全 文 ：第 47 卷　第 3 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.47　No.3
　2008 年 5 月 Journal of Xiamen Universi ty (Natural Science) May 2008　
高脂杜氏藻的诱变筛选与分析
陈　昱 ,林锦明 ,刘广发＊
(厦门大学 生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005)
　　
收稿日期:2007-08-20
基金项目:福建省重大专项前期研究项目(2005YZ1022)资助
＊通讯作者:liu gfl s@xmu.edu.cn
摘要:采用紫外线照射的方法对巴氏杜氏藻 Dunaliella bardawi l H-42(简称 H-42)进行诱变.通过小剂量乙醚抽提 、索
氏法提取和氯仿提取分析 ,得到两株总脂含量显著高于原出发株的突变株 , 分别命名为 D.bardaw il H-42 va r.HL-1(简
称 H L-1)和 D.bardaw il H-42 var.H L-2(简称 H L-2).研究表明 , H L-1 和 H L-2 的总脂含量可达细胞干质量的 21.1%
和 20.5%,分别比对照提高了 31.1%和 27.3%.初步分析了 H L-1 和 HL-2 的生物质油主要组分 ,它们的氯仿沥青“ A”
(相当于原油)含量分别比对照提高了 10.6%和 11.8%, 具有良好的生物质能源开发前景.随机扩增多态性 DNA
(RAPD)分析表明:H L-1 和 H L-2 与 H-42的遗传相似系数为分别为0.797 和 0.718 ,由此确认 HL-1和 H L-2 均为 H-42
的高脂突变株.
关键词:杜氏藻;诱变;脂类;生物质油;氯仿沥青“ A”
中图分类号:Q 356.1　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:0438-0479(2008)03-0397-05
　　能源是人类生存与发展的基础 ,不可再生化石能
源日趋减少以及使用化石能源造成的环境污染加剧问
题 ,全球瞩目.为了摆脱这种困境 ,各国政府和科研工
作者都把目光投向了可再生且污染小的生物质能源开
发利用领域.我国也把可再生能源列入科技发展的优
先领域.
在众多生物质中 ,藻类具有光合作用效率高 、生长
周期短 、生物产量高的特点 ,其中单细胞的杜氏藻
(Dunaliel la sp.)还具有环境适应能力强的特点 ,是迄
今发现的少数极端耐盐的真核生物之一.杜氏藻没有
细胞壁 ,容易被消化 ,细胞中富含甘油 、蛋白质 、淀粉和
β-胡萝卜素 ,可以作为理想的保健食品 ,也可以作为水
产动物的优质饵料 ,因此杜氏藻在商业开发中具有很
高的利用价值[ 1] .缪晓玲等认为藻类还是制备生物质
油的良好材料 ,其胞内有机物的种类及含量对产品的
热值及质量有显著的影响.细胞内脂类含量愈高 ,其产
烃潜力也愈强[ 2] .本文作者以紫外线照射并结合乙醚
和氯仿提取筛选的技术路线获得了两株高脂杜氏藻 ,
同时初步分析了其生物质油的主要组分 ,发现其突出
的产烃潜能 ,对进一步开发利用可再生杜氏藻生物质
能源具有重要意义.
1　材料与方法
1.1　藻种及紫外线诱变
巴氏杜氏藻(D.bardawil var.H-42),本实验室
保存[ 3] ;杜氏藻培养液为 Ben-Amo tz 人工海水培养
基[ 4] ,N aCl浓度为 1.5 mol/ L.取处于指数生长中期
的 H-42藻液(OD 630值约为 0.4 ～ 0.7)50 ～ 100 μL ,均
匀涂在含琼脂 1%的杜氏藻培养基上.将涂好的平皿
置于超净工作台中 ,于 30 W 紫外灯下 13 cm 处照射
70 s后暗培养 48 h ,封口膜封口 ,倒扣光照培养 15 d.
挑出单藻落经试管-小锥形瓶-敞口玻璃缸逐级放大培
养.
1.2　杜氏藻培养
将各藻株培养于3 L 敞口玻璃缸 , 24 h 光强 8 000
lx 连续光照 ,温度 28±1℃,不时搅拌.隔天取样测定
OD630值 ,计算细胞数并绘制生长曲线[ 5] .在生长平衡
期以 3 000 g 离心 10 min收集藻细胞 ,以 0.3 mo l/L
的 NaCl 洗涤藻细胞一次 , 80℃烘制成藻粉 ,冷冻保
存.
