全 文 ：食品与生物技术学报 2013 年第 32 卷第 12 期
窦文芳，等： 圆酵母 B84512 单倍体的制备及其产赤藓糖醇特性分析研究论文
圆酵母 B84512单倍体的制备及其产赤藓糖醇特性分析
窦文芳 1， 高 慧 1， 张旦旦 1， 张六六 2， 许正宏 1， 陆茂林 *2
（1. 江南大学 药学院，江苏 无锡 214122； 2. 江苏省微生物研究所，江苏 无锡 214063）
Breeding of Torula sp. B84512 Haploid and
Analysis of Erythritol Production Characteristics
DOU Wen-fang1， GAO Hui1， ZHANG Dan-dan1， ZHANG Liu-liu2， XU Zheng-hong1， LU Mao-lin*2
（1. School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. Jiangsu Institute of Microbiology，
Wuxi 214063，China）
Abstract： The Torula sp. B84512 was used for the industrial production of erythritol. To obtain a
haploid genetics hybrid breeding of Torula sp. B84512，spore-producing cultivation of B84512 were
done after cultured on Mcclary medium for 7 days at 30 ℃，and the sporulation rate could reach to
45%. Lysing the ascospore cell with snail enzyme for 150 min，10 haploid strains were screened.
Furthermore，3 of them exhibit the highest ability to produce erythritol，and named as Torula sp.
B84512-7，B84512-8 and B84512-9，respectively. With the PCR verification，Torula sp. B84512-7
and B84512-8 were verified as alpha type but Torula sp. B84512-9 was a type. The erythritol
production of heterozygous Torula sp. B84512-79 reached at 97 g/L which was 56% of that of the
parental strain. Therefore，Torula sp. B84512-7 and Torula sp. B84512-9 could be used for the
further genetic manipulation.
Keywords： Torula sp. B84512，haploid，ascospore，erythritol
摘要： 圆酵母 B84512 为工业用赤藓糖醇生产菌株，为获得其遗传育种单倍体亲本，以 Mcclary
产孢培养基进行该菌株子囊孢子萌发，萌发条件为：30℃，培养 7 d，菌株产孢率为 45%；以蜗牛
酶裂解子囊孢子细胞壁 150 min，共筛选出 10 株单倍体菌株，其中 3 株在发酵培养基中合成赤
藓糖醇的能力相对较高， 分别命名为 Torula sp. B84512-7，Torula sp. B84512-8 及 Torula sp.
B84512-9。 经 PCR验证， 前两者为 α型， 后者为 a型。 将 3 株单倍体两两杂合， 发现杂合子
Torula sp. B84512-79 的发酵性能最佳，赤藓糖醇产量高达 97 g/L，约为出发菌株的 56%。 赤藓
糖醇产量较高的单倍体亲本 Torula sp. B84512-7及 Torula sp. B84512-9可用于基因工程育种。
关键词： 圆酵母 B84512；单倍体；子囊孢子；赤藓糖醇
中图分类号： Q 939.97 文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2013）12—1327—06
收稿日期： 2013-06-03
基金项目： 江苏省科委社会发展基金项目（BE2010629）。
作者简介： 窦文芳（1976—），男，山东商河人，副教授，主要从事微生物分子改造研究。 E-mail：douwenfang@yahoo.com.cn
