全 文 ：收稿日期:2013 － 11 － 04 修回日期:2013 － 11 － 30
基金项目:福建省高校产学合作科技重大项目(2011N51010043)．
作者简介:李科(1987 －) ，男，硕士研究生．研究方向:花卉遗传育种． Email:like16116@ 163． com．通讯作者陈晓静(1954 －) ，女，教授，博士
生导师．研究方向:园艺植物遗传育种． Email:xjchen804@ sina． com．
多花水仙 HMGS基因的克隆
李 科1，何炎森1，2，陈晓静1
(1．福建农林大学园艺学院 /园艺植物遗传育种研究所，福建 福州 350002;
2．福建省农业科学院闽台园艺研究中心，福建 漳州 363005)
摘要:以多花水仙花瓣抑制消减杂交文库获得的羟甲基戊二酰辅酶 A合酶(HMGS)基因片段为基础，采用 cDNA末端快速
扩增(ＲACE)技术从黄花水仙 2 号和金盏银台中各克隆一条 HMGS 基因，两基因均含有一个 1413 bp 的开放阅读框，编码
470 个氨基酸，但存在 2 个氨基酸差异．氨基酸序列分析表明:黄花水仙 2 号与葡萄、大豆、蓖麻和玉米 HMGS基因的氨基酸
相似系数分别为 83%、82%、82%和 81% ．以水仙 Actin基因为内参基因，采用荧光定量 PCＲ方法分析 HMGS基因在两品种
的表达水平，结果表明:两品种 HMGS基因的表达水平差异并不明显．
关键词:多花水仙;羟甲基戊二酰辅酶 A合酶(HMGS) ;克隆
中图分类号:S682．2 + 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2014)03-0289-06
Cloning of HMGS gene from flowers of Narcissus tazetta
LI Ke1，HE Yan-sen1，2，CHEN Xiao-jing1
(1． College of Horticulture / Institute of Genetics ＆ Breeding in Horticultural Plants，Fujian Agriculture and
Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;2． Mintai Horticulture Ｒesearch Center，
Fujian Academy of Agricultural Sciences，Zhangzhou，Fujian 363005，China)
Abstract: Two 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase (HMGS ) genes were cloned from Narcissus tazetta var．
Huanghuashuixian Ⅱ and Jinzhanyintai by rapid amplification of cDNA ends (ＲACE)． The open reading frame (OＲF)in both of
the gene encompassed 1413 bp encoding a polypeptide of 470 amino acids，and there are two amino acids different between them．
Sequencing analysis showed that the amino acid sequence of N． tazetta was 83%，82%，82%，81% homologous with HMGS genes
from Vitis vinifera，Glycine max，Ｒicinus communis，Zea may respectively． The relative expression levels of HMGS at two varieties
were analyzed by qＲT-PCＲ and Actin was used as reference gene． The qＲT-PCＲ results showed that HMGS relative expression lev-
els at the two varieties are not obviously differential．
Key words:Narcissus tazetta;3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase (HMGS) ;clone
多花水仙(Narcissus tazetta L．)是石蒜科水仙属植物，其花枝多，花香浓郁．香气是观赏植物极为重要
的品质，水仙的花香物质非常复杂，主要包括酯类、萜类、醛类和醇类等化合物［1 － 2］．萜类化合物是植物花
香的主要成分，由异戊烯焦磷酸(IPP)通过单萜或倍半萜合成酶合成．甲羟戊酸(MVA)途径是进行倍半萜
类化合物合成的重要途径．羟甲基戊二酰辅酶 A 合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)是
