全 文 ：越橘 SSR反应体系的优化
崔建民1 , 杨　忠2 , 邹荣仟1 , 李亚东1 , 温景辉3 , 赵　爽4
1.吉林农业大学园艺学院 , 长春 130118;2.吉林省产品质量监督检验院 ,长春 130022;3.吉林
省农业科学院果树研究所 , 长春 130033;4.长春工业大学电气与电子工程学院 , 长春 130012
摘　要:以“美登” 、“北春” 、“蓝丰”为试材 , 用TIANGEN植物基因组试剂盒提取基因组 DNA ,对 SSR反应体系
中的 Mg2+浓度 、dNTPs 浓度 、TaqDNA 聚合酶用量 、引物浓度 、DNA 模板浓度以及引物 CA344F的退火温度进行
了优化筛选 ,探讨了越橘 SSR技术中 PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响。确定了适合越橘的 SSR
反应体系:在 20 μL 反应体系中 , Mg2+ 2.0 mmol/ L , dNTPs 0.20 mmol/L , TaqDNA 聚合酶 0.5 U , 引物浓度
0.8 μmol/ L, DNA 模板1.5 ng/μL;引物CA344F的最佳退火温度为 58℃。利用此反应体系对部分越橘品种进行
PCR扩增并用 6 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ,扩增结果清晰且 DNA谱带多态性丰富 ,表明该体系稳定
可靠 ,适合越橘的亲缘关系分析。
关键词:越橘;SSR;反应体系;优化
中图分类号:S663.9;Q78　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)05-0506-06
Study on Optimization of SSR Analysis System for Blueberry
CUI Jian-min1 , YANG Zhong2 , ZOU Rong-qian1 , LI Ya-dong1 , WEN Jing-hui3 , ZHAO Shuang4
1.College of Horticulture , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Jilin Province
Product Quality Supervision Inspection , Changchun 130022 , China ;3.Institute of Pomology , Jilin A-
cademy of Agricultural Sciences , Changchun 130033 , China ;4.College of Electrical and Electronic En-
gineering , Changchun University of Technology , Changchun 130012 , China
Abstract:Genomic DNA was extracted from blueberry cultivars of “Blomidon” , “Northcountry” and
“Bluecrop” by TIANGEN plant genomic DNA kit.The effect of oncentration of Mg2+ , dNTPs , primers ,
template DNA , amount of TaqDNA polymerase and the annealing temperature of primer CA344F were
optimized.Then the factors affecting the SSR results of blueberry were studied.The results showed that
the best reaction system of blueberry SSR was:2.0 mmol/L Mg2+ , 0.20 mmol/L dNTPs , 0.5 U
TaqDNA polymerase , 0.8μmol/L primer , 1.5 ng/μL template DNA in 20μL reaction system;The op-
timal annealing temperature of primer CA344F was 58℃.Using the above PCR system , SSR fragments
and polymorphism of blueberry cultivars were best detected by 6%polyacrylamide gel , indicating that
this system was suitable for analyzing blueberry phylogenetic relationship.
