全 文 ：此方心艺 20 7 (4 ) : 55一肪 · 专题综述 .
分子标记技术在兰花遗传育种中的应用
赛 黎
(贵州毕节学院环境与生命科学系 . 5 5 170 )
摘 要 :分子标记技术在兰花遗传图语构建、 遗传多样性和物种亲缘关系、 分子标记辅助选
择 、 品种 (系 )指纹图讲构建及杂种 纯度鉴定等研究领城可广泛应用 。 综迷 了随机扩增 多态性
DN A标记 ( R A PD) 、扩增片段长度多态性标记 (解 I尸 ) 、 限制性片段长度多态性 (RF L P ) 、单核普破
多态性标记 ( SN r )等分子标记的基本原理 、主要特点 以及在兰花育种研究应用中的情况和展望 。
关镇词 :兰花 ;分子标记 ,遗传育种 . 应用
中圈分类号 : 5 682 . 31 ; 5 603
.
6 文献标识码 : A 文章编号 : l加 l一以刀g (20 7 )04 一加朋一 03
分子标记是在形态标记 、细胞标记和生化标记之后
发展起来较为理想的一种新的遗传标记形式 ,具有标记
数量多 ,不影响 目标性状的表达 ,不易受环境影响 ,结果
稳定可靠 ,重复性好等优点 ,成为评价育种资源最有力
的工具之一 。 目前 , 基于 P CR 的 D N A 标记 , 已广泛应
用于遗传图谱的建立 、基因标记 、 基因组作图 、 基因克
隆 、亲缘关系和遗传多样性鉴定 、品种 (系)指纹图谱构建 、
作者简介 : 冬黎 ( 1978 一 ) .女 ,硕 士研究生 ,研究方向为分于生物学
与育种 , D皿il : 29 9刃1@ 163 . O m 。
收稿日期 : 2的 6一 12 一 04
杂种纯度鉴定 、 目标性状的连锁和分子标记辅助选择等
研究中1[ 一叼 。
兰花 ( C卜e ih d) 一般是指兰科植物 ( Or c瓦ds c e a e ) ,是
被子植物中最大科之一 。 我国有丰富的野生兰花资源
和丰富的国兰栽培品种资源 ,其中具有观赏性的兰花如
蝴操兰 、石解兰 、大花慈兰 、卡特兰 、文心兰 、兜兰 、万代兰
等花型奇特 ,色彩丰富 ,具有很高的经济价值 。 但由于
兰科植物变异很大 , 中间类型多 ,种的界限不清楚 ,且 目
前主要的育种方法仍是传统的驯化育种 ,这将导致国兰
品种改良进展缓慢 ,不能满足和达到日益增长的市场需
求s[, 幻 . 近些年来 ,随着分子生物技术的迅速发展 ,使兰
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· 专题综述 · 此方目艺20 7( 4) : 8 3一 58
花育种中的间接选择成为可能 ,大大提高遗传分析的准
确性和选育种的有效性 。 因此可利用分子生物学手段
为开发兰花新品种、改善品质和增强抗性来取得较大的
突破 。 文章综述了随机扩增多态性 D N A标记 ( R A PD ) 、
扩增片段长度多态性标记 ( AF L P ) 、 限制性片段长度多
态性 ( RF I尸 ) 、单核昔酸多态性标记 ( SNP )等分子标记的
基本原理 、主要特点以及在兰花育种研究应用中的情况
和展梦 1一 “ .
1 分子标记的主要类型及特点
1
.
1 RF LP 标记 ( Rse itr c t io n F琢『院 n t 玫gnt h oP lyn 幻-r
p hi
s m )
RF LP 是最早发展的分子标记技术 . 其原理是利用
放射性核素或非放射性物质标记探针 ,与转移于支持膜
上的经过限制性醉切的基因组总 l别A 杂交 ,通过显示
限制性酶切片段的大小 ,检测不同遗传位点等位变异的
多态性 . RF I尸 具有在基因组 D N A 中位点固定 ,数量
大 ,几乎分布于全基因组 , 可检测位点的复等位性 ,共显
性等优点 ,但缺点是该方法 D N A用量大 ,耗费成本高 ,
操作繁琐 ,技术复杂 ,费时费力 ,且检侧中需要的放射性
同位素对人体有害 . 目前 , RF LP 标记主要应用于遗传
连锁图的绘制和目的基因定位以及品种鉴定等方面 .
1
.
2 功妞D标记 (几旧咖凡即断目 olP yr 的rP hi c D N A )
招护D 的原理是以基因组 D N A 为模板 , 以一个随
机的寡核昔酸序列 (通常为 10 个碱基对 )作引物 , 通过
PC R扩增反应 ,产生不连续 D N A 片段产物 , 用以检测
DN A序列的多态性 . 它具有快速简便 ,无放射性污染 ,
成本较低 ,分辨率高 ,灵敏度强等优点 ;凡廿 D 的缺点主
要有引物筛选工作 t 大 ,试验可重复性差和多态性不足
等 . 该技术目前在遗传学各个领域广为应用 ,尤其在种
质资源鉴定及作物品种纯度和真实性鉴定方面受到广
泛的重视 。
1
.
