全 文 ：植 物 学 报 19 9 , 41 ( l) : 45 一 50
通C如 刀侧白时交口 S加交口
矮牵牛花同源异型基因 刀功2 的克隆及其对
烟草花形态的影响
于静娟 国凤利 赵德刚 傅永福 韩玉珍 敖光明 孟繁静
(中国农业大学生物学院 北京 1《x众抖
摘要 以矮牵牛 ( 凡。刀如 hbr 城为 L
.
)栽培品种为材料 ,取开放前的花蕾分离 m丑N A ,反转录合成 cD NA , 以 c l〕N A 为模
板 ,通过代 R 扩增 ,对获得的目的片段进行序列分析。 结果表明 ,分离的目的片段含有 6 86 个核昔酸 (含有起始密码
和终止密码 ) 。 核昔酸序列与文献报道相比 , 同源率为 9 . 6 % , 只有 3 个碱基发生改变 , 5 `端的 M AI ) S 盒区域完全相
同。 将得到的矮牵牛花同源异型基因少酥论 的 cND (A 1尹玩沱 )与 C a M v 35 启动子和 NO S 3 ,终止子融合 ,构建了表达载
体 pBBPZ
。 表达载体通过农杆菌 (人护 )b
~ um
t理州加 ic 醚 ) L B A今牡科 ( pA14 《 ” )介导转化烟草 (八趾以~ abt ac um L
.
)
叶片 ,在含有 10 111留L卡那霉素的抗性培养基上再生成株 。 对抗性株进行总 ND A 阮 U d l e m 杂交和总 RN A 的点杂
交 ,证明目的基因已导人烟草细胞中 , 整合到烟草基因组上 ,并且在烟草细胞中转录 。 同源异型基因 `而 2 导人烟草
后导致烟草花型改变 ,在雄蕊上产生了花瓣 。
关键词 矮牵牛 , 同源异型基因 , cD N A , 烟草 , 表达 ,花
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犯服吐 ~ h e d in e x P re s ion of
一些花同源异型基因的分离和鉴定 ,使人们对
高等植物生殖器官形成这一重要过程产生了极大兴
趣 。 近年来 ,通过对拟南芥和金鱼草花同源异型突
变体的研究 , 已经形成了一个统一的决定花器官特
征的基因控制模型 〔` ,lz 。 在这一模型中 , 从花分生
组织到花器官的形成主要由三类基因 ( A 、 B 和 )C 控
制 ,每一类基因均在相邻的两轮花器官中起作用 , 即
A 类基因参与警片和花瓣的形成 , B 类基因参与花
瓣和雄蕊的形成 , C类基因则在雄蕊和雌蕊的发育
中起作用 。 在第一轮花器官中 , A 类基因单独控制
尊片的形成 , A 和 B 共同决定第二轮器官 (花瓣 )的
分化 ;B 和 C决定雄蕊的形成 ;C 类基因则单独控制
心皮的发育 。 这一模型的提出为进一步研究拟南芥
和金鱼草中不同同源异型基因之间的相互作用提供
收稿 日期 : 1卯7切切 接受日期 : l卯8一03 -02
植 物 4 1卷
了重要线索 。 但在矮牵牛和其它一些植物 (如郁金
香和百合 )中 ,许多野生型及同源异型突变体花的发
育不完全符合上述模型 , 这些植物花器官的同源异
型转变往往发生于一轮器官或几轮器官 。 A n g e n e n t
等 s[] 从矮牵牛中分离了两个同源异型基因加 1 和
刀劝2 ,其中刀劝2 不同于正常的 A 、 B 、 C 组基因在相邻
两轮中表达 , 而在花瓣 、 雄蕊和心皮三轮中表达 ,并
且在警片中也有低水平的表达 。 在绿色花瓣突变体
( gP )中其表达不受影响 。 转基因共抑制 刀冲2 基因
在矮牵牛中的表达 , 导致产生了 2 、 3 、 4 轮器官被修
饰的花 :小的绿色花冠 ;雄蕊着生的位置出现绿色花
瓣状结构 ;最内轮的雌蕊显著退化 。 这些结果表明
刀劝2 属于一类新型的参与决定花特异性的形态建成
基因 [’] 。 揭示 刀劝2 基因功能的研究将会推动对花
发育的研究 。 刀知2 基因的时空表达及转基因共抑制
其表达对矮牵牛花的影响的研究都已报道 s[, 4〕 , 但
未见关于刀劝2 的异源表达的研究 。 我们从矮牵牛
花蕾中克隆得到尹功2 基因 , 并将其转化烟草 , 期待
通过 刀功2 异源表达对烟草花形态的影响进一步研
究刀劝2 基因的功能 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 植物材料 矮牵牛 ( etP ~ hbr
r诚 2 L . )栽培
品种由本实验室保存 。 烟草 ( 刀比。 t~ abt ac um L
.
