全 文 ：第 33 卷 第 9 期
2 0 1 5 年 9 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 33 No． 9
Sep． 2 0 1 5
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刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 09． 055
HPLC法测定尖叶假龙胆中
雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮含量
刘洋洋1，2，3，李春娜1，2，3，时晓娟1，2，3，李朋收1，2，3，魏颖1，2，3，
李博1，2，3，王东超1，2，3，徐暾海1，2，3，刘铜华2，3
(1．北京中医药大学中药学院，北京 100029;2．北京市中医养生学重点实验室，北京 100029;
3．教育部中医养生学重点实验室，北京 100029)
摘 要:目的:建立 HPLC法同时测定尖叶假龙胆中雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的含量。方法:色
谱柱:Thermo Syncronis C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相:0． 5%磷酸水(A)－乙腈(B) ，梯度洗脱，0 ～ 15 min，
40% ～45% B，15 ～ 30 min，45% ～60% B;检测波长:254 nm;柱温:30℃ ;流速:1． 0 mL·min －1。结果:雏菊叶龙
胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮分别在 1． 99 ～ 79． 52 μg·mL －1(Ｒ2 = 0． 999 9)、2． 28 ～ 56． 90 μg·mL －1(Ｒ2 =
0． 999 7)范围内线性关系良好;平均加样回收率(n = 9)分别为 100． 01%(ＲSD = 1． 50%)、100． 65%(ＲSD =
1. 14%)。结论:该方法简便、快速、准确、可靠，为尖叶假龙胆的质量控制提供参考。
关键词:尖叶假龙胆;HPLC;含量测定;雏菊叶龙胆酮;去甲基雏菊叶龙胆酮
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)09-2246-03
Determination of Bellidifolin and Norswertianolin from Gentianella Acuta by HPLC
LIU Yangyang1，2，3，LI Chunna1，2，3，SHI Xiaojuan1，2，3，LI Pengshou1，2，3，
WEI Ying1，2，3，LI Bo1，2，3，WANG Dongchao1，2，3，XU Tunhai1，2，3，LIU Tonghua2，3
(1． Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;
2． Beijing Key Laboratory of Health － cultivation，Beijing 100029，China;
3． Health － cultivation Laboratory，the Ministry of Education，Beijing 100029，China)
Abstract:Objective:To establish the quantitative analysis method for bellidifolin and norswertianolin from Gentianella
acuta． Methods:High performance liquid chromatography (HPLC)was performed on a Thermo Syncronis C18 (4． 6 mm
× 250 mm，5 μm)． The water with 0． 5% phosphoric acid (v /v)was used as an aqueous solvent (A)and CH3CN as an
organic solvent (B)with gradient at a flow rate of 1． 0 mL·min －1 ． The detection wavelength was 254 nm and the col-
umn temperature was set at 30 ℃ ． Ｒesults:The quantitative analysis by HPLC showed that the linear range of bellidifolin
and norswertianolin was 1． 99 ～ 79． 52 μg·mL －1(Ｒ2 = 0． 999 9) ，2． 28 ～ 56． 90 μg·mL －1(Ｒ2 = 0． 999 7) ，respective-
ly． The average recovery of samples above was，in order，100． 01% (ＲSD = 1． 50%)and 100． 65% (ＲSD = 1． 14%)．
Conclusion:The method was simple，rapid，accurate and reliable，which provided a reference for the quality control of Gen-
tianella acuta．
Key words:Gentianella acuta;high performance liquid chromatography;content determination;bellidifolin;norswer-
tianolin
收稿日期:2015 － 04 － 15
基金项目:北京市教委共建项目(20110701) ;北京中医药大学创新
团队项目(2011 － CXTD － 19)
作者简介:刘洋洋(1988 －) ，男，山东淄博人，硕士研究生，研究方
向:中药活性物质基础研究。
通讯作者:徐暾海(1969 －) ，男，教授，博士，研究方向:中药活性成
分研究。
尖叶假龙胆 Gentianella acuta (Michx．)Hulten，别名
