全 文 ：基金项目：国家自然科学基金“我国云南热带、亚热带地区含羞草、决明和羊蹄甲根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究”(30570001)。
第一作者简介：刘晓云，女，1968年出生，甘肃镇原人，副教授，博士，主要从事微生物系统学及微生物应用研究。通信地址：071002河北省保定市五
四东路180号河北大学生命科学学院，Tel：0312-5079696，E-mail：liuxiaoyunly@126.com。
收稿日期：2011-11-16，修回日期：2012-01-13。
含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类
及16S rDNA PCR-RFLP分析
刘晓云，魏 爽，刘庆辉，王立江，郭振国，郅慧梅
（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）
摘 要：为揭示云南省豆科植物根瘤菌的资源多样性，采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA
全序列分析技术对云南省8个地区含羞草、山蚂蝗等几种不同豆科植物分离的48株根瘤菌菌株进行了
遗传和表型多样性研究。16S rDNA PCR产物经HinfⅠ、MspⅠ、RsaⅠ和HaeⅢ 4种内切酶消化后产生
22种遗传图谱类型；数据经MVSP3.0软件聚类后，所有供试菌株在70%的相似性水平上分为4个分支，
经16S rDNA全序列分析，确定分支Ⅰ为伯克霍尔德属(Burkholderia)类群，含1株菌株；分支Ⅱ为贪铜菌
属(Cupriavidus)类群，含5株菌株；分支Ⅳ为根瘤菌属(Rhizobium)类群，包括29株菌株；而分支Ⅲ没有和
参比菌株聚在一起，经测序为狭长平胞属(Stenotrophomonas)类群。通过对菌株的抗生素抗性、耐盐性、
生长温度范围、BTB产酸产碱反应以及对3-酮基乳糖利用情况共计28个表型性状测定，结果显示所有
菌株耐盐性较强，多数菌株可耐受60℃的高温。实验表明，分离自云南省的这些菌株具有丰富的遗传和
表型多样性。
关键词：含羞草；山蚂蝗；根瘤菌；数值分类；16S rDNA PCR-RFLP分析
中图分类号：Q939.1 文献标志码：A 论文编号：2011-3383
Numerical Taxonomy and 16S rDNA PCR-RFLP of Rhizobia of Some Legumes Isolated
from Mimosa spp. and Desmodium spp.
Liu Xiaoyun, Wei Shuang, Liu Qinghui, Wang Lijiang, Guo Zhenguo, Zhi Huimei
(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding Hebei 071002)
Abstract: In order to characterize the diversity and phylogeny of rhizobium in Yunnan of China, 48 strains
isolated from root nodules of Mimosa spp. and Desmodium spp. in 8 regions of Yunnan Province were studied
with numerical taxonomy, 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rDNA gene sequencing analysis. 23 genotype
profiles were obtained from the fingerprinting of the 16S rDNA PCR-RFLP by four restriction endonucleases
Hinf Ⅰ, Msp Ⅰ, Rsa Ⅰ and Hae Ⅲ. These strains were clustered into 4 branches at the similarity level of
70% by MVSP3.0 software. 16S rDNA sequencing revealed that branch Ⅰ belonging to the genera of
Burkholderia, include 1 strain; branch Ⅱ belonging to the genera of Cupriavidus, include 5 strains; branch Ⅳ
belonging to the genera of Rhizobium, include 29 strains; branch Ⅲ belonging to the genera of
Stenotrophomonas with no reference strains. The analysis of 28 phenotypic characteristic of these strains
showed that most of these strains had a high level resistance to saline, some strains could grow under severe
environment such as high content ration of antibiotics (300 μg/mL) and high temperature (60℃). All the results
demonstrated a high genetic and phenotypic diversity of rhizobium nodulating legumes of Yunnan Province.