1.3　小剂量乙醚抽提
挑选长出的单藻落于装有 3 ～ 5 mL 培养液的试
管中正常培养 , 14 d后转入 50 mL 锥形瓶小量扩大培
养 15 d.称量已经干燥的 4 mL 离心管 A(m1),加入
3.5 mL 藻液 ,3 000 g 离心 2 min ,尽弃上清.将管 A
置于烘箱内 80℃干燥 2 h ,取出管 A 冷却至室温后称
量(m 2).往离心管中注入约 2 mL 的无水乙醚 ,震荡 ,
抽提 1 h , 8 000 g 离心 5 min ,将上清转移至已称量
(m3)的干净离心管 B中.风干管 B 内的乙醚 ,将其置
烘箱内 104℃干燥 1 h ,取出管 B 冷却至室温后称量
　图 1　柱层析分离样品馏分流程
Fig.1　Flow cha rt of f raction sepa ration o f sam ple s
(m4).粗脂肪%=(m4 -m3)/(m2 -m1)×100%,以此
作为初筛高脂突变藻株的依据.
1.4　索氏提取法测定总脂
以 1 L 锥形瓶扩大培养上述初筛高脂突变藻株 ,
15 d后收获藻细胞制成藻粉.称取 500 mg 藻粉 ,采用
索氏提取法(无水乙醚为溶剂)[ 6] 求出藻粉中总脂含
量.每个测定重复 3次 ,取平均值.
1.5　生物质油组分初步分析
制备硅胶-氧化铝柱[ 7] .称取 1 g 左右藻粉 ,于索
氏抽提器中用氯仿抽提 20 h后 ,获得可溶有机质氯仿
溶液(氯仿沥青“A”).石油醚沉淀沥青质后 ,将脱沥青
质油样上硅胶-氧化铝柱 ,然后相继用正己烷 、V正己烷:
V二氯甲烷=1:2的混合液以及甲醇洗脱 ,即得饱和烃 、芳
烃和非烃等 3种组分(图 1).
表 2　杜氏藻高脂突变株的氯仿沥青“ A”含量和组成
Tab.2　Contents and compositions of the chlo rofo rm ex tractsAfrom high lipid-content Dunaliella strains
藻株 氯仿沥青“A”含量/ %(dm)
烷烃含量
/ %(dm)
氯仿沥青“ A”各组分的相对含量/ %
饱和烃 芳香烃 非烃 沥青质
H L-1 18.8±0.4 1.4±0.07 7.5±0.04 2.1±0.09 35.6±0.04 54.8±0.64
H L-2 19.0±0.8 1.7±0.07 8.9±0.14 4.2±0.21 38.4±0.51 48.4±0.16
H-42 17.0±0.5 1.6±0.12 9.4±0.17 5.9±0.08 32.9±0.27 51.8±0.34
1.6　杜氏藻总 DNA提取及 RAPD扩增
提取杜氏藻总 DNA [ 8] ,并以 25个 10聚核苷酸随
机引物进行 RAPD扩增[ 9] .聚核苷酸随机引物购自上
海生工生物工程技术服务公司 , Taq DNA 聚合酶 、
RNase A 购自大连宝生物公司 ,其它试剂为国产分析
纯试剂.
2　结果与分析
2.1　高脂杜氏藻的获得
挑选经紫外线诱变后长出的较大单藻落 144株 ,
分别转入装有 5 mL 培养液的试管中培养.
将实际成活的 129 株转移至 50 mL 锥形瓶中小
量扩大培养.通过小剂量乙醚抽提法初筛获得 11个脂
类含量比较高的藻株(编号为 H L-1 ～ H L-11).索氏乙
醚抽提法进行复筛的结果表明(表 1):初筛得到的 11
个藻株中有 7株的总脂含量显著高于原出发株 ,其中
2株的总脂含量可达细胞干质量的 21.1%和 20.5%,
分别比原出发株提高了 31.1%和 27.3%.将这 2株总
脂含量高的突变株命名为 D.bardawil H-42 var.HL-
1和 D .bardawil H-42 var.HL-2.
表 1　经紫外线诱变获得的高脂杜氏藻
　Tab.1　High lipid-content Dunalie lla strains de rived from
UV muta tion
藻株 总脂含量(%, dm) 藻株
总脂含量
(%, dm)
H L-1 21.1±0.8 HL-7 18.7±0.7
H L-2 20.5±0.6 HL-8 17.9±1.1
H L-3 18.9±0.5 HL-10 17.9±0.9
H L-5 19.2±0.3 H-42 16.1±0.4
　　注:H L-1 ～ H L-10 为各突变株;H-42 为原出发株.
2.2　杜氏藻高脂突变株氯仿沥青“A”的含量
和组成
HL-1和 HL-2的氯仿抽提物比 H-42更为丰富
(表 2),它们氯仿沥青“A”(相当于原油)含量都超过细
胞干质量的 18%, 分别比 H-42 提高了 10.6%和
11.8%.但其组成仍然以非烃和沥青质为主 ,饱和烃和
烷烃的变化不明显.