“苦龙胆”，为龙胆科(Gentiananceae)假龙胆属(Gentianella
Moench．)植物，主要分布于我国东北及华北地区。以全草
入药，多用于蒙、藏医学中，蒙药中称为“阿古特 － 其其
格”，藏药中称为“桑地格”，在《中国民族药志要》、《内蒙古
植物药志》、《蒙药验方》中均有记载。其味苦，性凉，具有
清热利湿，利胆退黄，健胃，愈伤等功效。
尖叶假龙胆中主要含有 酮类、环烯醚萜类、黄酮类及
少量三萜、甾体类成分［1 － 5］，其中 酮类成分是其主要有效
成分。现代药理研究表明，尖叶假龙胆中的 酮类成分雏
菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮具有抗心律失常［6 － 7］、
改善胰岛素抵抗［8］、保护缺血性脑损伤［9 － 10］、抗氧化［11］等
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功效，是尖叶假龙胆中的主要活性成分，具有良好的应用前
景。
在尖叶假龙胆质量控制方面，相关文献报道仅有 nor-
swertianolin［12］和 3 个 酮苷［13］的含量测定。为进一步完
善尖叶假龙胆质量评价方法，本研究采用 HPLC 法建立同
时测定尖叶假龙胆中两个主要活性成分雏菊叶龙胆酮和去
甲基雏菊叶龙胆酮的含量测定方法，为尖叶假龙胆药材的
质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 岛津 LC － 15C高效液相色谱仪配备柱温箱、
DAD检测器、二元泵、LC Solution工作站(日本岛津公司) ，
FW177 型中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司) ，Mil-
lipore － Q超纯水制备仪(法国密理博公司) ，JH3102 型电
子天平(百分之一，上海精密科学仪器有限公司) ，
MS205DU型电子天平(百万分之一，瑞士梅特勒 －托利多
公司) ，ML54 型电子天平(万分之一，瑞士梅特勒 －托利多
公司) ，KQ －500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器
有限公司) ，移液枪(德国 Brand公司)。
1． 2 试药 对照品 I、II为实验室自制，通过 UV、NMＲ、ESI
－ MS结构鉴定分别为雏菊叶龙胆酮(I)和去甲基雏菊叶
龙胆酮(II) ，HPLC测定其纯度均不低于 99%，符合含量测
定要求。水(Millipore － Q 制超纯水) ，乙腈(色谱纯，美国
Fisher公司) ，甲醇和乙醇(分析纯，北京化工厂)。
1． 3 药材 尖叶假龙胆药材由北京中医药大学中医药博物
馆药学部马泽新主任提供(采自内蒙古呼伦贝尔市海拉尔
区) ，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为龙胆科
假龙胆属植物尖叶假龙胆(Gentianell aacuta)的干燥全草。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱:Thermo syncronis C18(250 mm ×
4． 6 mm，5 μm ) ，流动相:水 (A ) －乙腈(B ) ，梯度洗脱，
0 ～ 15 min，40% ～ 45% B，15 ～ 30 min，45% ～ 60% B;流
速:1． 0 mL·min －1，检测波长:254 nm，柱温:30℃，进样量:
20 μL。对照品及样品的色谱图见图 1 和图 2。
I．去甲基雏菊叶龙胆酮，II．雏菊叶龙胆酮
图 1 混合对照品溶液的 HPLC图
2． 2 对照品溶液的制备 取对照品 I、II 各适量，精密称
定，分别置于 50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制
成含对照品 I、II浓度分别为 198． 8、227． 6 μg·mL －1的单
一成分对照品溶液，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各
图 2 尖叶假龙胆供试品溶液的 HPLC图
0. 1 mL，置 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混
合对照品溶液。
2． 3 供试品溶液的制备 药材粉碎，过 60 目筛，精密称取
干燥至恒重的样品粉末 0． 2 g，置 50 mL 具塞锥形瓶中，加
50 mL甲醇，摇匀，称重，超声处理(功率 400 W，频率 40
kHz)30 min，再称重，以甲醇补足减失的重量，摇匀，用0． 45
μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2． 4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液 I(0． 1、
0． 8、1． 5、2． 0、3． 0、4． 0、5． 0 mL)、II(0． 1、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、
2． 5、3． 0 mL)于不同 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分
别精密吸取上述稀释液各 20 μL，按“2． 1”项下色谱条件依
次进行测定，记录峰面积。以峰面积值(Y)对质量浓度
(X，μg·mL －1)进行线性回归分析，结果见表 1。
表 1 对照品 I、II的线性关系及线性范围(n = 6)
对照品 回归方程 Ｒ2 线性范围(μg·mL －1)
I y = 80 363x － 76 967 0． 999 9 1． 99 ～ 79． 52
II y = 118 397x － 103 440 0． 999 7 2． 28 ～ 56． 90
2． 5 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液 20 μL，按
“2． 1”项下色谱条件，重复进样 6 次，记录峰面积。结果显
示，对照品 I、II峰面积的 ＲSD分别为 0． 51%、0． 48%，表明
仪器精密度良好。
2． 6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，室温下放
置，分别于 0、2、4、8、12、24 h，按“2． 1”项下色谱条件下进行
