全 文 ：秋水仙素诱导离体培养越橘多倍体研究
收稿日期：2009-09-15
基金项目：公益性行业科研专项（nyhyzx07-028，2006-G25）；吉林省科技厅重点项目（2007-5013）；吉林省财政厅农业育种项目
作者简介：李晓艳（1979-），女，博士，研究方向为果树生物技术。E-mail: lixiaoyan684@126. com
*通讯作者：张志东，教授，硕士生导师，研究方向为小浆果育种。E-mail: currant1985@163. com
摘 要：试验研究了秋水仙素不同处理方法、浓度和时间对美登、达柔和埃利奥特 3个越橘品种试管苗的诱变
效果，并采用根尖压片方法和流式细胞仪对诱变材料倍性进行检测。结果表明，采用药剂培养基法处理效果不如茎
段浸渍法。经秋水仙素处理的所有品种都发生不同程度的变异，其中达柔用 0.1%秋水仙素浸渍 24 h的处理效果最
好，变异率达到 22.6%，诱变株系为嵌合体。流式细胞仪测定 DNA含量方法与根尖压片方法检测结果一致。
关键词：越橘；秋水仙素；多倍体；离体培养
中图分类号：S663.9；Q942.4 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2010）01－0038－05
Study on polyploid induction of blueberry in vitro with colchicine treat-
ment/LI Xiaoyan, ZHANG Zhidong, LI Yadong, WU Lin, LIU Haiguang (College of Horticulture, J ilin
AgriculturalUnivers ity, Changchun 130118, China )
Abstract: Take blueberry cultivars Blomidon, Darrow, Elliott as experimental materia ls, treating them
with different methods, time and concentra tions of colchicine. The results showed that induction effect
through medium with colchicine treatment was inferior to that through immers ing axillary buds. With
colchicine 0.1% immers ing axillary Darrow buds for 24 h, the varia tion rate was 22.6%. The varia tion plants
were chimeras. The result of counting chromosome of root tip was identical with the analys is of DNA content
in plant cells by flow cytometry.
Key words: blueberry; colchicine; polyploid; in vitro culture
多倍体育种是获得新品种的主要途径之一，
利用秋水仙素处理植株是获得多倍体的有效方法。
多倍体诱导试验最初多在田间进行，但由于变异
细胞往往因层间取代而消失。采用试管苗处理可
以使获得的诱变嵌合体在短时间内快速大量继代
和分离。越橘属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属
（Vaccinium），是一类富含营养的小浆果。关于秋
水仙素诱导越橘多倍体研究目前在国内未有相关
报道，国外的研究对诱变材料的鉴定仅限于根尖
染色体计数和形态方面的观察 [1-2]。本试验通过秋
水仙素处理对越橘试管苗进行诱导，并对变异株
系进行了筛选。越橘多倍体材料的获得将为培育
越橘多倍体新品种奠定基础，为今后越橘品种选
育提供亲本材料，对指导果树倍性育种具有重要的
借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 材料
采用 3 个越橘品种的组培苗：美登（Blomi-
don）、达柔（Darrow）、埃利奥特（Elliott）。以上 3
个品种为已知二倍体（2n=2x=24）[3-5]，均来自吉林
农业大学小浆果研究所。
培养基为改良的 WPM基本培养基，添加玉米
素（Zeatin，ZT） 0.7 mg·L-1，蔗糖 3%，琼脂 0.7%，
pH 5.4。培养基在 121 ℃，1.1 kg·cm-2压力下高温
灭菌 20 min。培养温度为 23±2 ℃，光照强度为
李晓艳，张志东*，李亚东，吴 林，刘海广
（吉林农业大学园艺学院，长春 130118）
第 41卷 第 1期 东 北 农 业 大 学 学 报 41(1): 38~42
2010年 1月 Journal of Northeast Agricultural University Jan. 2010
