全 文 ：越橘产黄酮类化合物内生真菌的筛选
李姝诺1 , 李亚东1 , 王　琦2
1.吉林农业大学园艺学院 , 长春 130118;2.吉林农业大学中药材学院 , 长春 130118
摘　要:从越橘(Vaccinium)属植物的叶片和茎中共分离出 176株内生真菌。应用显色反应对 176 株越橘内生
真菌的发酵产物进行初步分析 ,筛选出 2 株产黄酮类化合物的内生真菌 Y2-3 和 L5-5 ,经鉴定 1 株为细链格
孢(Alternaria .tenuissima),另一株为无孢菌株。利用高效液相色谱(HPLC)进一步检测。应用薄层层析检测出
菌株所产生的黄酮类化合物与越橘原植物产生的黄酮类化合物相同或相似 , 利用分光光度法测定出其总黄
酮含量。
关键词:越橘;内生真菌;黄酮类化合物
中图分类号:S663.9;Q949.32　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)05-0587-05
Bolting Flavonoid-Producing Endophytic Fungi from Vaccinium
LI Shu-nuo1 , LI Ya-dong1 , WANG Qi2
1.College of Horticulture , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Collegeof Chi-
nese Medicinal Materials , J ilin Agricultural University , Changchun 130118 , China
Abstract:One hundred and seventy-six endophytic fungi were isolated from the leaves and stalks of Vac-
cinium.Their liquid fermentation broth and extract of mycelia were initially analyzed with color reaction
andHPLC , and further detected with TLC.Finally two endophytic fungi Y2-3 and L5-5 that could
produce flavonoid were obtained and identified as A.tenuissima and a Mycelia sterilia.
Key words:Vaccinium;endophytic fungi;flavonoid
　　越橘为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccini-
um)植物 ,是多年生落叶或常绿灌木 、小灌木树
种。越橘果实营养丰富 ,具有增强心脏功能 、保护
毛细血管 、改善微循环系统等功效以及较强的明
目功能 ,是一种有较高经济价值和广阔开发前景
的新兴果树 ,被联合国粮农组织列为人类五大健
康食品之一[ 1] 。
内生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史
中某一时期生活在植物组织细胞内或细胞间隙 、
对寄主植物组织不引起明显的病害症状的真菌。
它包括了那些生活史某一阶段为表面生的腐生真
菌 、对寄主暂时没有伤害的潜伏性病原菌 ,但不包
括菌根真菌[ 2] 。研究发现内生真菌能促进寄主生
长 、提高寄主抗逆性 、增强宿主竞争力 、提高寄主
的抗病性等。另外 ,内生真菌对植物产生的某些
药效成分的形成有重要影响 ,甚至会产生与其寄
主相同或相似的生理活性成分[ 3] 。利用内生真菌
生产生物活性物质具有大规模培育易控制 ,生产
成本低 、周期短 ,可获得大量产物的优点 ,对保护
植物资源和保证药物供应等有重要的意义。
本研究以越橘为研究对象 ,从中分离内生真
菌 ,以期寻找和筛选能产生黄酮类活性物质的微
生物资源 ,为利用发酵法大规模生产有价值的药
用成分提供科学参考 ,并为开发植物药生产的新

通讯作者
基金项目:公益性行业科研专项(nyhyzx07-028 , 2006-G25),吉林省科技发展重点项目(2007-5013)
作者简介:李姝诺 ,女 ,硕士 ,主要从事果树种质资源与生物技术研究。
收稿日期:2008-12-20　　修回日期:2009-02-28