* 通信作者： 陆茂林（1961—），男，安徽铜陵人，研究员，主要从事工业微生物研究。 E-mail：jsimlml2012@tom.com
1327
Journal of Food Science and Biotechnology Vol.32 No.12 2013
DOU Wen-fang，et al： Breeding of Torula sp. B84512 Haploid and Analysis
of Erythritol Production Characteristics
Mini-ReviewResearch Article
赤藓糖醇具有低热量、高甜度、高耐受性、不致
龋齿等特性 [1-3]，被广泛应用于食品、医药及化工等
行业。 我国对赤藓糖醇的开发研究较晚，生产上多
采用野生菌株，发酵性能较为落后 [4-5]。 Spencer 等 [6]
研究发现，耐高渗酵母在耗氧条件下以葡萄糖或蔗
糖等为碳源时主要通过 HMP 途径生成赤藓糖醇，
即通过磷酸戊糖途径和糖酵解途径产生足够的还
原力，生成大量的赤藓糖-4-磷酸，而后在赤藓糖还
原酶的作用下脱磷酸生成赤藓糖醇并释放到胞外，
在该途径中赤藓糖还原酶催化最后一步反应，被认
为是关键酶。 Hattori 等在研究酵母 Czeylanoides 产
赤藓糖醇的过程中发现，赤藓糖醇较快积累时转醛
酶的活力被显著抑制[7]。 结合代谢途径分析可知，通
过基因工程手段解除产物对 HMP 途径中赤藓糖还
原酶、己糖激酶、转醛酶等关键酶的反馈抑制，维持
其高活力是获得高产赤藓糖醇的关键。
圆酵母 B84512 是工业用赤藓糖醇生产菌株之
一，赤藓糖醇产量在 180 g/L 左右，传统的菌种改良
及培养条件优化等手段已难以进一步提升其产量，
基因工程育种必将成为解决其产业瓶颈的有效手
段之一。 圆酵母营养细胞多为二倍体，诱导酵母产
孢并获得单倍体是其遗传学和育种工作极为关键
的一步[8]。 单倍体细胞既可用于酵母遗传性状分析，
又可作为杂交和分子遗传学研究的亲本[9-10]。单倍体
细胞的结合型由 MAT 基因座上的等位基因 MAT-a
及 MAT-α决定。 在 a细胞中，a1基因出现在 MAT-
a 基因座上， 而在 α 细胞中，α1 和 α2 基因出现在
MAT-α基因座上。 在双倍体细胞中，此两种交配型
控制基因都会表达。 因此，可根据基因结合位点的
不同采用 PCR的方法进行倍型鉴定，鉴定为异倍体
的菌株方可用于杂交或分子操作。
目前，对赤藓糖醇生产菌株圆酵母的单倍体制
备及基因工程育种的研究鲜见报道。 作者以圆酵母
B84512为研究对象，在不同产孢培养基上进行产孢
实验，确定单倍体分离的最佳条件；以赤藓糖醇产
量为主要参量，对所得圆酵母单倍体及其杂合子进
行发酵特性分析，筛选出性能优良的单倍体，为圆
酵母基因工程育种奠定了基础条件。
1.1 材料
1.1.1 培养基 SPM 产孢培养基（g/L）：葡萄糖 1，
氯化钾 0.1，磷酸二氢钾 0.68，酵母膏 2.5，固体培养
基加体积分数 2%琼脂。
Mcclary 产孢培养基 （g/L）：葡萄糖 1，氯化钾
1.8，乙酸钠 8.2，酵母膏 2.5，固体培养基加体积分数
2%琼脂。
YPD 培养基（g/L）：酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄
糖 20。固体培养基添加体积分数 2%的琼脂，用于酵
母菌的培养。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 300，酵母粉 10，尿
素 1， 五水合硫酸铜 0.01， 一水合硫酸锰 0.01，pH
自然。
1.1.2 实验试剂及配置方法 石炭酸蕃红染色液：
蕃红 0.1 g， 体积分数 3%石炭酸 90 mL， 体积分数
0.5%酒精 10 mL。
碱性美兰染色液：配制方法按文献[11]进行。
体积分数 3%酸性酒精：100 mL 体积分数 95%
酒精加 3 mL盐酸。
1.2 方法
1.2.1 诱导孢子形成方法 将圆酵母 （Torula sp.）
B84512 接种至 YPD 斜面培养基中，30℃恒温培养
3 d 活化。 活化两次后将菌体用无菌生理盐水离心
洗涤（3 500 r/min，5 min）3次，将菌泥涂布在固体产
孢培养基中，于 30 ℃恒温培养 3~8 d。 在显微镜下
观察视野内子囊孢子形成情况，并计算产孢率。
产孢率=子囊孢子数
总细胞数
×100%
1.2.2 子囊孢子的分离及单倍体的获得
1） 用无菌生理盐水将孢子从培养基中洗下来
制成孢子悬液，5 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，加
入蜗牛酶使其终质量分数为 2%。
2）33 ℃水浴酶解 30，60，90，120，150 min，将酶