甲羟戊酸途径第 2 个催化酶，催化乙酰 CoA与乙酰乙酰 CoA 缩合生成羟甲基戊二酸 CoA，再经过一系列
酶促反应生成异戊烯焦磷酸，作为单萜和倍半萜类化合物合成的通用前体［3］．
目前，HMGS基因在茶树［4］、灵芝［5］和橡胶树［6］等植物中已被克隆和研究，而水仙花 HMGS 基因的相
关研究尚未见报道．本试验以多花水仙花瓣抑制消减杂交文库获得的 HMGS 基因 uniEST 为基础，通过
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，ＲACE)技术，克隆两品种多花水仙 HMGS 基因的
cDNA全长，对其序列和编码的蛋白质进行生物信息学分析，并采用荧光定量 PCＲ方法分析其在两品种中
的表达量，旨在为了解该基因的功能及多花水仙花香形成机理提供参考．
1 材料与方法
1．1 材料
植物材料:两个香气不同的多花水仙品种为黄花水仙 2 号(香气浓郁)和金盏银台(香气淡雅) ，种球
福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷 第 3 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2014 年 5 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2014.03.014
由福建农林大学园艺植物遗传育种研究所提供．于 2012 年 10 月下旬种植，2013 年 2 月中旬分别取盛花期
花瓣和副冠置于 ＲNase free离心管中，保存在 － 86 ℃的冰箱中．
主要试剂和仪器:多糖多酚植物提取试剂盒(北京百泰克生物技术公司)、3ＲACE 试剂盒 ＲevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis(Fermentas公司)、5ＲACE试剂盒 Super SMAＲTM PCＲ cDNA Synthesis Kit(Clon-
tech公司)、逆转录试剂盒 PrimeScriptTM ＲT Enzyme(TaKaＲa 公司)、试剂盒 SYBＲ Premix Ex Taq TM
(TaKaＲa公司)、Bio-Ｒad CFX96 实时荧光定量 PCＲ仪．
1．2 方法
1．2．1 ＲNA 的提取和反转录 按照多糖多酚植物提取试剂盒的方法提取总 ＲNA．按照 ＲevertAidTM First
Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书逆转录 3ＲACE 模板，按照 Super SMAＲTM PCＲ cDNA Synthesis Kit 试
剂盒说明书逆转录 5ＲACE模板．按照 PrimeScriptTM ＲT Enzyme 试剂盒说明书逆转录的 cDNA 用于 qPCＲ
扩增．
表 1 ＲACE的引物序列
Table 1 Primers used for ＲACE
引物名称 序列 (5 － 3)
HMGS － 5 － 1 CAGCCAGAGTGCTATGTTTAT
HMGS － 5 － 2 TTGTTTCGGAACCAGAGTAGC
HMGS － 3 － 1 TCTCGTATGGTAGTGGCTTAT
HMGS － 3 － 2 AATGTGATGAATGTCTCTGGA
HMGS － OＲF － F TCTAGGTTTTGCTGCGATGGAG
HMGS － OＲF － Ｒ GCTAGGTAACCAAACTAAACAACG
1．2．2 HMGS基因全长 cDNA序列的克隆 根据差
减文库中获得的 HMGS 基因片段，用 DNAMAN 设
计 ＲACE 引物(表 1)． PCＲ 扩增反应条件:94 ℃预
变性 5 min;94 ℃变性 30 s，52 － 58 ℃退火 30 s，72
℃延伸 2 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min．扩增产
物与 PMD18-T载体连接并转化 DH5α，重组质粒经
鉴定再送上海博尚生物公司测序．通过 DNAMAN软
件将克隆得到的 3和 5末端序列与已知部分 cDNA
序列拼接得到黄花水仙 2 号 HMGS基因的 cDNA全长序列．根据开放阅读框(open reading frame，OＲF)两
端序列设计验证引物，分别以金盏银台和黄花水仙 2 号的第一链逆转录产物为模板，同时扩增两品种的
HMGS基因编码区序列，用 DNAMAN软件对基因的 OＲF进行分析．
1．2．3 基因生物信息学分析 用 ProtParam tool在线软件(http:/ /web． expasy． org /protparam)进行氨基酸
序列基本理化性质分析;用 Tmpred 在线软件(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /SignalP /)进行氨基酸序列
跨膜推测;用 Softberry在线软件(http:/ / linux1． softberry． com /berry． phtml)进行亚细胞定位预测;用 Net-