var
.
,
~ um )三生烟无菌苗由本学院农业生物技术
国家重点实验室赵倩惠赠 。
1
.
1
.
2 菌株和质粒 大肠杆菌 ( E . co il ) D5H ;a 农杆
菌 (雌” 6acet ir um t王抓叮瓦俪 ) BL A斗《 科 (含 p L A中耗碎p ,抗性标 记 为 mS r ) 。 p G EM 一 7 fZ ( + ) : 抗 性标 记为
A m p
r 。
p iB n瑞 : 含 Ca M v 35 启动子及终止子的双元
表达载体 ,抗性标记为 Kh l r ,本实验室保存 。
1
.
1
.
3 主要化学试剂 限制性内切酶 、 几 ND A 连
接酶 、 鞠 DN A 聚合酶等酶类主要购自华美生物工
程公 司 、 P or l n e , 公 司 、 几卜AarT c严 m RN A Ios alt ion
ysS
t
em n
,
RN A罗n t sMT oT t al NR A 15面 io n ysS tem , N i e k肠朋 s lat ion 苟 t , 。 DNA S” ht e s i s 儿 t 购 自 P mm e g a 公司 。
氨节青霉素 ( A m p ) , 卡那霉素 (mK ) 和链霉素
(mS )购 自华美生物工程公司 。 梭节青霉素 ( Cb) 由
上海生化制药厂生产 。
1
.
I J 4 寡 核 昔 酸 引 物 引 物 1 为 5 ` GT -
GA G月工 C AG r r r 】℃叨陇GC从G (基因 5 `端 ) ,引物 2 为
5’ CA CAC n 毛名 C C C代羌T C C代CT (基因 3 `端 ) , 由上海
生工生物工程公司合成 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 矮牵牛花同源异型基因 .介, 2 的克隆及序 列
分析 以即将开放的矮牵牛花蕾为材料 , 液氮中研
磨成粉末 , 应用 P功m e罗 公司翻 A g e n st 翎 肠 tal NR A
sI ol at ion vs emt 和 孔卜伽C产 RN A Isol at ion S卿 em n
制备矮牵牛花总 RN A 和纯化 m RN A ,进一步反转录
合成 CDNA 。 以 。 DNA 为模板 ,利用人工合成的 5 `和
3
`端的两个引物 ,通过 CP R 扩增 目的片段 。
cP R 扩增 : 10 拜L 反应体系中 , 以 2 鸿 。 DNA 为
模板 , 引物各 10 p l n o 】, 循环参数为 94 ℃ 1 而 n , 5
℃ 2 而n , 7 2 ℃ 2 而n ,共 so 个循环 ,最后 72 ℃保温
10 而n 。 经 1%琼脂糖电泳分离后 , 回收 70 坤 大小
片段 。
将回收的片段克隆到 pGE M7 fZ ( 十 )的 &加 I 位
点 , 利用单菌落直接鉴定法快速筛选 阳性克隆
p GB凡 。 双链模板 DNA 为模板 , 序列测定在 BA I公
司的 3 73 A DNA 自动测序仪上进行 。
1
.
2
.