解液转至 58 ℃水浴锅中处理 8 min 以杀死营养体
细胞。
3）将酶解液置于冰上，待完全冷却后倒入 50 mL
的离心管中，并在其中加入已灭菌的玻璃珠、生理
盐水和液体石蜡，置于摇床上振荡 30 min，将菌液
进行逐级稀释并取 10~5 倍稀释液涂布于 YPD固体
培养基，30 ℃恒温培养至长出单菌落。
4）挑取单菌落在产孢培养基中再培养，在显微
镜下观察子囊孢子的形成情况[12]。 凡不形成子囊孢
子的确定为单倍体，将单倍体菌株在 YPD 培养基中
培养后甘油保种，冻存。
材料与方法1
1328
食品与生物技术学报 2013 年第 32 卷第 12 期
窦文芳，等： 圆酵母 B84512 单倍体的制备及其产赤藓糖醇特性分析研究论文
1.2.3 单倍体菌株发酵性能 将冻存菌株在 YPD
培养基中活化后，转接入发酵培养基，测定菌浓、残
糖及产物赤藓糖醇的生成情况。 将赤藓糖醇产量较
高的菌株用于后续实验。
1.2.4 单倍体倍型验证 设计引物 MAT-F、MAT-
α、MAT-a（见表 1）。 MAT-F 位于 MAT 基因座右侧
且指向 MAT 基因座；MAT-α 位于 MATα 及 HMRα
上的 α -特异性 DNA 上 ；MAT-a 位于 MATa 及
HMLa上的 a-特异性 DNA上[13]。将 3条特异性引物
加入 PCR 反应体系中，α 倍型的菌株将产生 404 bp
的条带，a 倍型的单倍体菌株将产生 544 bp 的条
带， 双倍体菌株将在 404 bp 和 544 bp 处均有扩增
条带。
表 1 单倍体倍型验证引物
Table 1 Primer of validation haploid type
注：引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.5 发酵液中赤藓糖醇测定 采用 HPLC法。 色
谱条件： 色谱柱为 Alltech Prevail Carbohydrate ES
（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为乙腈和水（体积
比 75∶25）；体积流量为 1.0 mL/min；RI 2000 型示差
折光检测器；柱温为 30 ℃
1.2.6 单倍体杂交及杂合子发酵性能测定 将验
证为 a 型和 α 型的单倍体菌株混合接种于 YPD 液
体培养基中，30 ℃，200 r/min摇床培养，镜检观察杂
合子的接合情况。 镜检杂交完成后吸取适量菌液，
涂布于固体完全培养基，30 ℃恒温培养至长出单菌
落。 挑取单菌落在产孢培养基上划线，染色后在显
微镜下观察子囊孢子的形成情况，能够形成子囊孢
子的菌株确定为二倍体。 将二倍体菌株接种于 YPD
培养基，30 ℃，200 r/min 培养活化两次后转接入发
酵培养基，测定单倍体杂交后杂合子的菌株生长性
能、赤藓糖醇合成情况及副产物甘油形成情况。
1.2.7 其他检测方法 子囊孢子检测采用染色法
[14]，发酵液中葡萄糖的测定采用 3，5-二硝基水杨酸
法 [15]， 菌体生物量测定采用分光光度法 DCW=
0.485A600。
2.1 高产孢率培养基的筛选
研究两种不同产孢培养基中 Torula sp. B84512
菌株的产孢情况，任取 5 个视野，计算产孢率，结果
如图 1 所示。 Torula sp.B84512 菌株在 SPM 产孢培
养基产孢率较小， 培养 8 d产孢率不到 10%； 麦氏
（Mcclary）培养基中的产孢率较大，且随着培养时间
的延长产孢率逐渐增加， 培养至 7 d 时产孢率达
45%以上，之后子囊孢子生成速率减慢，说明 7 d 为
子囊孢子的最佳培养时间。 因此选择 Mcclary 培养
基为产孢培养基，培养时间为 7 d。
图 1 不同培养基及产孢时间对产孢率的影响
Fig. 1 Effective of sporulation rate by different sporulation
medium and time
2.2 不同裂解时间对子囊孢子裂解率的影响
以蜗牛酶作用于圆酵母细胞壁，从图 2 可以看
出，随着裂解时间的延长，子囊孢子的裂解率不断
增加，150 min 时，裂解率达到 100%。 因此，将蜗牛
酶作用于细胞壁的裂解时间确定为 150 min。
图 2 裂解时间对子囊孢子裂解率的影响
Fig. 2 Effect on cleavage rate of ascospores with different
lysis time
结果与分析2
引物名称 引物序列
MAT-F 5’-AGT CAC ATC AGG ATC GTT TAT GG-3’
MAT-α 5’-GCA CGG AAT ATG GGA CTA CTT CG-3’
MAT-a 5’-ACT CCA CTT CAA GTA AGA GTT TG-3’