吉林农业大学学报　2009 ,31(5):587 ～ 591 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
途径提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　菌株
采集吉林农业大学小浆果园 56个越橘品种
的健康叶片和茎中分离内生真菌。对照为越橘原
植物叶片(芝妮)。
1.2　培养基
(1)分离培养基:WA(水 、琼脂)培养基;(2)纯
化培养基:PDA(马铃薯 、葡萄糖 、琼脂 、水)培养
基;(3)液体发酵培养基:PD(马铃薯 、葡萄糖 、水)
培养基。
1.3　方法
1.3.1　内生真菌的分离 、纯化 　将越橘健康叶
片和茎用自来水冲洗干净 , 晾干水分 。依次用
96%乙醇消毒 30 s 、2.5%次氯酸钠消毒 60 s 、
96%乙醇消毒 30 s[ 4] ,再用无菌水冲洗 2 ～ 3次。
进行组织块印迹法检测:选取整片叶片放在WA
培养基上 ,25℃下恒温培养 7 d ,观察记录是否有
真菌生长 ,有菌丝长出证明此方法可以分离出内
生真菌 ,即可进行内生真菌的分离。在无菌状态
下 ,取处理后的越橘叶片和茎切成 0.3 cm ×
0.3 cm 的小片接种于WA 培养基内 ,每个平皿内
接种 10块组织块 ,置(25±1)℃条件下避光静止
培养 。培养过程中 ,观察叶片边缘有无菌丝长出。
每日观察内生真菌的生长情况 ,将切口处新
长出的菌丝挑取尖端部分转接至 PDA 培养基上 ,
纯化培养直至获得纯菌株 。纯化后的菌株接种于
PDA斜面培养基上 ,在 4℃条件下保存 。
1.3.2　液体发酵培养　(1)一级发酵。用直径为
6 mm的打孔器在纯化后生长良好的菌落边缘处
打孔 , 取菌饼接种到装有 100 mL PD 培养液的
250 mL锥形瓶中 ,置于摇床上 , 22℃下 120 r/min ,
培养7 ～ 10 d。
(2)二级发酵。将一级发酵产物接种于装有
200 mL培养液的 500 mL 锥形瓶中 ,置于摇床上 ,
22℃下 120 r/min ,振荡培养 7 ～ 10 d。
(3)发酵菌丝体的处理 。取二级发酵产物 ,用
布氏漏斗抽滤 ,把菌丝体和发酵液分开 。菌丝体
用蒸馏水冲洗 3 次后 ,放入电热恒温鼓风干燥箱
中55℃恒温干燥 。
把完全干燥的菌丝体放研钵内研成粉末 ,置
干燥器内备用。
1.3.3　黄酮类化合物的提取　取菌丝粉末 75 g ,
按固液比 1∶10加入75%酸性乙醇 ,于索氏提取器
内60℃浸提 3次 ,每次2 h 。合并3次滤液后减压
浓缩 ,用水定容至 100 mL备用 。发酵液于旋转蒸
发仪中60℃减压浓缩得棕色黏稠物 ,按固液比 1∶
10加入 75%酸性乙醇 ,在索氏提取器内 60℃浸提
3次 ,每次 2 h。合并 3次滤液后浓缩 ,用水定容
至100 mL 备用[ 5] 。合并以上菌丝和发酵液提取
物 ,制得检测样品。
1.3.4　越橘原植物黄酮类化合物的提取　称取
越橘原植物“芝妮”干燥叶片 15 g ,用滤纸包好 ,按
本文“1.3.3”方法进行活性成分的提取 。
1.3.5　检测及鉴定方法　(1)颜色反应 。 ①盐
酸-镁粉反应:取待测样品 1 mL 置于试管中 ,加
入镁粉适量 ,再逐滴加入浓盐酸数滴。 ②三氯化
铝反应 。将待测样品点在滤纸片上 ,喷 1%的三
氯化铝溶液 ,干燥后于紫外灯下观察。 ③醋酸铅
反应。取待测样品 1 mL置于试管中 ,加入醋酸铅
数滴;④氢氧化钠反应。取待测样品 1 mL置于试
管中 ,加入 1%的氢氧化钠 。⑤浓硫酸反应:取待
测样品1 mL置于试管中 ,加入浓硫酸。
(2)高效液相色谱检测[ 6] 。将 Y2-3发酵液
样品在 40℃下减压浓缩干燥后 ,取适量置于盐酸
终浓度为 1.5 mol/L 的 50%甲醇溶液中 ,于 65℃
回流酸化处理 2 h ,冷却至室温过滤 ,做适当稀释
后用 0.22μm微孔滤膜过滤 ,所得滤液供HPLC分
析用 。色谱条件:色谱柱 C18柱(250 mm×4.6 mm ,
5 μm), 柱温 20℃;检测波长 368 nm , 流动相为
V(甲醇)∶V (0.4%磷 酸)= 60 ∶40 , 流 速
1.0 mL/min;进样量 10μL。对照品为芦丁标准品
和槲皮素标准品 ,处理方法同样品 。
(3)薄层层析 。将颜色反应为阳性的样品与
越橘原植物黄酮提取物 、芦丁标准品一起点于硅
胶板上进行薄层层析。展开系统:展开剂 Ⅰ为 V
(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=90∶5∶5;展开剂 Ⅱ为 V
