 。而 PCR扩增产物的质和量与 Taq酶的活力 、浓度密切相关 。比较表明 ,循环次
260
第 2期 邓传良等:长筒石蒜花被片 DNA的提取及 ISSR体系的建立
数为 38, Taq酶浓度为 0. 5 U。
经过研究 ,我们确定了长筒石蒜花被片 ISSR的反应程序及反应体系 ,分别为:94 ℃预变性 3m in,
进入 38个 PCR循环(94 ℃变性 30 s, 58 ℃复性 30 s, 72℃延伸 90 s),最后于 72 ℃延伸 7 m in。扩增
反应总体积为 20 μL:10×Taq酶扩增缓冲液 2 μL, 1. 5 μL M g2+(20 mmol /L), 0. 4 μL dNTP(dATP、
dCTP、dGTP、dTTP各 10 mmol /L), 1 μL随机引物 (Ope ron公司产 , 10 μmmo l /L), 0. 5 U Taq聚合酶 (上
海 Promega公司 ), DNA模板 10 ～ 30 ng。
参考文献:
[ 1] Z ietkiw icz E, Rafa lshi A, Labuda D. Genome fingerp rinting by sim ple sequence repea t(SSR) - ancho red po lym erase chain
reac tion amp lification[ J] . G enom ics, 1994, 20:176 ～ 183.
[ 2]W olffK, Z ie tk iew icz E, H ofstra H. Identifica tion of chrysanthem um cultivars and stab ility o f DNA fingerprint pa tterns[ J] .
Theo rApplG enet, 1995, 91:439 ～ 447.
[ 3] A jibades S R, W eeden N F, Ch ite S M. Inte r simp le sequence repeat analysis of gene tic re la tionsh ips in the genus vigna
[ J] . Euphy tica, 2000, 111:47 ～ 55.
[ 4] Huang J C, SunM. Genetic diversity and re lationships o f swee tpo ta to and its w ild re lative s in Ipomoea seriesBa tatas(Conv-
o lvu laceae) a s revea led by inter - sim ple sequence repeat( ISSR) and restriction ana lysis o f chlorop last DNA [ J] . Theo rAp-
p lGene t, 2000, 100:1 050 ～ 1 060.
[ 5] B la irM W , Panaud O, M cCouch. Inter - sim ple sequence repea t( ISSR) amp lification fo r ana ly sis o fm ic rosa tellitem o tif fre-
quency and finge rprinting in rice(Oryza sativa L. )[ J] . Theor Appl Gene t, 1999, 98:780～ 792.
[ 6]M oreno, M artin J P, O ritiz JM. In te r sim ple sequence repea tPCR fo r characterization o f c lose ly rela tedGrapev ine germp lasm
[ J] . Euphy tica, 1998, 101:117 ～ 125.
[ 7] Fang D Q , K rueger R R, Roose M L. Phy logene tics rela tionships am ong selec tedCitrus germplasm accessions revea led by
inter - sim ple sequence repea t( ISSR)m arke r[ J] . J Am er Soc Ho rt Sc i, 1998, 123(4):612 ～ 617.
[ 8] Akag i H, Yokozeki Y, Inagaki A, e t a.l A co - dom inan tDNA m arker close ly linked to the rice nuc lea r resto re r gene, Rf -
1, identified w ith in te r- SSR finge rprinting[ J] . G enom e, 1996, 39:1 205 ～ 1 209.
[ 9]鲍海鸥 , 陈波红. 石蒜属植物资源的开发利用 [ J] .中国野生植物资源 , 2000(5).
[ 10]邹喻苹 , 葛颂 , 王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记 [M ] . 北京:科学出版社 , 2001.
[ 11]史全良 , 诸葛强 , 黄敏仁 ,等. 用 ITS序列研究杨属各组之间的系统发育关系 [ J] . 植物学报 , 2001, 43(3):323 ～
325.
[ 12]张露 , 蔡友铭 , 诸葛强 ,等. 石蒜属种间亲缘关系 RAPD分析 [ J] . 遗传学报 , 2002, 29(10):915 ～ 921.
[ 13]王彦华 , 侯喜林 , 徐明宇. 正交设计优化不结球白菜 ISSR反应体系研究 [ J] . 西北植物学报 , 2004, 24(5):899 ～
902.
[ 14]汪小全 , 邹喻苹 , 张大明 ,等. RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题 [ J] . 植物学报 , 1996, 38(12):954
～ 962.
261