Key words: Mimosa; Desmodium; Rhizobium; numerical taxonomy; 16S rDNA PCR-RFLP
中国农学通报 2012,28(15):135-141
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
0 引言
根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系固氮效率高，
在自然界的氮素利用中发挥着重要的作用。因此无论
从生物固氮方面还是从环境的可持续发展方面来讲，
对根瘤菌资源的研究尤为重要[1-3]。现代根瘤菌系统发
育关系主要建立在 16S rRNA基因序列基础之上，可
以准确的确定根瘤菌的系统发育地位。而 16S rDNA
PCR-RFLP技术在研究根瘤菌的遗传多样性方面因其
简便快捷的特点，应用已较成熟，与16S rDNA全序列
分析结果具有很好的一致性[4-5]。徐琳[6]、李香香[7]等用
16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法研
究了中国西北部分地区草木樨和苦马豆根瘤菌、陕西
太白尾矿豆科植物根瘤菌；也有研究者以此 2种方法
研究了中国豇豆和绿豆根瘤菌、南方部分豆科植物根
瘤菌。2种方法的结合，揭示了供试菌株的遗传多样
性并确定了部分菌株的分类地位[8-10]。
云南省位于中国西南边陲，自然资源得天独厚，豆
科植物种类繁多，素有“植物王国”的美誉，为系统研究
根瘤菌的多样性提供了丰富的资源。根瘤菌与豆科植
物形成的共生固氮体系是生物固氮的重要途径，对保
护生态环境和维持自然界的氮素循环尤为重要，挖掘
和揭示根瘤菌的多样性可为生物固氮的理论和应用研
究提供菌株资源。为此，笔者以分离自云南省 8个不
同地区的根瘤菌为材料，采用16S rDNA PCR-RFLP技
术结合数值分类方法，对含羞草、山蚂蟥等根瘤菌进行
了初步研究，以期发现并保存表型及遗传型特异的根
瘤菌资源，同时研究其根瘤菌的分类地位。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本实验以采自云南盈江、元谋的山蚂蟥、合欢、含
羞草等豆科植物的根瘤为材料，其采集号、宿主植物及
采集地详见表 1。选取其中 48株供试菌株进行 16S
rDNA PCR-RFLP分析，30株供试菌株进行数值分类
研究，其中参比菌株 5 株，分别为 Cupriavidus
taiwanensis LMG19424T， Burkholderia mimosarum
LMG23256T，Rhizobium leguminosarum USDA2370T，
Burkhlolderia Caribensis LMG18531T 和 Burkhlolderia
phymatum LMG21445T。
1.2 方法
1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP分析 DNA的提取步骤参
见 文 献 [11]。 以 总 DNA 为 模 板 ，引 物 P1：
5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3，
其序列为对应于E.coli 16S rDNA基因第 8~37碱基位
置 ；P6：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC
C-3，其序列为对应第 1479~1506碱基位置 [12]。进行
16S rDNA扩增[13]。用 4种限制性内切酶 HinfⅠ、Msp
Ⅰ、RsaⅠ和HaeⅢ对扩增产物进行了消化[14-15]，20 μL
的酶切体系，37℃水浴酶切过夜。酶切产物经2%琼脂
糖凝胶电泳(120 V，2 h)，并用凝胶成像系统(SCIM)检
测，照相。
1.2.2 16S rDNA 的 全 序 列 测 定 及 分 析 根 据
16S rDNA PCR-RFLP聚类分析结果，选取各个类型的
代表菌株进行16S rDNA全序列测定。16S rDNA PCR
产物由北京康为生物技术有限公司测定。
1.2.3 性状测定和数值分类 选取 30株代表菌株对其
进行抗生素抗性测定，包括对氨苄青霉素、卡那霉素、
氯霉素的抗性反应；耐盐性测定，盐浓度1%~5%；耐酸
碱性测定，pH分别为 4、9、10、11；生长温度范围测定，
分别为 4、10、37、60℃；BTB产酸产碱反应以及对3-酮
基乳糖利用情况共计28个表型性状测定[16-18]。
1.3 数据统计分析
将 16S rDNA测得的全序列与GenBank上已知根
瘤菌的序列用BioEdit进行比对，结果保存为Mega文
件格式，之后用Mega4.1软件计算各个菌株之间的遗
传距离并用构建系统发育树。
将全部 48个供试菌株的 PCR-RFLP的图谱根据
条带的有无，转换成“1”和“0”的二元数据，用
MVSP3.0软件采用平均连锁法[19]聚类得到供试菌株的