Key words:blueberry;SSR;reaction system;optimization
　　越橘为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccini-
um spp.)植物 ,全世界约有 400个种 ,我国约有 91
个种 、28个变种 ,全部为野生品种[ 1] 。越橘栽培
最早起源于美国[ 2] 。我国从 1983年开始越橘引
种栽培工作 ,先后从美国 、加拿大等国家引入栽培
品种 100余个[ 3] 。由于引种途径不同 ,许多品种

通讯作者
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-028 , 2006-G25), 吉林省科技发展重点项目(2007-5013)
作者简介:崔建民 ,男 ,硕士研究生 ,研究方向:果树种质资源。
收稿日期:2008-12-20　　修回日期:2009-02-28
吉林农业大学学报　2009 ,31(5):506 ～ 511 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
DOI :10.13327/j .j jlau.2009.05.008
名称混乱 ,难以进行种质资源的鉴定 ,严重影响了
我国越橘种质资源的研究和利用。因此对越橘种
质资源进行鉴定和研究各品种间的亲缘关系显得
尤为重要 。
SSR(Simple sequence repeat)即简单序列重复 ,
通常又称为微卫星 DNA ,是一类由几个碱基组成
的基序串联重复而成的 DNA 序列[ 4] 。SSR反应
被认为是研究群体遗传变异最好的标记方法之
一[ 5] ,已广泛应用于人类遗传[ 6]和许多动物研究
中[ 7] ,在苹果[ 8-9] 、葡萄[ 10] 、桃[ 11]等果树种质资源
遗传多样性领域也有较多应用 ,但有关越橘 SSR
的研究国内尚未见报道 。SSR反应涉及诸多因
素 ,每个因素对整个反应体系都有较大影响 。为
此 ,本研究对越橘的 SSR反应体系进行了优化 ,
以期为越橘种质资源鉴定和遗传多样性的研究提
供技术支持。
1　材料与方法
1.1　材料
试验于 2007—2008 年在吉林省农业科学院
东北创新中心生物技术重点开放实验室进行 。试
验试材采自吉林农业大学园艺学院小浆果园 ,取
春季刚萌发的嫩叶 ,用液氮固定后置于-70℃冰
柜中保存 。反应体系的优化以美登(Blomidon)、北
春(Northcountry)、蓝丰(Bluecrop)为模板 ,SSR多态
性分析选用斯卫克(Brunswick)、芝妮(Chignecto)、
美登(Blomidon)、北蓝(Northblue)、圣云(St.
Cloud)、北春(Northcountry)、北极星(Polaris)、泽西
(Jersey)、蓝丰(Bluecrop)、北卫(Patriot)、康维尔
(Coville)、艾朗(Aron)、蓝线(Blueray)、蓝乐(Blue-
jay)、斯巴坦(Spartan)为试材 。
10倍 Buffer、Mg2+ 、dNTPs 、TaqDNA 聚合酶均
购自北京天根生化科技有限公司。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取与检测　用 TIANGEN植物基
因组试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取基
因组 DNA ,用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳
法检测 DNA的纯度和质量浓度 。稀释至所需质
量浓度后 ,置于-20℃冰箱中保存 。
1.2.2　PCR扩增　所用的引物由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。引物序列参照文献
[ 12] ,22对引物均获得较高的多态性 ,随机选择
引物 CA344F 用于本试验。参照苹果[ 8-9] 、核
桃[ 13] 、板栗[ 14] 等果树已建立的 SSR反应体系中
各主要成分的最适浓度 ,本试验在 20 μL SSR-
PCR 反应体系中 , 以 Mg2+ 1.5 mmol/L 、dNTPs
0.2 mmol/L 、TaqDNA 聚合酶 1.0 U 、引物浓度
0.6 μmol/L 、DNA 模板浓度 2.0 ng/μL 为固定参