(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=1∶4∶5。显色剂为
1%三氯化铝乙醇溶液 ,在紫外灯下观察结果。
(4)样品总黄酮含量的测定 。采用分光光度
计分析测定样品中的总黄酮含量[ 7] 。
芦丁对照品的配制:精密称定芦丁标准品
25 mg ,置于 100 mL量瓶中 ,加无水乙醇 10 mL ,置
水浴中使溶解 。冷却 ,加乙醇稀释至刻度 ,摇匀。
分别取芦丁对照品 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 mL
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Journal of Jilin Agricultural University 2009 , October
和纯水 1 mL 置于 25 mL 量瓶中 , 各加纯水至
6 mL;加 5%NaNO3 1 mL ,混匀后放置 6 min;加
10%Al(NO3)3 1 mL , 混匀后放置 6 min;加 25%
NaOH 10 mL ,再加水至刻度 ,混匀后放置 15 min。
以加纯水的样品为对照 ,在 500 nm处测吸光度 。
内生真菌样品分别取 3 mL 置于 25 mL 量瓶
中 ,其余处理方法同芦丁对照品处理方法。
1.3.6　菌株形态学鉴定　挑取纯化的菌株前端
菌丝 ,接种于 PDA 培养基上 ,培养一段时间后观
察菌落 、菌丝体和孢子的形态等特征并进行形态
学鉴定。用接种针从斜面上蘸取极少量孢子于平
板上适当的位置 ,倒置放于恒温培养箱中 25℃下
培养 3 ,7 ,10 d ,观察菌落特征(菌落大小 、颜色 、表
面特征 、质地和生长速度等)。分别从菌落边缘及
中心处挑取少量菌丝 ,点植培养法[ 8]培养:点植于
涂有 PDA 培养基的载玻片上 ,25℃恒温培养箱中
培养 2 d ,再置于显微镜下 ,进行个体形态镜检(菌
丝 、子实体 、孢子和产孢结构等)。
2　结果与分析
2.1　越橘内生真菌的分离结果
从越橘的叶片和茎中共分离出 176株内生真
菌 ,结果见表 1。试验结果表明内生真菌在越橘
各组织内普遍存在 ,但在不同组织中的分离率有
一定差异。由表 1可知 ,在越橘茎中内生真菌的
分离率相对较高。
表 1　越橘内生真菌的分离率
Table 1.Isolating rate of endophtic fungi of Vaccinium
组织
Tissue
接种块数
Inoculum quantity
有菌丝生长的块数
Mycel growing
quantity
分离率/ %
Isolating rate
叶片
Leaf
茎
Stalk
300
300
54
122
18.0
40.7
2.2　产黄酮类化合物菌株的定性筛选结果
通过黄酮类物质的特征性颜色反应 ,对分离
出的内生真菌进行产黄酮类化合物的定性筛选。
由表 2可知 ,菌株 Y2-3的菌丝体和发酵液样品
的所有显色反应均为阳性 ,菌株 L5-5的菌丝体
所有显色反应均为阳性反应 ,因此选取 Y2-3和
L5-5为主要研究对象 ,进一步对其产黄酮类化
合物特性进行研究。
表 2　显色反应结果分析
Table 2.Results and analysis of color reaction
反应类型
Category
反应现象
Phenomenon
结果与分析
Consequence and analysi s
盐酸-镁粉 Y2-3发酵液 、L5-5菌丝体产生大量红色泡沫 , Y2-3菌丝体产生少量红色泡沫 ,其他样品为阴性反应 可能含有黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、二氢黄酮醇等黄酮类化合物
三氯化铝 Y2-3菌丝体和发酵液 、L5-5菌丝体均产生较强的黄色荧光 , 其他样品为阴性反应 可能含有 3—OH 或 5—OH 黄酮苷类化合物
醋酸铅 Y2-3菌丝体和发酵液 、L5-5菌丝体均产生黄色沉淀 ,其他样品为阴性反应 可能含有黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、查尔酮 、异黄酮
氢氧化钠 Y2-3发酵液由橙色变为深红 , Y2-3菌丝体 、L5-5菌丝体由橙色变为淡红 ,其他样品为阴性反应 可能含有查尔酮
浓硫酸 Y2-3发酵液 、L5-5菌丝体由橙色变为深紫 , Y2-3菌丝体由橙色变为淡紫 ,其他样品为负反应 可能含有黄酮醇 、二氢黄酮 、查尔酮