PCR-RFLP聚类树状图。
对生理生化中测定的结果按阳性记为“+”，阴性
记为“-”，不确定的记为“N”。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA PCR-RFLP分析
48株供试菌株与 5株参比菌株提取总DNA后，
PCR扩增其16S rDNA，检测结果均得到1.5 kb左右的
条带。扩增产物经 4种限制性内切酶消化后，分别得
到了不同的酶切谱带，4种限制性内切酶消化后共有
22种不同的遗传图谱类型（表 1），表明供试菌株的
16S rDNA酶切图谱类型存在较大的差异性，这也就说
明其基因具有丰富的遗传多样性。
将图谱信息得到的数据构成树状图（图 1），可以
看出，所有供试菌株在 70%水平上共分为 4个系统发
育分支，分支Ⅰ与含羞草伯克霍尔德菌Burkholderia
mimosarum LMG23256 聚 在 一 起 ，仅 有 菌 株
SWF67519位于这一分支内，分离自中国的云南盈江
县含羞草属植物。分支Ⅱ与台湾贪铜菌Cupriavidus
taiwanensis LMG19424聚在一起，其中有 SWF66450、
SWF66441等 5株菌株位于这一分支内，分别来自云
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刘晓云等：含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及 16S rDNA PCR-RFLP分析
南绿石林、云南勐腊县、云南盈江县，全部分离自含羞
草属植物。分支Ⅲ没有和参比菌株聚在一起，为未知
分 支 。 分 支 Ⅳ 与 豌 豆 根 瘤 菌 Rhizobium
leguminosrum USDA2370聚在一起，这是最大的一个
分支，大部分菌株位于这一分支内，采集地点包括云
南景洪江，云南省元谋县、云南普洱市、云南盈江县 4
个县市，分离自山蚂蝗属、合欢属、苜蓿属、灰毛豆属
和豇豆属等豆科植物，来源地点较广泛，宿主种类多
样。
2.2 16S rDNA全序列相似性分析
在 16S rDNA PCR-RFLP的分析结果中选取群Ⅰ
菌株 SWF67519、群Ⅱ菌株 SWF66441、SWF66450、群
Ⅲ菌株 SWF66542、群Ⅳ菌株 SWF67591，共 5株代
表菌株进行 16S rDNA的全序列测定。所测序列与
GenBank上的部分已知种模式菌株的序列进行比
对，构建以 16S rDNA为基础的系统分类树状图（图
2）。从图 2中结果可看出，4株待测菌株的全序列
分析结果与 16S rDNA PCR-RFLP的分析结果是一
致 的 。 SWF67519 归 在 了 伯 克 霍 尔 德 属
(Burkholderia)系统发育分支，SWF66450、SWF66441
归在了贪铜菌属 (Cupriavidus)系统发育分支，
SWF67591归在了根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分
支 ， SWF66542 归 在 了 狭 长 平 胞 属
(Stenotrophomonas)系统发育分支。
表1 供试菌株信息表
待
测
菌
株
参
比
菌
株
菌株编号
SWF66440
SWF66441
SWF66444
SWF66446
SWF66447
SWF66450
SWF66453
SWF66537
SWF66538
SWF67539
SWF66540
SWF66541
SWF66542
SWF66545
SWF66546
SWF67514
SWF67518
SWF67519
SWF67520
SWF67581
SWF67582
SWF67583
SWF67584
SWF67585
LMG19424T
LMG23256T
LMG18531T
LMG21445T
USDA2370T
宿主植物
无刺含羞草(N. thorn mimosa)
无刺含羞草(N. thorn mimosa)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
无刺含羞草(N. thorn mimosa)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
南苜蓿(Medicago polmorpha L.)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
田菁(sesbania)
豇豆(Vigna radiate)
豇豆(Vigna radiate)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
合欢(Albizia julibrissin)
合欢(Albizia julibrissin)
合欢(Albizia julibrissin)
合欢(Albizia julibrissin)
柱花草(Stylosanthes guianensias.)