Phos 2．0 在线软件(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /NetPhos /)进行磷酸化位点预测;用MEGA 5．2 软件构
建系统进化树．
1．2．4 HMGS 基因的实时荧光定量表达分析 以水仙 Actin 基因(GenBank 登录号:JN204912)为内参基
因，对 HMGS基因在两品种多花水仙盛花期花瓣和副冠中的表达量进行荧光定量分析．每个样品均进行 3
次重复试验，试验按照 SYBＲ Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行操作，数据采用 2 － ΔΔCT法分析．反应体系
为:12．5 mL SYBＲ Premix Ex TaqTM、0．5 μL上游引物、0．5 μL下游引物、2．0 μL cDNA和 9．5 μL DEPC水;
M:DL2000 Marker;1:3-ＲACE第2轮扩增产物;2:5-ＲACE第 2轮扩
增产物;3:黄花水仙2号 OＲF扩增产物;4:金盏银台 OＲF扩增产物．
图 1 多花水仙HMGS基因 cDNA克隆的 PCＲ产物电泳图
Fig． 1 PCＲ products of HMGS gene cDNA
反应程序为:94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 15 s，55
℃退火 35 s，40 个循环．反应用引物如下． ACTIN-F:5
－GAGACCTTCAATGTTCCTGCTATG －3;ACTIN-Ｒ:5 －
CTAACACCATCACCAGAATCCAAC － 3;HMGS-F:5 －
CAACACCCGTTCAGCCTATCA － 3;HMGS-Ｒ:5 － TC-
GATGCTCCATCACCTTCAT －3．
2 结果与分析
2．1 多花水仙 HMGS基因全长 cDNA序列的克隆
采用 ＲACE 技术从黄花水仙 2 号分别获得 1020
bp的 5端序列和 461 bp 的 3端序列．将差减文库中
获得的序列与 3和 5端序列拼接，获得约 1663 bp 的
全长 cDNA序列(图 1) ，包含一个 1413 bp的 OＲF，编
·092· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷
码 470 个氨基酸，41 bp的 5端非翻译区，208 bp的 3端非翻译区．
根据拼接的黄花水仙 2 号 HMGS基因 cDNA全长序列，在上下游分别设计引物，对黄花水仙 2 号和金
盏银台 HMGS基因的 OＲF进行 PCＲ扩增，获得约 1600 bp的条带(图 1)．测序结果表明，两品种 HMGS 基
因 cDNA的 OＲF均为 1413 bp，编码 470 个氨基酸，黄花水仙2号和金盏银台的HMGS基因分别命名为NtH-
MGS-H(GenBank登录号:KF731870)和 NtHMGS-J(GenBank 登录号:KF731871)．两个基因氨基酸比对结果
(图 2)显示存在 2个氨基酸位点的差异，分别在第 38(丙氨酸—苏氨酸)和 350位点(缬氨酸—丙氨酸)．
图 2 不同植物 HMGS氨基酸序列的多重序列对比
Fig． 2 Multiple alignment of HMGS amino acid sequences from different plants
2．2 多花水仙 HMGS基因的生物信息学分析
2．2．1 HMGS氨基酸的理化性质 通过在线软件 ProtParam推测两品种多花水仙 HMGS 氨基酸序列的基
本理化性质．结果显示:黄花水仙 2 号和金盏银台 HMGS 蛋白的分子质量分别为 52．3032 和 52．3012 ku;
理论等电点均为 6．04，表明均为酸性蛋白;总的负电荷残基(天冬氨酸 +谷氨酸)均为 54 个，正电荷残基
(精氨酸 +赖氨酸)均为 48 个;亲水性平均系数分别为 － 0．275 和 － 0．264，表明均为亲水性蛋白;稳定性
系数分别为 33．79 和 34．29，表明均为稳定蛋白．
2．2．2 HMGS基因的功能结构域 采用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的在线软件对 HMGS 基因所
编码的蛋白质进行功能结构域分析．结果(图 3)表明，该基因所编码的蛋白具有 HMG-CoA 结构域，属于
HMG-CoA家族成员．对 HMGS基因 OＲF进行 BlastX比对的结果显示:多花水仙与葡萄、大豆、蓖麻和玉米
HMGS基因的氨基酸相似系数分别为 83%、82%、82%和 81%，表明 HMGS 基因具有较高的同源性．采用
DANMAN软件对多花水仙与其他植物的 HMGS氨基酸序列进行多重序列比对．结果(图 2)表明，尽管不
同物种 HMGS氨基酸序列的 C端差异较大，但 N端相对比较保守．
·192·第 3 期 李科等:多花水仙 HMGS基因的克隆
图 3 HMGS的功能结构域
Fig． 3 Functional domain of HMGS
2．2．3 HMGS 蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位和磷酸化位点的预测 采用在线软件 SignalP-4．1 对信