2.3　HL-1和 HL-2 为源自 H-42的突变株
实验发现25个随机引物中有4个引物无扩增产
·398· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2008 年
表 3　10 聚核苷酸随机引物序列及其扩增结果
Tab.3　List o f the random primers sequences and their am plification results
序号 引物 H L-1 和 H-42 的扩增结果总扩增带数 共有带数
H L-2 和 H-42 的扩增结果
总扩增带数 共有带数
S262
S264
S266
S267
S268
S270
S271
S273
S274
S275
S276
S278
S282
S283
S284
S285
ACCCCGCCAA
CAGAAGCGGA
AGGCCCGA TG
CTGGACGTCA
GAC TGCC TCT
TCGCA TCCCT
CTGATGCGTG
CACAGCGACA
CTGCTGAGCA
ACACCGGAAC
CAGCCTACCA
TTCAGGGCAC
CATCGCCGCA
ACAGCCTGCA
GGCTGCAATG
GGCTGCGACA
11
10
11
8
7
11
8
12
18
6
8
10
8
11
9
10
4
4
5
4
2
2
4
5
8
2
2
5
2
5
4
5
11
9
11
6
5
10
6
9
14
6
4
9
4
10
8
9
5
3
4
2
2
2
1
3
5
2
1
4
2
4
3
4
总计 16 158 63 131 47
　图 2　H-42 , HL-1 和 H L-2 的 RAPD扩增图谱
1.M:DNA Marker s;2 .每个引物下对应的 3 个泳道依次为:H-42 , HL-1和 H L-2
Fig.2　RAPD profile of H L-1 , HL-2 and H-42
物 ,5 个引物产生不清晰条带.其余 16 个引物能扩增
产生清晰的多态性差异条带(图 2).每个引物至少重
复两次 PCR 反应.HL-1 和 H-42 共检测到 158 个位
点;HL-2和 H-42共检测到 131个位点(表 3).
计算相关株系间遗传相似系数 I =2Nij/(Ni+
N j)[ 10] .式中 N i+N j 为两样品经过随机引物扩增后
总显示的带数 , N ij为两样品共有的显示带数.根据表
3计算得出 H L-1和 H-42的遗传相似系数为 0.797 ,
HL-2和 H-42的遗传相似系数为 0.718。根据上述结
果并参照 Lane[ 11] 以及张会永等[ 12] 的的观点 , 确认
HL-1和 HL-2为源自 H-42的突变株.
3　讨　论
杜氏藻具有罕见的耐受极端高盐(可在饱和盐水
中生存)、高温和高光强等极端环境的能力 ,因此早已
成为商业化大面积养殖微藻[ 13] .有研究表明 ,室外大
量培养盐生杜氏藻收获量达 15 g(dm)/m2 ,与培养小
球藻时的最高产量相当[ 1] .缪晓玲等[ 2] 指出微藻中含
有相当可观的脂类物质 ,具有广泛应用价值.但是检测
杜氏藻的脂类质量分数仅为 6.6%～ 16.1%[ 14] ,限制
了其生物质能的开发利用.
杜氏藻是单倍体生物 ,它们经诱变产生显性突变
株的可能性较大[ 15] ,关键在于建立比较简便的筛选突
变株方法.我们建立的简易乙醚抽提法具有快捷和经
济的突出优点.它仅需 1 h在试管中用 2 mL 的乙醚浸
提 3.5 mL 藻液离心得到的少量藻粉 ,而常规索氏提
取法需至少 4 h 用近百毫升乙醚在特制的索氏抽提瓶
循环提取几百毫升藻液离心得到的藻粉.为了探究本
·399·第 3 期　　　　　　　　　　 　　　　　　陈　昱等:高脂杜氏藻的诱变筛选与分析
表 4　简易乙醚提取与索氏提取杜氏藻中脂类排序结果比较
Tab.4　Comparison o f queue up for the to tal lipid content o f Dunaliel la strains ex tracted by simple ethe r and Soxhlet pro cedure
藻株编号 索氏提取排序 简易乙醚提取 1排序 简易乙醚提取 2 排序 简易乙醚提取 3 排序
1 6 6 7 6
2 2 3 2 3
3 7 9 7 8
4 8 10 9 9
5 5 5 5 5
6 3 2 1 2
7 4 4 4 4
8 9 7 6 7
9 10 8 11 10
10 1 1 3 1
11 12 11 10 11
12 13 12 12 12
13 11 13 13 13
　　　　　　注:简易乙醚提取共进行 3次并分别排序.