含羞草(Mimosa pudica)
含羞草(Mimosa pudica)
Vertisol
军刀豆(Machaerium lunatum)
豌豆(Pisum sativum)
采集地
云南勐腊县
云南勐腊县
云南勐腊县
云南勐腊县
云南绿石林
云南绿石林
云南绿石林
云南景洪县
云南景洪县
云南盈江县
云南景洪县
云南景洪县
云南元谋县
云南普洱市
云南普洱市
云南盈江县
云南盈江县
云南盈江县
云南铜壁关
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
台湾
台湾
法国
法国
美国
待
测
菌
株
菌株编号
SWF67586
SWF67587
SWF67588
SWF67589
SWF67590
SWF67591
SWF67593
SWF67594
SWF67595
SWF67596
SWF67598
SWF67601
SWF67602
SWF67603
SWF67604
SWF67605
SWF67606
SWF67607
SWF67608
SWF67609
SWF67610
SWF67612
SWF67613
SWF66544
宿主植物
木豆(Cajanus cajan)
木豆(Cajanus cajan)
丁葵(Zornia diphylla Pers.)
猪屎豆(Crotalaria albida Heyne)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
短萼灰叶(Tephrosia candida)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
山蚂蝗(Desmodium microphyllum)
豇豆(Vigna radiate)
采集地
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南元谋县
云南盈江县
云南盈江县
云南盈江县
云南盈江县
云南盈江县
云南盈江县
云南普洱市
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
2.3 数值分类结果与分析
表型数据统计见表2。结果显示供试菌株的生理
生化反应有着丰富的多样性，生长范围极其广泛。大
部分菌株都可在 5% NaCl中生长，只有分离自云南元
谋和盈江县山蚂蝗植物的菌株SWF67590、SWF67591
和SWF67608忍受1% NaCl。而所有菌株对高温的耐
受性也都较强，多数菌株可耐受60℃的高温，但分离自
景洪和盈江山蚂蝗植物的菌株 SWF67608 和
SWF66538、分离自元谋合欢、柱花草和丁葵植物的菌
株 SWF67581、 SWF67582、 SWF67585 及 菌 株
SWF67588，均不能在 60℃的高温下生长；分离自元谋
的山蚂蝗植物菌株SWF67590和SWF67591，不能在低
温下生长。一些菌株可抗高浓度(300 μg/mL)的抗生
素，大部分菌株的 pH生长范围较窄（pH 9.0~11.0），有
15株菌耐酸，15株菌耐碱，各占一半，但这些菌株均不
能利用乳糖进行生长。
SWF66546SWF66541SWF67601
SWF67596SWF67589
SWF67604SWF67605SWF67586
SWF66537SWF67594SWF66545
SWF66539SWF67588SWF66544
SWF67603SWF67581SWF67602
SWF67582SWF66541SWF67606
SWF67598SWF67590SWF67591
SWF67583SWF67612SWF67584
SWF67595SWF67593SWF66540
USDA2370SWF66542SWF67610
SWF66538SWF67608SWF67585
SWF67607SWF67613SWF67609
SWF66446SWF66440SWF66453
SWF67514SWF66441SWF66450
LMG19424SWF66444SWF66447
SWF67520SWF67518SWF67519
LMG23256LMG18531
LMG21445
28 40 52 64 76 88 100
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
28 40 52 64 76 88 100
图1 待测菌株及参比菌株以16S rDNA PCR-RFLP为基础建立的树状图
Burkholderia sp. SW F67519
Burkholderia mimosarum LM G23256T
Burkholderia silvatlantica SRM rh-20T
Burkholderia heleia SA41T
Burkholderia sacchariLM G 19450T
Burkholderiaoxyphila DSM 22550T
Burkholderia ferrariaeFeG l01T
Burkholderianodosa Br3437T
BurkholderiaunamaeM Tl-641T
BurkholderiabannensisE25T
CupriaviduspauculaATCC700817T
CupriavidusgilardiiATCC17697T
CupriavidusrespiraculiA U3313T
Cupriavidussp. SW F66441
Cupriavidussp. SW F66450
CupriavidustaiwanensisLM G 19424T
Pseudom onasbeteliATCC19861T
StenotrophomonaspavaniiLM G 25348T
Stenotrophomonasmaltophilia AB294553T
SW F66546
Pseudom onashibiscicolaATCC19867T
Rhizobium sp.SW F67591
Rhizobium mesosinicum CCBA U25010T