分析。测得雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的峰面积
ＲSD分别为 0． 91%、0． 91%，表明供试品溶液在 24 h 内稳
定性良好。
2． 7 重复性试验 精密称取同一批尖叶假龙胆药材粉末
6 份，按“2． 3”项下方法制备供试品溶液，按“2． 1”项下色谱
条件进行测定，记录峰面积，计算含量。结果显示，雏菊叶
龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的平均含量分别为 13． 95、
6． 38 mg·g －1;ＲSD分别为 1． 66%、1． 89%，表明该方法重
复性良好。
2． 8 回收率试验 取已知含量的尖叶假龙胆药材粉末 9
份，每份约 0． 1 g，精密称定，分为 3 组，分别加入对照品 I
溶液 8． 42、7． 02、5． 70 mL，对照品 II 溶液 2． 24、2． 80、3． 36
mL，分别按“2． 3”项下方法制备供试品溶液，按“2． 1”项下
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色谱条件进行分析，结果见表 2。
表 2 尖叶假龙胆中雏菊叶龙胆酮和
去甲基雏菊叶龙胆酮的加样回收率试验(n = 9)
成分
称样量
(g)
样品中量
(g)
加入量
(g)
测得量
(g)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
ＲSD
(%)
I 0． 105 3 1． 468 7 1． 673 9 3． 157 7 100． 48 100． 36 1． 66
0． 103 2 1． 439 4 1． 673 9 3． 051 3 98． 01
0． 103 5 1． 443 6 1． 673 9 3． 167 1 101． 59
0． 100 8 1． 405 9 1． 395 6 2． 813 8 100． 44
0． 103 8 1． 447 8 1． 395 6 2． 847 9 100． 16
0． 100 8 1． 405 9 1． 395 6 2． 781 0 99． 27
0． 102 7 1． 432 4 1． 133 2 2． 499 7 97． 43
0． 103 9 1． 449 1 1． 133 2 2． 646 1 102． 47
0． 101 8 1． 419 9 1． 133 2 2． 559 0 100． 23
II 0． 105 3 0． 671 5 0． 509 8 1． 185 4 100． 35 100． 96 1． 81
0． 103 2 0． 658 1 0． 509 8 1． 197 9 102． 57
0． 103 5 0． 660 0 0． 509 8 1． 164 7 99． 56
0． 100 8 0． 642 8 0． 637 3 1． 277 3 99． 78
0． 103 8 0． 661 9 0． 637 3 1． 302 4 100． 25
0． 100 8 0． 642 8 0． 637 3 1． 296 0 101． 24
0． 102 7 0． 654 9 0． 764 7 1． 448 1 102． 01
0． 103 9 0． 662 5 0． 764 7 1． 410 4 98． 82
0． 101 8 0． 649 1 0． 764 7 1． 432 3 101． 31
2． 9 含量测定 分别取尖叶假龙胆药材的根、茎、花的粉
末 0． 1g，分别按“2． 3”项下方法制备供试品溶液，按“2． 1”
项下色谱条件进行分析，重复进样 3 次，以峰面积按外标法
计算尖叶假龙胆不同部位中雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶
龙胆酮的含量，结果见表 3。
表 3 尖叶假龙胆不同部位中雏菊叶龙胆酮和
去甲基雏菊叶龙胆酮的含量(mg·g －1，n = 3)
部位
雏菊叶龙胆酮
批次 1 批次 2 批次 3
去甲基雏菊叶龙胆酮
批次 1 批次 2 批次 3
根 7． 90 7． 63 8． 11 2． 11 2． 01 2． 32
茎 8． 37 8． 25 9． 15 3． 88 3． 70 3． 92
花 22． 98 21． 88 23． 05 10． 31 10． 15 10． 57
3 讨论
3． 1 检测波长的选择 取雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶
龙胆酮混合对照品溶液，在 190 ～ 400 nm波长下扫描，结果
显示，雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮在 254 nm处有
较大紫外吸收。
3． 2 流动相的选择 由于所测定的成分雏菊叶龙胆酮和
去甲基雏菊叶龙胆酮含有多个酚羟基，本研究考察了甲醇
－水、乙腈 －水、甲醇 － 0． 5%磷酸水、乙腈 － 0． 5%磷酸水
等多种流动相系统，结果显示，选用甲醇 －水和乙腈 －水作
为流动相时，峰形拖尾，分离度差;采用甲醇 － 0． 2%磷酸水
洗脱，去甲基雏菊叶龙胆酮与相邻的色谱峰的分离效果不
如乙腈 － 0． 5%磷酸水，故选用乙腈 － 0． 5%磷酸水梯度洗
脱作为流动相。
3． 3 提取方法的选择 本研究分别考察了甲醇、乙醇对尖
叶假龙胆药材粉末提取率的影响，结果显示，在相同的条
件下，甲醇的提取率高于乙醇。同时考察了不同超声时
间(20、40、60 min)对尖叶假龙胆药材粉末提取率的影
响，结果显示，超声 40 min时药材的提取率明显高于 20
min，60 min与 40 min 的提取率无明显差异。故选择甲
醇超声提取 40 min。同时还考察了 25、50、75、100 mL
甲醇对提取率的影响，结果表明，50、75、100 mL 甲醇均
可提取完全，考虑到溶剂用量和样品浓度，故选用 50
mL 甲醇作为提取溶剂。
3． 4 样品的测定 实验结果表明，尖叶假龙胆不同部位
中雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的含量差异较
大，其中，以花的含量最好，茎的含量次之，根的含量最
少。由此可见，尖叶假龙胆中主要活性成分主要集中在
其花中。
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