1329
Journal of Food Science and Biotechnology Vol.32 No.12 2013
DOU Wen-fang，et al： Breeding of Torula sp. B84512 Haploid and Analysis
of Erythritol Production Characteristics
Mini-ReviewResearch Article
2.3 单倍体的获得
按 1.2.2 中实验方法制备 Torula sp.B84512 单
倍体， 经过一系列分离筛选共筛选出 10 株单倍体
菌株，菌落均呈白色、圆形，且表面光滑，极易挑取。
挑取上述单倍体菌落进行染色并镜检验证，结果如
图 3 所示。 圆酵母 B84512 的孢子多为 3 孢或 4 孢
（图 3（a）），而单倍体菌株则不形成孢子（图 3（b））。
图 3 圆酵母 B84512 孢子和单倍体图
Fig. 3 Spores and the haploids of Torula sp.B84512
2.4 单倍体菌株发酵性能确定
将筛选出的 10 株单倍体菌株接种至发酵培养
基中，于 30℃，200 r/min 培养 160 h，测定残糖量、菌
体量及赤藓糖醇产量，测定结果如图 4 所示。 由圆
酵母 B84512 为出发菌株筛选出的 10 株单倍体菌
株发酵性能相差较大， 说明圆酵母 B84512 的发酵
能力由多个基因控制。 其中单倍体菌株 Torula sp.
B84512 -7、Torula sp.B84512 -8 及 Torula sp.
B84512-9对碳源消耗速率、菌体生长量及合成赤藓
糖醇的能力均优于其他菌株。 发酵 160 h 此 3株单
倍体菌株碳源消耗速率与亲本菌基本相同，残糖量
均小于 10 g/L。 但菌体生物量以及赤藓糖醇产量均
低 于 亲 本 菌 ，Torula sp.B84512 -7 及 Torula sp.
B84512-9 菌体生物量为 60 g/L 左右， 可合成赤藓
糖醇 100 g/L 左右，Torula sp.B84512-8 可发酵得到
82 g/L赤藓糖醇，菌体生物量为 58 g/L。将 3株高产
赤藓糖醇单倍体菌株于种子斜面培养基中传代
10 次，菌体表型及菌株发酵性能稳定，可作为基因
工程育种的亲本。
2.5 单倍体倍型鉴定
单倍体倍型验证主要有 3 种方法：1）用实验室
保藏的已知倍型的单倍体与未知倍型的酵母菌株
进行杂交，如果有哑铃型细胞产生，说明两株菌可
以杂交并为异倍体， 若不能则说明为相同倍型菌
株；2）用 α 因子处理未知倍型的单倍体菌株，若处
理过的细胞呈现梨形，说明此细胞为 a 型，反之为 α
型；3）采用 PCR 方法验证，若 404 bp 处出现条带则
为 α 型，在 544 bp 有条带为 a 型，404 bp 级 544 bp
处均有条带则为二倍体。作者采用 PCR方法进行鉴
定。
图 4 单倍体菌株与出发菌株发酵性能比较
Fig. 4 Comparision of fermentation process between
haploid strains and original
从图 5可以看出，Torula sp.B84512 亲本菌株为
二 倍 体 菌 株 ；Torula sp. B84512 -7、Torula sp.
B84512-8 菌株的倍型相同， 均为 α 型；Torula sp.
B84512-9菌株为 a型。
M：DL marker 2501；Lane 1，2，3，4：Torula sp. B84512-7，8，9
and Torula sp. B84512.
图 5 单倍体倍型鉴定
Fig. 5 Validation of haploid type
2.6 杂合子及杂合子发酵性能测定
单倍体细胞具有结合能力， 在杂合过程中，不
同交配型的单倍体菌株在合适的营养条件下，通过
1330
食品与生物技术学报 2013 年第 32 卷第 12 期
窦文芳，等： 圆酵母 B84512 单倍体的制备及其产赤藓糖醇特性分析研究论文
细胞间的相互识别、相互交配，通过质配、核配，最
后融合成一个完整的二倍体菌株。 在两个细胞的结
合过程中会出现哑铃型细胞，哑铃型细胞的检出可
以作为是否杂交的一种方法。将 Torula sp. B84512-
7、Torula sp. B84512-8、Torula sp. B84512-9 这 3 株
单倍体双双进行杂交， 单倍体混合培养 4 h 开始出
现少量哑铃型细胞，随着时间的延长，相互作用增
加，哑铃型细胞逐渐增加，60 h 后哑铃型细胞变少，
且细胞个体较大，视为杂交完成，得到杂合子 Torula
sp. B84512 -78、Torula sp. B84512 -89、Torula sp.