Rhizobium alamiiG BV016T
Rhizobium mongolenseRM U89817T
Rhizobium yanglingenseSH22623T
Rhizobium gallicum RGU86343T57100
6397
100
3261
83
100
9692
40
36
100
100
99
92
92
57
100
61
63
29
77
0.02
Burkhol ri s
Burkholderia mimosarum LMG23256
Burkholderia silvatlantic a SRMrh-20T
Burkholderia SA41T
Burkholderia sacchari LMG1945T
Burkholderia oxyphila DSM22550T
Burkholderia ferrariae FeG101T
Burkholderia nodosa Br3437T
Burkholderia unamae MT1-641T
Burkholderia bannensis E25T
Cupriavidus paucula ATCC700817T
Cupriavidus gilardii ATCC17697T
Cupriavidus respiraculi AU3313T
Cupriavidus sp SWF66441
Cupriavidus sp S F66450
Cupriavidus taiwanensis LMG19424T
Pseudomonas beteli ATCC1986T
Stenotropho onaspavanii LMG25348T
Stenotropho onas altophilia AB294553T
S F66546
Pseudo onas hibiscicola ATCC19867T
Rhizobiu sp S F67591
Rhizobium mesosinicum CCAU25010T
Rhizobium alamii GBV016T
Rhizobium mongolense RMU89817T
Rhizobium yanlingense SH22623T
Rhizobium gallicum RGU86343T
92
61
29
99
7
10
57
92
100
36
40
92
96
10
100
83
61
32
63
63
100
100
57
0.02
图2 16S rDNA全序列系统发育树状图
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刘晓云等：含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及 16S rDNA PCR-RFLP分析
菌株编号
SWF67590
SWF67591
SWF66538
SWF67608
SWF67609
SWF67613
SWF67612
SWF67585
SWF66542
SWF67607
SWF66539
SWF66541
SWF67610
SWF66540
SWF67581
SWF67582
SWF67586
SWF67588
SWF67589
SWF67593
SWF67596
SWF67602
SWF66544
SWF66546
温度/℃
4
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
37
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
60
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
pH
4.0
+
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
9.0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10.0
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
11.0
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
NaCl浓度/%
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5
-
-
+
-
+
+
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BTB
酸
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碱
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表2 表型性状测定结果表
续表2
SWF67590
SWF67591
SWF66538
SWF67608
SWF67609
SWF67613
SWF67612
SWF67585
SWF66542
SWF67607
SWF66539
SWF66541
SWF67610
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菌株编号
Ap/(µg/mL)
5 50 100 300
Km/(µg/mL)
5 50 100 300
Cm/(µg/mL)
5 50 100 300
乳糖
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
3 结论
通过对云南省8个地区的豆科植物根瘤菌进行遗
传和表型多样性的研究，明确了这些菌株的系统发育
地位以及表型性状，得到以下结论：
（1）不同的豆科植物具有不同的根瘤菌种类共生，
说明根瘤菌具有丰富的遗传多样性。分离自含羞草植
物的根瘤菌均归属到 beta-纲根瘤菌，16S rDNA
PCR-RFLP分析中，分离自云南盈江含羞草植物的群
Ⅰ 代 表 菌 株 SWF67519 与 含 羞 草 根 瘤 菌 (B.