号肽进行预测的结果显示:两品种多花水仙 HMGS均为非分泌性蛋白，不存在信号肽，可见 HMGS 蛋白在
游离核糖体上合成后，不进行蛋白转运． 采用在线软件 Tmpred 对氨基酸序列进行跨膜推测的结果显示，
HMGS蛋白含两个跨膜螺旋，一个是由内到外的跨膜结构，位于第 161 － 180 个残基之间，长度为 20 个氨
基酸，分值为 956;另一个是由外到内的跨膜结构，位于第 355 － 371 个残基之间，长度为 17 个氨基酸，分值
为 753．对这两个跨膜结构分值进行分析，推测两品种的 HMGS 蛋白属跨膜蛋白，其跨膜模型更倾向于 N
末端朝内的由内到外进行跨膜．采用 Softberry在线软件进行亚细胞定位预测的结果显示，两品种的 HMGS
蛋白定位于叶绿体的可能性较大．采用 NetPhos 2．0 Server 在线软件对 HMGS 蛋白进行预测的结果显示，
两品种的 HMGS蛋白磷酸化位点均为 28 个，均匀分布在整条肽链中．其中，丝氨酸磷酸化位点有 17 个，苏
氨酸磷酸化位点有 3 个，酪氨酸磷酸化位点有 8 个．上述分析表明，多花水仙 HMGS 蛋白存在丰富的磷酸
化位点，这些磷酸化位点可能参与 HMGS蛋白活性的调控．
2．2．4 HMGS基因的系统进化树 从 NCBI 下载其他植物的 HMGS 基因序列，构建 HMGS 基因的系统进
化树．从图 4 可以看出，黄花水仙 2 号与金盏银台处于同一分支，它们与单子叶植物玉米的进化距离较近，
与双子叶植物茶树、葡萄和人参等的进化距离相对较远．
图 4 HMGS基因的系统进化树
Fig． 4 Phylogenetic tree of HMGS gene
2．3 多花水仙 HMGS基因的表达量
荧光定量 PCＲ分析结果(图 5)表明:HMGS基因在两品种多花水仙盛花期花瓣与副冠中的表达量均
没有明显的差异，在金盏银台副冠中的表达量最高，而在花瓣中的表达量最低．
HMGS基因在黄花水仙 2 号花瓣的表达量略高于副冠，但在金盏银台副冠中的表达量却略高于花瓣．推
测该基因在两品种花朵不同部位间并不存在差异表达，表达量可能对两品种花香差异的影响不大．
3 讨论
水仙花香气成分非常复杂，目前对水仙花香气的研究集中在提取和分析检测上，以及对昆虫传粉行为
的影响上，花香物质的合成途径和机理的研究较少．本试验以黄花水仙 2 号和金盏银台花瓣抑制消减杂交
文库获得的 HMGS基因 uniEST为基础，结合 ＲACE技术克隆得到两品种多花水仙 HMGS 基因的 cDNA全
长序列，并对其进行了保守结构域和生物信息学分析，为进一步验证其在多花水仙中的功能提供参考．
·292· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷
图 5 多花水仙 HMGS基因的表达量
Fig． 5 Transcription levels of HMGS gene
甲羟戊酸途径几乎存在于所有的真核生物中，
HMGS作为甲羟戊酸途径第 2 个催化酶，因此对其
进行了较多的研究．前人研究表明，HMGS 存在两种
形式:线粒体形式和细胞质形式，这两种形式的
HMGS由不同基因编码［7］． 在老鼠和昆虫等动物中
发现线粒体中的 HMGS 催化产生的羟甲基戊二酸
CoA作为生产酮体的底物，但在植物中还未见报
道［8］．细胞质中的 HMGS 催化产生的羟甲基戊二酸
CoA经一系列酶促反应生成异戊烯焦磷酸，作为各
种类异戊二烯化合物的共同前体．研究表明，类异戊
二烯化合物在植物与环境的相互作用中扮演重要的
角色，如植物与植物、昆虫、细菌、动物等的相互作
用［9 － 13］．此外，类异戊二烯化合物在植物的生长发
育、膜的发生、光合作用和呼吸作用等生理活动中也起着重要的作用［14 － 19］．如土豆类倍半萜烯的积累能提
高其对病菌的抵抗力［20］;在番茄中转入橡胶树的 HMGS基因及在拟南芥中转入芥菜的 HMGS 基因均可提
高甾醇的含量［21 － 22］． HMGS基因对多花水仙甲羟戊酸代谢途径及对花香有什么样的影响，是本试验感兴
趣的问题．本试验获得了多花水仙 HMGS基因 cDNA全长序列为进一步研究其在水仙生理活动中的作用
提供了重要的基因资源．
许多植物的 HMGS基因存在多个拷贝，如芥菜中有 4 个 HMGS 基因(BjHMGS1 － BjHMGS4)［23］，巴西
橡胶树有 2 个 HMGS基因(HbHMGS1 和 HbHMGS2)［24］．多花水仙 HMGS基因是否也存在多个拷贝有待进
一步研究．
黄花水仙 2 号和金盏银台两个品种的花香差异明显，但荧光定量 PCＲ分析结果表明:HMGS基因在两
品种间的表达量没有明显的差异． HMGS基因是否影响水仙花香形成还需进一步验证．此外，花香成分的
测定及对甲羟戊酸途径中其他基因的研究，将有助于进一步了解多花水仙花香形成的机理．
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(责任编辑:施晓棠)
·492· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