数 ,当一种成分进行浓度或用量梯度试验时 ,其他
成分浓度不变 ,比较不同处理对扩增结果的影响。
各成分的梯度设置见表 1。
表 1　PCR反应体系中处理因素和水平
Table 1.Factors and levels of PCR reaction system
水平
Level
因素
Factors
c(Mg2+)/(mmol·L-1) c(dNTPs)/(mmol·L-1) TaqDNA 聚合酶/U
Amount of Taq DNA c(Primers)/(μmol·L-1)
ρ(Template DNA)/
(ng·μL -1)
1 0.5 0.05 0.25 0.2 0.5
2 1.0 0.10 0.50 0.4 1.5
3 1.5 0.20 1.00 0.6 2.0
4 2.0 0.30 1.50 0.8 2.5
5 3.0 0.40 2.00 1.0 4.0
　　扩增程序:94℃预变性 4 min;94℃变性 40 s ,
55℃退火 40 s ,72℃延伸 40 s , 35 个循环;72℃后
延伸 8 min。将退火温度梯度设为 6个梯度:46 ,
50 ,54 , 58 , 62 , 66℃,寻找最适退火温度 。PCR扩
增在 Biometra-UNO Ⅱ型 PCR仪上进行 。
1.2.3　PCR产物的检测　采用聚丙烯酰胺凝胶
电泳。扩增反应结束后 ,将 PCR产物与上样液
(甲酰胺 49 mL , 0.5 mol/L EDTA 1 mL , 溴酚蓝
0.125 g ,二甲苯菁 0.125 g)以体积比 3∶1 混合 ,
95℃变性 5 min后立即置于冰浴中待用 。每次取
4 μL 上样 ,利用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
检测 PCR扩增产物 ,60 W恒功率电泳约 1 h ,待溴
酚蓝指示剂至胶底部时终止电泳 。6%非变性聚
丙烯酰胺凝胶的配制:将尿素 24 g 、丙烯酰胺
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吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
2.85 g 、甲叉双丙烯酰胺 0.15 g 放入 100 mL烧杯
中 ,加入 40 mL 去离子水溶解 ,再加入 10倍 TBE
5 mL ,最后用去离子水定容至 50 mL ,过滤 。灌胶
前加入 TEMED 40 μL ,10%过磷酸铵 400 μL。电
泳分析使用北京君意生产的 JY-ECP3000型电泳
仪及JY-CX2A型垂直板电泳槽 。
电泳结束后取下凝胶进行银染 。银染程序为
将胶放入固定液(冰醋酸 100 mL , 去离子水
900 mL)中固定 30 min;用去离子水洗 3次 ,每次
3 min;转入染色液(AgNO3 1 g ,37%甲醛 1.5 mL ,
用去离子水定容至 1 000 mL)中染色 30 min;用去
离子水洗 1 次 , 转入显影液(无水 Na2CO3 30 g 、
37%甲醛 1.5 mL 、10 mg/mL Na2S2O3 200μL ,用去
离子水定容至 1 000 mL)中显色 。从洗到放入显
影液的时间不能超过 10 s。至开始出现第一批条
带后将胶转入另外新配制的 1 000 mL 显影液中
继续显色 ,待全部条带显现清晰后 ,再转入固定液
中固定5 min ,最后用去离子水洗2次 ,每次5 min。
整个银染反应在江苏晶玻生产的 HY-3型多功
能摇床上进行 。
2　结果与分析
2.1　退火温度对 SSR反应的影响
图1显示了引物 CA344F 在退火温度分别为
46 ,50 ,54 , 58 , 62 , 66℃时的 PCR扩增结果。结果
表明 ,在退火温度 46℃和 66℃条件下 ,扩增产物
模糊不清;在退火温度50℃和 62℃条件下 ,以“美
登”为模板时扩增产物较少;在退火温度 54℃和
58℃时 ,3种模板的扩增产物均比较多 ,且带型比
较清晰。一般情况下 ,在 Tm 值允许的范围内较
高的退火温度可减少引物和模板之间的非特异性
结合 ,提高 PCR反应的特异性 。因此本研究选择
58℃作为引物 CA344F 的最佳退火温度。
M.pBR322DNA/HaeⅢ Marker;A , B, C.分别代表美登 、北春 、蓝丰(下同)A , B, C.Represent for Blomidon , Northcount ry and Bluecrop ,