mimosarum)聚在一起，其序列相似性为99.8%；分离自
云南勐腊县和绿石林含羞草植物的群Ⅱ代表菌株
SWF66441和SWF66450与台湾贪铜菌(C.taiwanensis)
亲缘关系最近，序列相似性分别为 99.2%和 99.9%；分
离自元谋山蚂蝗的群Ⅳ代表菌株SWF67591与中慢中
华根瘤菌(R.mesosinicum)序列相似性为 99.6%；而分
离自田菁植物的菌株，测序结果归于狭长平胞属
(Stenotrophomonas)，而没有归属到根瘤菌相应的属
群。
（2）由生理生化研究说明，豆科植物根瘤菌具有较
大的表型多样性。供试菌株不仅具有较强的抗逆性，
而且菌株之间具有较大的表型差异。归属于根瘤菌属
(Rhizobium) 的 菌 株 相 对 于 归 属 于 贪 铜 菌 属
(Cupriavidus)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的菌株
对NaCl的耐受性、耐碱性、对抗生素的抗性方面都表
现出了劣势。
4 讨论
本研究中分离自田菁等植物的菌株归属到狭长平
胞属(Stenotrophomonas)，目前对这一领域的研究还较
少，较多报道为从根瘤中分离得到的土壤杆菌[20-23]。说
明根瘤菌与这些细菌之间存在一定的关系，这类菌株
均能固氮，可能在根瘤菌的侵入或固氮方面起到一定
的促进作用，可作为结瘤植物内生菌进行研究，其功能
还有待进一步研究。此外供试菌株受宿主植物影响较
大，根瘤菌属(Rhizobium)的菌株宿主范围广，而 beta-
纲根瘤菌贪铜菌属(Cupriavidus)和伯克霍尔德菌属
(Burkholderia)的菌株仅限于含羞草属植物，这与陈文
新等[24]对于根瘤菌植物及环境的判断是一致的。
一般情况下菌株的耐受性可能与其生存的地理环
境有很大关系，本研究中菌株的抗逆性等可能与云南
的土壤环境等有关，云南土壤富含铝，为酸性土壤，而
本研究中菌株多耐碱，其机制尚需进一步的研究。
参考文献
[1] 雷霞,陈文峰,随新华,等.根瘤菌多项分类的研究进展[J].微生物学
杂志,2007,27(6):77-80.
[2] 史晓霞,师尚礼,杨晶,等.豆科植物根瘤菌分类研究进展[J].草原与
草坪,2006(1):12-17.
[3] 郑君芳,朱万孚.根瘤菌系统发育分类方法研究进展[J].微生物学
通报,2004,31(2):126-129.
[4] Gaunt M W, Turner S L, Rigottier G L, et al. Phylogenies of atpD
and recA support the small subunit rRNA-based classification of
rhizobia[J]. International journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology,2001,6(51):2037-2048.
[5] Vandamme P, Pot B, Gillis M, et al. Polyphasic taxonomy,
aconsensus approach to bacterial systematics[J]. Microbiological
Reviews,1996,2(60):407-438.
SWF66540
SWF67581
SWF67582
SWF67586
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菌株编号
Ap/(µg/mL)
5 50 100 300
Km/(µg/mL)
5 50 100 300
Cm/(µg/mL)
5 50 100 300
乳糖
续表2
注：Ap：Ampicillin(氨苄青霉素)；Km：Kanamycin(卡那霉素)；Cm：Chloramphenicol(氯霉素)。Ap/5表示Ap(氨苄青霉素)浓度为5 µg/mL，其余依
此类推。BTB/酸表示BTB产酸反应；BTB/碱表示BTB产碱反应。+：阳性反应；-：阴性反应。
·· 140
刘晓云等：含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及 16S rDNA PCR-RFLP分析
[6] 徐琳,徐佳洁,韦革宏,等.西北部分地区苦马豆根瘤菌的遗传多样
性[J].生物多样性,2009,17(1):69-75.