2 植物表达载体的构建 将 pBG 咒 用 Xb a l /
5配 工双酶切 , 电泳回收 目的基因片段 , 抽提纯化 。
将 p BI l l l石 同时用 方马“ 工/ sca 工双酶切 ,抽提纯化后
与 目的基 因片段连接并转化大肠杆菌 MJ 101 , 用
l刊℃ 、 x g al 、 mK 抗性筛选含有 C a M V 35 启动子和 目
的基因户 62 的双元表达载体 p B B咫 (图 1 ) 。
1
.
2
.
3 表达载体向农杆菌的转化及阳性克隆的鉴
定 按改进 的 nA s[] 方法 , 直接转化根癌农杆菌
LB扮种时 ,在 mS 125 m g/ L 和 mK 10 1119 / L 的双抗性
Y’E B 培养基上进行筛选 ,酶切检测 。
1
.
2
.
4 烟草的遗传转化及再生 接种含有植物表
达载体 的农杆 菌于 孔B 培养 基 中 (含 sm l o
m岁 )L , 28 ℃振荡培养至 OD溯 = 0 . 8 一 1 . 0 , 3 50
r/ 而 n离心集菌 10 而 n , M s 盐 (州 7 . 0) 悬浮菌体并稀
释至原体积的 50 一 10 倍 。
将烟草的无菌苗的叶片剪下 , 切去叶脉 , 切成
0
.
5 一 1
.
0 。 m 的小块 。 在上述菌液 中浸泡 5 一 10
而 n , 其间不断摇动 , 使薄片与菌液充分接触 , 取
出 , 用无菌滤纸吸干表面菌液 , 放人表面铺有一层
滤纸的含 0 . 2 n娜 L N AA , 3 . 0 m酬 L BA 的 M S培养基
上 , 28 ℃暗处共培养 3 d , 外植体转移到附加 10
m留L mK
,
50
11 1岁 L bC 的同样培养基上 28 ℃继续
培养 , 同时把未经转化的组织块同样处理置于未加
抗生素的相同培养基中作为负对照 。 每隔 14 d 继
代一次 。 待分化的抗性芽长至 3 一 s cm 时切下 , 转
于 M S 培养基 (附加 mK 10 m g/ L )上生根 。
l期 于静娟等 : 矮牵牛花同源异型基因界劝2的克隆及其对烟草花形态的影响
145
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乙印 4 5 1
口日 I左艺刀 dm石妇. H I
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图 1 表达载体 四 B pZ 的构建过程示意图
瑰 . 1 Co n` it u c oit n of e x p er si no v ec to r pB B代
将转基因烟草的组培苗转人花盆中 ,使其在 自然条
件下开花 , 观察花的改变 。
1
.
2
.
5 转化体的鉴定 阮u ht e m 杂交 : SD S 法提取
植物总 DNA , 纯化后 , 用 Xb a 工和 反。 工酶切 , 琼脂
糖电泳后 ,真空转移到尼龙膜上 ,按 而 n l e g a 公司的
N ie k T la l l s l at i o n ` t 说明 , ” Z R dAT p 标记的 .向2 的 3 `
端片段 (即 pBG 凡 sP t l / iH n d m )作为探针进行杂
免 R NA 点杂交 : 利用 阮 m e g a 公司试剂盒提取总
NR A
,将总 NR A 在 95 ℃下变性 10 而 n , 冰上放置 2
m in
,然后每次少许点至尼龙膜上 , 干后置 80 ℃下烘
箱烘烤固定样品 ,杂交的探针与 阮u th e m 杂交相同 。
2 实验结果
2
.
1 d DN A 的合成
以 32 P标记末端的 功 NA / 拭几 d l 片段作为标准
分子量 , 将掺入放射性同位素的反转录第一链和第
二链进行 1 . 4% 碱变性琼脂糖电泳 , 放射 自显影结
果 , 。 DNA 大小在 125 一 2仪幻 如 之间 ,其中大部分集
中在 50 一 1 仪 x〕坤 。 我们需要的目的基因为 720 +bl
左右 ,所以此 c DN A 已达到要求 。
.2 2 目的基因的 P CR 扩增
根据 A n ge n e n t 等s[] 已发表的矮牵牛花同源异型
基因刀劝2 的 cD NA 序列 ,人工合成了两个引物 : ( l)