the same as below;1～ 6.46 , 50 , 54 , 58 , 62 , 66℃
图 1　不同退火温度下 PCR扩增结果
Fig.1.Results of PCR under different annealing temperature
2.2　Mg2+浓度对 SSR反应的影响
由图 2 可以看出 , Mg2+浓度为 0.5 mmol/L
时 ,扩增谱带少且不清晰;浓度为 1.0 , 1.5 , 2.0 ,
3.0 mmol/L 时 均 有 扩 增 谱 带 , 以 浓 度 为
2.0 mmol/L 时扩增的谱带最清晰。因此选择
2.0 mmol/L 作为 Mg2+的最适浓度。Mg2 浓度过
低 ,会显著降低酶的活性 ,过高又会使酶催化特异
性扩增增强。这是因为 Mg2+是 TaqDNA聚合酶
的激活剂 ,其浓度不仅影响酶的活性和合成的可
靠性 ,而且还影响引物与模板的结合效率和产物
的特异性[ 15] 。
2.3　dNTPs浓度对 SSR反应的影响
由图 3可见 ,dNTPs浓度为 0.05 mmol/L 时基
本上没有扩增产物 , 浓度为 0.10 , 0.20 , 0.30 ,
0.40 mmol/L 时均有谱带出现。0.10 mmol/L 时谱
带不清 晰 , 0.40 mmol/L 时 谱带减 少 , 0.20 ,
0.30 mmol/L 时谱带比较清晰 。考虑成本 ,选择
0.20 mmol/L作为 dNTPs的最适浓度。dNTPs作为
PCR反应的重要底物 ,其含量不足将直接影响
PCR的扩增产量 ,过量的 dNTPs则会与 TaqDNA
聚合酶竞争结合Mg2+ ,抑制 PCR反应 。
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Journal of Jilin Agricultural University 2009 , October
1.0.5 mmol/L;2.1.0 mmol/L;3.1.5 mmol/L;4.2.0mmol/ L;5.3.0mmol/ L
图 2　不同 Mg2+浓度条件下 PCR扩增结果
Fig.2.Results of PCR under different Mg2+ concentration
1.0.05 mmol/ L;2.0.10 mmol/ L;3.0.20 mmol/ L;4.0.30 mmol/ L;5.0.40mmol/ L
图 3　不同 dNTPs浓度条件下 PCR扩增结果
Fig.3.Results of PCR under different dNTPs concentration
2.4　TaqDNA聚合酶用量对 SSR反应的影响
图4结果表明 , 5个不同 TaqDNA聚合酶用
量条件下均有扩增产物 , 但用量为 0.25 , 1.50 ,
2.00U时谱带模糊不清 ,用量为0.50 ,1.00 U时谱
带较亮且清晰。考虑成本 , 选择 0.50 U 作为
TaqDNA 聚合酶的最适用量。 TaqDNA聚合酶用
量过低会导致扩增产物减少或消失 ,过高则非特
异性产物增加 。
1.0.25 U;2.0.50 U;3.1.00 U;4.1.50 U;5.2.00 U
图 4　不同 Taq DNA用量条件下 PCR扩增的结果
Fig.4.Results of PCR under different Taq DNA amount
2.5　引物浓度对 SSR反应的影响
由图 5 可以看出 , 引物浓度为 0.2 , 0.4 ,
1.0 μmol/L 时扩增产物较少且谱带不清晰 ,引物
浓度为 0.6 ,0.8 μmol/L 时扩增产物均较多 ,以引
物浓度为 0.8 μmol/L 时谱带最为清晰 。因此选
择0.8 μmol/L 作为引物的最适浓度。引物浓度
过低会导致扩增产物量降低 ,过高会引起碱基错
配和非特异性扩增 ,生成引物二聚体。
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吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
1.0.2μmol/ L;2.0.4μmol/ L;3.0.6μmol/ L;4.0.8μmol/ L;5.1.0μmol/ L
图 5　不同引物浓度条件下 PCR扩增的结果
Fig.5.Results of PCR under different primer concentration