B84512-79 共 74 株。 将杂合子接种于发酵培养基
中， 在 3 种杂合子中分别筛选出生物量较高的菌
株。 将 3 株菌再次活化后接种于发酵培养基中，测
定赤藓糖醇的产量并与原始菌进行比较（图 6）。
图 6 杂合子发酵产赤藓糖醇比较
Fig. 6 Comparison of erythritol yield by Heterozygous
3株杂合子的发酵性能均低于原始菌株， 发酵
148 h，Torula sp. B84512-79 的赤藓糖醇产量最高，
达到97 g/L，与单倍体亲本发酵性能相当；而 Torula
sp. B84512-89及 Torula sp. B84512-78 发酵产赤藓
糖醇产量较低，为 40 g/L左右，低于单倍体亲本。 可
见 ， 单 倍 体 Torula sp. B84512 -7 和 Torula sp.
B84512-9具有较好的发酵性能，可作为基因工程育
种的单倍体亲本应用于研究。
赤藓糖醇广泛应用于食品、医药、化工等各方
面，可经化学法或生物法合成。 以圆酵母 B84512为
研究对象， 在不同产孢培养基上进行产孢实验，表
明最佳产孢培养基为 Mcclary 培养基， 培养条件为
30℃，7 d，产孢率为 45%左右；筛选出 10 株单倍体
菌株，其中 3 株在发酵培养基中合成赤藓糖醇产量
相对较高， 分别命名为 Torula sp. B84512-7、Torula
sp. B84512-8 及 Torula sp. B84512-9，经 PCR 方法
验证前两者为 α 型，后者为为 a 型；将 3 株单倍体
两两杂合， 发现杂合子 Torula sp. B84512-79 的发
酵性能最佳，赤藓糖醇产量高达 97 g/L。赤藓糖醇产
量较高的单倍体亲本 Torula sp. B84512-7 及 Torula
sp. B 84512-9 可用于基因工程育种。
应用基因工程育种的方法提高赤藓糖醇工业
生产菌株发酵性能的研究鲜见报道，本文中初步探
索了赤藓糖醇生产菌株圆酵母的单倍体制备技术，
为进一步研究该菌株的基因工程操作奠定了基础。
结 语3
参考文献：
[ 1 ] 张新明，李宏，朱永辉. 几种多元糖醇的比较[J]. 山东食品发酵，2007（4）：36-39.
ZHANG Xin-ming，LI Hong，ZHU Yong-hui. Comparison of several multi sugar alcohol [J]. Shangdong Food Ferment，2007
（4）：36-39.（in Chinese）
[ 2 ] Gertjan J M，Agnes W B，Aline A P，et al. Erythritol is a sweet antioxidant[J]. Nutrition，2010，26（4）：449-458.
[ 3 ] Moon H J，Jyea M，Kim I W，et al. Biotechnological production of erythritol and its applications [J]. Applied Microbiology and
Biotechnology，2010，86（4）：1017-1025.
[ 4 ] 刘建军，赵祥颖，田延军，等. 低热值甜味剂赤藓糖醇的研究现状及应用[J]. 中国酿造，2006（12）：1-3，16.
LIU Jian-jun，ZHAO Xiao-yin，TIAN Yan-jun，et a1. Current research situation and application of erthriotl as low-cal sweetener
[J]. China Brewing，2006（12）：1-3，16.（in Chinese）
[ 5 ] Kundimi S，Yeldur P Venkatesh. Analysis of erythritol in foods by polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA[J]. Anal
Bioanal Chem，2008，391：609-615.
[ 6 ] Mmrro I C，Beret W O，Borzeleca J F，et al. Erythritol：An interpretivesummary of biochemical，metabolic，toxicological and
clinical data[J]. Food Chem Toxicology，1998，36：1139-1174.