3 A日尹 标记 (凡即 li if ed F扭『en n t 玩飞 t h oP l卯阅 r ~
咖 s m )
AF L P技术基本原理是通过对基因组 DN A 酶切片
段的选择性扩增来检测 D N A 酶切片段长度的多态性 ,
选择性扩增是通过在引物的 31 末端加上选择性核昔酸
而实现的 ,通过改变选择性核昔酸的数目 ,就可预先决
定所要扩增的片段数目。 它具有多态性强 、试验结果稳
定 、重复性好 、典型的孟德尔遗传方式等优点 .但受专利
权保护而限制了它在商业及生产上的应用 ;同时 ,试验
对 DN A纯度和内切酶的质 t 要求较高 ,操作程序长 、步
骤多 ,并要求很高的实验技能和精密的仪器设备 . 目前
该技术已用于遗传作图 、基因定位 、 DN A 指纹鉴定 、遗传
多样性分析等许多研究领域 。
1
.
4 IS R标记 ( ntI er 一 s irnP le S现 u ecn R
e户班 t s)
I S SR 标记根据植物广泛存在 SS R 的特点 ,利用在
植物基因组中常出现的阳R本身设计引物 ,无孺预先克
隆和测序 . 咫 R在真核生物中的分布是非常普遍的 ,并
且进化变异速度非常快 , 因而锚定引物的 IS R一 P CR
可以检测基因组许多位点的差异 。 I邓R 通常为显性标
记 ,具有很好的稳定性和多态性 。 近年来 ,已被应用于
品种鉴定 、遗传关系及遗传多样性分析、基因定位、植物
基因组作图等 。
1
.
5 SN P 标记 ( 3司 e N uc leot ide olP 卯的pr ih sm )
S N P是指在染色体基因组水平上单个核昔酸的变
异引起的 D N A 序列多态性 , 而其中最少一种等位荃因
在群体中的频率不小于 1% . 它包括单碱基的转换 ,颠
换 、擂人及缺失等形式 . SN P标记在大多数基因组中存
在较高的频率 、数量丰富 ,可进行自动化检测 ,并在短时间
检测出大量的样品 . 但其鉴定则要通过芯片技术实现。
2 分子标记在兰花遗传育种中应用情况及展望
由于分子标记与传统应用的常规遗传标记相比具
有诸多优点 ,部分标记在兰花遗传育种中已得到广泛应
用。 现将分子标记在兰花育种中的应用情况概述如下 。
2
.
1 遗传多样性研究
遗传多样性是生命系统的基本特征 ,是物种适应自
然和发生进化的遗传基础 . 研究遗传多样性可以减少
育种工作中亲本选育的盲目性 ,提高育种效率 . 而在同
一物种的各个品种间存在大量独特指纹标记 . 根据种
质资源 I荆A指纹的多态性和各个目标性状的互补性 ,
可以总体评价育种材料的变异丰富度并在其后代中选
育出综合性状最佳的单株 .
在分子标记中 , R AP D技术是评价和比较种内、 种
间遗传变异的常用方法 . 李钧敏等用 功廿D 分子标记
技术对 30 个西兰花栽培新品种进行分析 ,结果显示 2
个引物在 30 个品种中共扩增出 229 条谱带 ,其中多态性
条带有 109 条 ,多态位点百分率为 47 . 60 % ,表明品种间
丰富的遗传多样怪 ,〕 . 文李利用凡切D技术分析兰属 5
个种 2个变种共 13 个品种间的亲缘关系 . 从 5 种 10
个碱基随机引物中筛选出 4种引物 ,扩增出 93 条多态性
带 ,多态率为 10 纬闭 。 在栽培品种的鉴定上 ,梁红健等
使用 10 种加 个碱基引物对 19 个中国兰花品种的基因组
D N A 进行扩增 ,共产生 83 条扩增带 ,其中 80 条为多态性
带 . 每个兰花品种都有其各自的扩增带 ,这种特异的条带
可作为品种的分子标记为其遗传多样性鉴定提供依据 .
2
.