[7] 李香香,张美玲,韦革宏,等.草木樨属根瘤菌的 16S rDNA
PCR-RFLP分析[J].西北植物学报,2008,28(3):0569-0573.
[8] 谭志远,陈文新.根瘤菌新类群代表菌株的16S rDNA全序列测定
及其系统发育地位[J].微生物学报,1997,37(6):411-416.
[9] 张勇法,王风芹,陈文新.我国豇豆和绿豆根瘤菌的数值分类及
16S rDNA PCR_RFLP研究[J].微生物学报,2006,46(6):861-868.
[10] 刘晓云,陈文新.三叶草、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌 16S rDNA
PCR- RFLP分析和数值分类研究[J].中国农业大学学报,2003,8
(3):1-6.
[11] Chen W P, Kuo T T. A simple and rapid method for the preparation
of gram-negative bacterial genomic DNA[J]. Nucleic Acids
Research,1993,21(9):2260.
[12] Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A, et al. 16S Ribosomal
DNA amplification for phylogenetic study[J]. J Bacterio,1991,173
(2):697-703.
[13] van Berkum P, Beyene D, Eardly B D. Phylogenetic relationships
among Rhizobium species nodulating the common bean (Phaseolus
vulgaris L.)[J]. Int JSyst Evol Microbiol,1996,46(1):240-244.
[14] Laguerre G, Allard M, Revory F, et al. Rapid identification of
rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of
PCR-amplified 16S rRNA genes[J]. Appl Environ Microbiol,1994,
60(1):56-63.
[15] 李俊,樊蕙,李力,等.慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研
究[J].应用与环境生物学报,2003,9(1):59-62.
[16] 郝云婕,王孟兆,刘磊,等.分离自补骨脂等宿主根瘤的24株菌的数
值分类和16S rDNAPCR-RFLP研究[J].微生物学通报,2008,35(5):
754-759.
[17] 路敏琦,李俊,李力,等.我国蚕豆根瘤菌的数值分类及其 16S
rDNA PCR-RFLP研究[J].微生物学通报,2005,32(6):26-31.
[18] 严雪瑞,陈文峰,陈文新,等.小叶锦鸡儿根瘤菌的分离及其 16S
rDNA PCR-RFLP分析[J].华中农业大学学报,2007,26(2):141-146.
[19] Sy A, Giraud E, Jourand P, et al. Methylotrophic Methylobacterium
bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes[J]. J
Bacteriol,2001,183(1):214-220.
[20] 刘杰,汪恩涛,陈文新.豆科植物根瘤内生细菌的发现及其研究进
展[J].微生物学报,2011,51(8):1001-1006.
[21] Kan F L, Chen Z Y, Chen W X, et al. Characterization of symbiotic
and endophytic bacteria isolated from root nodules of herbaceous
legumes grown in Qinghai- Tibet Plateau and in other zones of
China[J]. Archives of Microbiology,2007,188(2):103-115.
[22] Wang E T, Chen W F, Chen W X, et al. Genetic diversity and
potential for promotion of plant growth detected in nodule
endophytic bacteria of soybean grown in Heilongjiang province of
China[J]. Soil Biology and Biochemistry,2008,40(1):238-246.
[23] Zakhia F, Jeder H, Willems A, et al. Diverse bacteria associated
with root nodules of spontaneous legumes in Tunisia and first report
for nifH-like gene within the genera[J]. Microbacterium and
Starkeya Microbial Ecology,2006,51(3):375-393.
[24] 陈文新,汪恩涛,陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境
的关系[J].中国农业科学,2004,37(1):81-86.
·· 141