[ 7 ] Ishizuka H，Wako K，Kasumi T，et al. Purification and some properties ofan erythrose reductase from an Aureobasidium sp.
1331
Journal of Food Science and Biotechnology Vol.32 No.12 2013
DOU Wen-fang，et al： Breeding of Torula sp. B84512 Haploid and Analysis
of Erythritol Production Characteristics
Mini-ReviewResearch Article
mutant[J]. Biosci Biotech Biochem，1992，56：941-945.
[ 8 ] 张建炜，肖东光，张翠英. 优良黄酒酵母单倍体的分离筛选[J]. 酿酒科技，2010（5）：36-41.
ZHANG Jian-wei，XIAO Dong-guang，ZHANG Cui-ying. Screening of haploid of quality yellow rice wine yeast [J]. Liquor-
Making Science & Technology，2010（5）：36-41.（in Chinese）
[ 9 ] 吕艳蓓，王昌禄，陈军. 酿酒酵母菌单倍体分离及其呼吸缺陷型的选育[J]. 酿酒科技，2005（5）：45-47.
LU Yan-bei，WANG Chang-lu，CHEN Jun. Haploid separation of distillers yeast and breeding of its respiration defect type[J].
Liquor-Making Science & Technology，2005（5）：45-47.（in Chinese）
[10] 李华，刘丽丽，李娟. 酿酒酵母产孢培养基的筛选及单倍体的分离[J]. 酿酒科技，2008（6）：22-27.
LI Hua，LIU Li -li，LI Juan. The screening of sporogenous medium and haploid separation of Saccharomyces Cerevisiae [J].
Liquor-Making Science & Technology，2008（6）：22-27.（in Chinese）
[11] Kloimwieder A，Winston F. A screen for germination mutants in saccharomyces cerevisiae [J]. Scerevisiae Germination
Mutants，2011，1（1）：143-149.
[12] Reiling J H，Clish C B，Carette J E，et al. A haploid genetic screen identifies the major facilitator domain containing 2A
（MFSD2A） transporter as a key mediator in the response to tunicamycin[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences
of the United States of America，2011，108（29）：11756-11765.
[13] 朱旭芬，吴雪昌，曾云中. 酿酒酵母产孢条件及核倍性分析[J]. 科技通报，2002，18（5）：157-163.
ZHU Xu-fen，WU Xue-chang，ZENG Yun-zhong. The analysis of spoulation condition and nuclear multiploid of therm otolerant
yeast[J]. Bulletin of Science and Technology，2002，18（5）：157-163.（in Chinese）
[14] Layton J E. Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish [J]. Methods in Molecular Biology，2009，54（6）：
31-44.
[15] 赵凯，许鹏举，谷广烨. 3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J]. 食品科学，2008，29（8）：534-536.
ZHAO Kai，XU Peng-ju，GU Guang-ye. Study on determination of reducing sugar content using 3，5-dinitrosalicylic acid method
[J]. Food Science，2008，29（8）：534-536.（in Chinese）
科 技 信 息
欧盟食品安全局就锰的膳食参考值发表科学意见
食品伙伴网讯 据欧盟网站消息，2013 年 11 月 4 日欧盟食品安全局就锰的膳食参考值发表科学意见，建议成年
人（包含孕妇及哺乳期妇女）适宜摄入量（AI）为 3 mg/天，7-11 个月婴儿 AI 范围为 0.02-0.5 mg/天，1-3 岁儿童 AI 为
0.5 mg/天， 青少年 AI 为 3 mg/天。
［信息来源］ 食品伙伴网. 欧盟食品安全局就锰的膳食参考值发表科学意见 [EB/OL]. (2013-11-7). http://news.
foodmate.net/2013/11/247869.html
台湾地区制定食用藻类中脱镁叶绿酸盐的检验方法
2013 年 11 月 13 日，台湾地区“卫生福利部”发布部授食字第 1021950910 号公告，订定“食用藻类中脱镁叶绿酸
盐的检验方法”，并自即日生效。 方法详情参见：http://www.xmtbt-sps.gov.cn/download.asp?id=6294
［信息来源］厦门 WTO 工作站. 台湾地区制定食用藻类中脱镁叶绿酸盐的检验方法[EB/OL]. (2013-11-18). http://
www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=43815.
1332