2 亲缘关系研究
利用分子标记可以确定亲本之间的亲缘关系 ,从而
确定亲本间遗传距离 ,进而划分杂交优势群 , 提高杂种
优势潜力 。 文李用 凡冲D 技术分析了兰属 (Q卿而d i -
溯 ) 5 个种 2 个变种共 13 个品种间的亲缘关系 ,从 5 个
随机引物中筛选出 4种引物 ,扩增出 93 条多态性带 ,多
态率为 10 % ,聚类分析表明 ,剑兰 、墨兰和春兰的亲缘
此方 。 艺 207 (4 2:55一 5 5 · 专题综述 ·
关系较近 ,而春剑 、寒兰 、独占春和兔耳兰与剑兰的亲缘
关系较远 s[J 。 明凤等利用筛选到的 25 个特异引物对蝴
蝶兰不同花色品种作 RA P D 分析 ,将 12 个品种分为两
个家族 :第一家族中包含基色为白色的花色品种 ,花蕊
颜色略有不同 ;第二家族为具有条纹的花色品种 ;确定
品种间遗传距离最大为 。. 7 832 ,坛小为 0 . 10 34 图 。 这为
近缘杂交获得不同类型的新品种提供了理论依据 。
2
.
3 品种鉴定和杂种纯度鉴定
长期以来 , 各种兰花由于不同地域的相互引种栽
培 , 出现了许多同物异名和同名异物的现象 , 品种名和
品种分类十分混乱 ,而且用传统手段进行杂种纯度鉴定
很费时 ,而且易受环境条件的影响。 因此 ,对现有花卉
品种准确的鉴定和分析十分重要 , 分子标记技术为品种
鉴定提供了新手段并克服许多弊端 。 梁红健等用
凡钾D技术对 19 个中国兰花品种的基因组 DN A 进行
扩增 ,共产生 83 条扩增带 ,其中 80 条为多态性带 . 每个
兰花品种都有其特有的扩增带可与其它品种区别开
来l[ 叼 。 O ab 花一 O晚扣 等利用 招切D 技术对 36 个大花
慈兰栽培种进行了品种鉴定和遗传分析 ,利用 oP A一 1
引物 ,可将已混淆的品种明确地区别出来1[ 」。 分子标记
不仅简单 、迅速 、可靠 ,而且 D N A 用童少 ,不影响被检侧
植株的后期生长 。
2
.
4 遗传图谱的构建
遗传图谱构建是对基因组进行系统研究的基础 ,也
是在分子水平上进行育种的依据 . 兰花遗传图谱的构
建工作已经开展 ,谢伟等利用随机扩增多态 D NA 技术
(功护功对兰属的 3个品种春兰 、春剑 、慈兰进行了分析
与研究 ,建立了它们之间的 DN A指纹图谱 ,找到了参试
样品的特征谱带 ,并探讨它们之间的亲缘关系阅 。 谭文
澄等采用分子技术对兰属 23 个样株和石解兰属 1个样株
进行分析 ,获得了清晰易读的由 6一 15 条带组成有特异性
的遗传指纹图奢旧 。 随着分子标记的发展 ,也可以在兰
花中产生 A IF 夕洒F LP 、 S S R等分子标记的遗传图谱 。
2
.
5 分子标记辅助选择育种
选择是作物育种的重要环节 。 以往都根据植株性
状的表型进行选择 ,这种选择对于质 t 性状或便于观察
的性状是有效的 ,但对数童性状或不容易观测 、易受环
境影响 、表现不稳定的性状来说 , 依靠性状的表型进行
选择就比较困难 。 作为辅助育种的分子标记可以通过
连锁标记对这些性状进行早期间接选择 , 可以实现有利
基因的定向转移而减少连锁累赘 .可以实现目的基因的
累加和大大缩短育种周期 。 利用分子标记进行辅助选
择禽要一定的前提 , 即首先要有足够的数蚤性状和质 t
性状位点 ,其次位点与标记有相当紧密的连锁程度 .第
三需完善的分子标记辅助选择的理论和技术 。 目前 ,在
康乃馨 、亚洲杂交百合等花卉中 ,兰花是利用分子标记
辅助育种相对比较多的一种 l4[ 〕 。 这说明在兰花中利用
分子标记辅助选择育种具有一定的可行性 。
3 结 语
目前国兰品种改良进展缓慢 ,主要的育种方法仍是
传统的驯化育种ls[ , l6j ,仍不能满足市场的需求 。 但随着
分子标记技术的发展 ,在兰花中已展现了广阔的前景 ,
如利用分子标记技术 ,能够准确鉴定种质资源中的优异
农艺性状基因的多样性 ,发掘大量未被利用的优良农艺
性状的基因 ,拓宽育种的物质基础 ;有助于在育种过程
中对特定荃因型的选择 ,缩短育种周期 ,提高育种效率 ;
鉴定遗传多样性 ,确定杂交育种的亲本选配 .揭示物种
亲缘关系 ,有效进行种质资源创新 , 为兰花育种提供早
期的辅助选择指标 、 以改良株形 、花型 、花色、 花香和提
高抗逆性等多种优良性状的利用 , 来丰富兰花遗传基
础 ,从而更好地为兰花育种提供积极的指导意义 。
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