2.3　高效液相色谱结果
标准品和水解样品以同样条件进样 ,样品 2
个峰的保留时间分别与对照品芦丁和懈皮素非常
接近 ,确定水解样品中主要含有芦丁和槲皮素 2
种黄酮苷元(峰A 、B),峰 C 经多次改变色谱条件
确定其为一个混合的峰 ,可能是色素类混合物质。
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吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
2.4　薄层层析结果
由图 2可见 ,经 2种展开剂[图 2 中A.V(甲
醇)∶V(醋酸)∶V(水)=90∶5∶5;B.V(正丁醇)∶
V(乙酸)∶V(水)=1∶4∶5)]对菌株 Y2-3和 L5-5
的检测样品 、芦丁标准品和越橘原植物叶片提取
物对照进行薄层层析 ,发现检测样品有与对照品
迁移率相同 、颜色一致的斑点(图 1),说明样品中
可能含有 2种与越橘原植物叶片提取物相同的化
合物 。
图 1　薄层层析图谱
Fig.1.Chromatogram of TLC
2.5　菌株总黄酮含量检测结果
(1)芦丁标准曲线。以芦丁标准溶液的浓度
c 与吸光度A 作标准曲线 ,用最小二乘法经线性
回归 ,得回归方程为 y =10.228 6x +0.003 6 , r=
0.999 9。
　　(2)样品总黄酮含量的检测结果 。吸取样品
液于石英比色皿中 ,按标准芦丁吸光度测定法 ,以
样品液空白为对照 ,于 500 nm波长下测定吸光度
值 ,计算提取液中总黄酮的含量 。经计算 ,菌株
Y2-3菌丝体提取物总黄酮含量为 0.693 mg/mL ,
发酵液提取物总黄酮含量为 3.951 mg/mL;L5-5
菌丝体提取物总黄酮含量为 1.100 mg/mL。
2.6　菌株形态学鉴定结果
经鉴定 , Y2-3 为无孢菌群(Mycelia sterilia)。
L5-5菌落轮纹状生长 ,初为无色 ,后变为深绿
色 ,成熟后正 、反面均为深褐色 ,8 d 后出现轮纹 ,
边缘整齐;菌丝及气生菌丝发达 ,初无色 ,后为不
同程度的褐色 ,分隔 ,多分枝。分生孢子单生或短
链生 ,棍棒形 、卵形 、倒梨形或近椭圆形 ,淡褐色或
褐色 ,3 ～ 8 个横膈膜 , 1 ～ 4 个纵斜隔膜 ,孢身
(22.5 ～ 40.0)μm×(8.0 ～ 13.5)μm 。鉴定为交链
格孢(A.alternata)[ 9](图 2)。
a.10 d时的菌落 Morphous characteristics at 10 days;b.分生孢子 Conidiospore
图 2　L5-5的菌落和分生孢子的显微结构
Fig.2.Morphous characteristics and microscopic characteristics of L5-5
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3　讨　论
本试验首次筛选出产黄酮类化合物的越橘内
生真菌 ,经鉴定为 1株交链格孢(A.alternata)菌
和 1株无孢真菌(Mycelia sterilia),并证明了所产
黄酮类化合物与越橘原植物结构相同或相似 。
1993年 Strobel[ 10]从短叶红豆杉(Taxus brevi-
folia Nutt)中分离出1株内生真菌———安德鲁紫杉
菌(Taxomyces andreanae),能产生新型抗癌药物紫
杉醇(Taxol),使紫杉醇的来源从珍稀植物红豆杉
扩大到了生长迅速 、成本低的内生真菌;郭波
等[ 11]从长春花中分离到 4 株能产生长春新碱类
似物的内生真菌;Lu 等[ 12]从黄花蒿(Artemisia an-
nua Li.)茎中分离的内生真菌能产多种抗真菌活
性物质。以上结果都表明生活在植物体内这一特
殊进化环境中的内生真菌能产生与寄主相同或相
似的具有生理活性的代谢产物 。
越橘茎叶和果实中含有多种黄酮类化合物 ,
能够祛痰 、平喘 、抗菌消炎等 ,但提取成本较高 、资
源有限。本试验为提取越橘黄酮类化合物提供了
新的途径 ,利用内生真菌生产生物活性物质易于
大规模培育控制 ,生产成本低 ,周期短 ,可获得大
量产物。本试验结果为将来利用工业发酵方法大
量生产药用黄酮类物质提供了依据 ,对开发利用
越橘资源有重要意义 。
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