方法的可靠性 ,我们取 13株杜氏藻用经典索氏提取法
和简易乙醚抽提法(重复 3次)分别测定了它们的总脂
含量并进行排序.比较这两种方法的 4次检测结果 ,发
现它们的排序几乎是吻合的(表 4),相关性高达 0.920
(SPSS软件分析).可见简易乙醚抽提法所得结果还是
可信的.我们采用本方法在较短的时间内初筛了 129
株诱变后的藻株 ,发现 11株总脂含量高于原出发株的
突变株.经索氏提取法复筛 ,最终确认了 7株高脂杜氏
藻突变株.
此外本文还从另一个侧面证明 ,突变株 HL-1和
HL-2的氯仿沥青“A”的含量都很丰富.氯仿沥青“A”
是评价炭质泥岩和原油生烃潜力的主要依据之一 ,只
有少数煤的氯仿沥青“A”含量可达 3%以上[ 16] .本实
验获得的突变株具有很高的氯仿沥青“A”含量 ,突出
反映了它们优秀的生烃潜能.前人的工作表明 ,氯仿沥
青“A ”被加热到 450℃后就能大量裂解生成气态
烃[ 17] .我们的另一项热解试验已经表明 ,正是由于大
量的氯仿沥青“A” ,高脂藻粉转化为烷烃类油 、气的比
例可高达 70%以上(另文发表),说明养殖高脂杜氏藻
突变株作为可再生生物质能源蕴含着巨大的潜力.
一个藻细胞(杜氏藻是单细胞生物)诱变后在琼脂
培养基长成肉眼可见 、可被挑取的藻落时 ,它已经至少
分裂传代 25次;然后再经小试管 、锥形瓶以及玻璃缸
的三级放大培养 ,每一级都需 14 d 以上的时间(即每
经一级培养该藻又分裂传代至少 20次).也就是说 ,从
单个突变藻细胞到收获检测用的数升藻液 ,该藻估计
已经传代百余次.此外我们还对每株突变株都进行 2
次以上的重复平行培养检测 ,相当于再传代 200次以
上.经过这一系列传代和重复检测 ,证明它们高脂突变
的特性是比较稳定的.
本文从 3个层次(简易乙醚抽提法 、索氏提取法和
RAPD 分析法)证明了高脂突变株比原出发株 H-42
具有更高的生物质能源开发价值.今后 ,可以从改变环
境因子(培养基的组成 、温度 、光照 、盐度等)入手 ,进一
步提高其脂类和烷烃含量 ,使其更有利于制备生物质
能.不过以色列 Ben-Zion Ginzburg 博士认为 ,蛋白质
热解产能率虽然稍低于脂类 ,但在杜氏藻中前者的比
例大于后者 ,且脂类的累积量只有在生长的末期(平衡
期)才达到最高 ,这必然要延长其养殖周期 ,从经济利
益的角度来看并不是最佳选择.因此从高蛋白角度筛
选突变株也许是可以考虑的.
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Mutation and Analysis of High Lipid-content
Strains of Dunaliella bardawil
CHEN Yu , LIN Jin-ming , LIU Guang-fang＊
(Key Labora tory of the M inistry o f Education fo r Ce ll Bio lo gy and Tumor Cell Engineering ,
School o f Life Sciences , Xiamen University , Xiamen 361005 , China)
Abstract:Tw o mutant strains of Dunaliella bardawi l.H-42(H-42), with the character of high lipid-content , have been iso lated
and identified af te r ultr avio let radiation.They we re denomina ted as D.bardaw il H-42 va r.HL-1(HL-1)and D.bardawi l H-42 var.
H L-2(H L-2), respectively.Total lipid contents were determined by the Soxhlet procedure.Contents and the main compositions o f
biodiesel of the tw o mutant strains were analyzed by geochemistry experimental technolog y.The results showed that to tal lipid con-
tents of HL-1 and HL-2 w ere 21.1% and 20.5%(dry mass), which we re inc reased as high a s 31.1% and 27.3%, re spectively.The
RAPD test rev ealed that the genetic similarity between H-42 and its mutant st rain H L-1 was 0.797 , while H-42 and HL-2 w as
0.718.Quantities of the chlo rofo rm ex tracts Afrom high lipid mutants HL-1 and H L-2 we re enhanced mo re than 10% to their o-
riginal species H-42.So the evidence mentioned above pro ved tha t bo th H L-1 and H L-2 were experimentally te sted to be the mutant
strains derived from H-42 and provided a new char acte r of high content of lipid.They may be ve ry good candidates fo r sour ce of o il-
producing micro alg ae.
Key words:Dunalie lla bardawi l;mutant;lipid content;biodiesel;chlor ofo rm ex tractsA
·401·第 3 期　　　　　　　　　　 　　　　　　陈　昱等:高脂杜氏藻的诱变筛选与分析