2.6　DNA模板质量浓度对 SSR反应的影响
由图 6可见 ,DNA模板质量浓度为 0.5 ng/μL
时扩增谱带模糊不清 ,在 2.5 ,4.0 ng/μL 时有非特
异性谱带出现 , 1.5 ,2.0 ng/μL 时扩增出的谱带清
晰稳定。为了节省 DNA模板 ,选择1.5 ng/μL 作
为最适的 DNA 模板质量浓度 。DNA模板质量浓
度过低 ,无法得到扩增产物或使结果不稳定 ,过高
则会导致非特异性产物增加 ,DNA中的杂质也会
影响到PCR的产率 。
1.0.5 ng/μL;2.1.5 ng/μL;3.2.0 ng/μL;4.2.5 ng/μL;5.4.0 ng/μL
图 6　不同 DNA模板质量浓度下 PCR扩增的结果
Fig.6.Results of PCR under different DNA concentration
2.7　部分越橘品种 SSR多态性分析
本研究采用上述优化条件对越橘的 15个品
种进行了 SSR扩增。图7显示 ,扩增谱带清晰 ,多
态性较高 ,扩增谱带 1 ～ 5条 ,位于 400 ～ 500 bp。
其中“斯卫克” 、“芝妮” 、“美登” 、“北春”谱带相似 ,
“圣云” 、“艾朗”谱带接近 , “北极星” 、“泽西” 、“蓝
丰”谱带一致 ,说明它们具有一定的同源性。
1.斯卫克 Brunswick;2.芝妮Chignecto;3.美登 Blomidon;4.北蓝 Northblue;5.圣云 St.Cloud;6.北春 Northcountry;7.北极星 Po-
laris;8.泽西 Jersey;9.蓝丰 Bluecrop;10.北卫Patriot;11.康维尔 Coville;12.艾朗Aron;13.蓝线 Blueray;14.蓝乐 Bluejay;15.斯
巴坦 Spartan
图 7　不同越橘品种 SSR扩增结果
Fig.7.Results of PCR of different blueberry cultivars
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3　讨　论
SSR技术以其丰富的多态性 、共显性遗传 、重
复性好等优点日益受到重视 ,已成为植物遗传和
育种研究中不可缺少的分子标记 ,但因其必须针
对每个 SSR设计引物而使应用受到限制。SSR技
术的关键在于开发基因组中某个微卫星两侧的引
物序列 ,可从基因组文库中获得含微卫星的阳性
克隆或通过检索GeneBank 、EMBL 、DDBJ DNA序列
数据库获得微卫星序列[ 16] 。由于目前只有少数
物种建立了 DNA文库或 cDNA 文库 ,对于大多数
物种而言 ,获得 SSR引物很困难 ,因而大大限制
了SSR技术更为广泛的应用 。Rowland等[ 17]最早
从 EST 库中筛选出 17对在越橘上具有多态性的
SSR引物 。随后 Boches等[ 12] 从 EST 库中筛选出
30对 SSR引物分析了 69个高丛越橘品种间的亲
缘关系 。目前国内尚未见有关越橘 SSR研究的
报道 。
虽然 SSR技术在苹果[ 8-9] 、葡萄[ 10] 、桃[ 11] 、核
桃[ 13]等果树上都有应用 ,但是 SSR反应涉及诸多
因素 ,每个因素对整个反应都有较大影响 ,所以筛
选引物及建立稳定的反应体系是 SSR技术应用
的基础。本研究优化了越橘的 SSR反应体系 ,与
Boches等[ 12]研究的结果基本一致 ,只有引物浓度
用量有较大差异 ,这可能与不同公司合成的引物
自身浓度不同有关。PCR扩增时 ,过量的 dNTPs
会与 TaqDNA聚合酶竞争结合Mg2+ ,抑制PCR反
应;其他成分的浓度过高会引起引物与模板的错
配 ,产生非特异性扩增 ,浓度过低会导致扩增产物
量降低 。因此 ,筛选出各成分的最佳浓度是 PCR
成功的关键。
退火温度是决定引物与模板结合的另一重要
因素。试验中发现 ,退火温度的高低直接影响引
物与模板的特异性结合 ,这可能与引物本身的碱
基组成 、长度和浓度有关 。一般情况下 ,引物的最
佳退火温度比 Tm 值约低 5℃。
本试验选用的越橘品种“美登” 、“北春”和“蓝
丰”分别属于矮丛 、半高丛和高丛越橘品种群 ,遗
传背景差距较大。用所优化的反应体系对 15个
越橘品种进行 SSR扩增 , 结果扩增谱带清晰 ,多
态性较高 ,说明优化的反应体系具有很强的代表
性。
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