2 000 lx，光周期为 16 h光照/8 h黑暗。
1.2 方法
1.2.1 药剂培养基法
将生长健壮的无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽
萌发，4～6 d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段，转接
到含有秋水仙素的 WPM+ZT 2.0 mg·L-1 培养基中。
秋水仙素浓度设 5 个水平：0%（对照）、0.001%、
0.002%、0.003%、0.005%。培养 30 d左右，待处
理的腋芽萌动抽茎长至 1～2 cm后继代到不含秋水
仙素的新鲜培养基中。
1.2.2 浸渍法
将生长健壮的无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽
萌发，4～6 d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段，浸泡
在经高压灭菌的 0（对照）、0.05%、0.1%、0.2%秋水
仙素水溶液中，然后放在摇床上以 100 r·min-1震荡，
处理时间分别为 6、12和 24 h。在超净工作台上将
材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗 3次，
用无菌滤纸吸干表面水分后，将单芽茎段转接到不
含秋水仙素的培养基中。待处理的腋芽萌动抽茎长
至 1～2 cm后继代到新鲜的培养基中。
1.3 变异材料检测
1.3.1 镜检
采用根尖常规压片进行染色体的观察，染色
液选用铁矾-苏木精[6]。待越橘试管苗在生根培养
基（1/2WPM+IBA 0.2 mg·L-1 +活性炭 1 g·L-1）中的根
长到 0.5～1.0 cm左右进行压片镜检。选择染色体分
散好的细胞在 OLYMPUS显微镜下观察并拍照。每
种材料观察 30个以上的中期分裂细胞。
1.3.2 流式细胞光度法鉴定
参照 Dolezel等利用流式细胞仪检测染色体的
方法[7]。每个品种重复 3次，以达柔为对照。采用
美国 B-D 公司的 B-D FACSCalibur 流式细胞仪测
定、分析细胞倍性。
存活率（%）=（成活个数/接种个数）×100%
变异率（%）=（变异个数/成活个数）×100%
2 结果与分析
2.1 药剂培养基法对越橘试管苗茎段诱导多倍体
的影响
在本研究中 3个供试越橘品种表现出相同的变
化趋势，即在不添加秋水仙素的培养基中存活率都
在 90%以上，而只加入 0.001%的秋水仙素存活率
就大副下降，埃利奥特只加浓度为 0.001%秋水仙
素存活率由对照 95.7%下降到 30.0%，但没有检测
出染色体加倍的细胞。秋水仙素浓度为 0.003%和
0.005%的处理中，因浓度高出现明显的药害作用。
从存活率和变异率两方面考虑，本研究认为秋水仙
素浓度为 0.002%处理效果较好，结果见表 1。
表 1 秋水仙素药剂培养基法对越橘 3个品种诱导多倍体的影响
Table 1 Effect of medium with colchicine on polypoid induction of three blueberry cultivars
埃利奥特 Elliott
美登 Blomidon 0.002
0.002
90
150
0
19
达柔 Darrow 0.002 140 15
品种
Cultivars
浓度（%）
Colchicine concentration
接种数（个）
No. of buds
存活数（个）
No. of survival
0
12.7
10.7
存活率（%）
Rate of survival
变异率（%）
Percentage of variation
0
4.3
7.3
变异数（个）
No. of variation
0
6
11
由表 1 可知，在对不同越橘品种处理效果方
面，埃利奥特好于达柔，达柔好于美登。通过对达
柔和埃利奥特 2个品种第一次继代处理材料进行根
尖染色体鉴定，变异率不到 8.0%。由于变异细胞
较少，在第二次继代培养后没有发现变异植株。
2.2 浸渍法对越橘试管苗茎段诱导多倍体的影响
在秋水仙素浓度 0.05%的浸渍处理中，除美登
在 24 h浸渍处理中得到变异植株外，其他品种在
6、12和 24 h 均没有得到变异植株。在 0.1%的处
理中，3个供试品种诱变效果较好，尤其是在 24 h
浸渍处理中得到了较高的变异率（见表 2）。在 0.2%
的处理中，随着浸渍时间的延长，存活率和变异率
都明显下降。从存活率和变异率两方面考虑，本
研究认为秋水仙素浓度为 0.1%，浸渍 24 h效果最
好。
从表 2中可知，不同的越橘品种表现出相同的
变化趋势。即在时间一定的情况下，存活率呈直线
下降，而变异率则呈单峰曲线。综合 3个品种的处
理结果来看，达柔的诱导效果最好，在秋水仙素浓
度为 0.1%，浸渍处理 24 h的试验组合中，存活率
为 28.9%，变异率 22.6%。对得到的变异植株进行
继代培养，并对其后代进行鉴定。
李晓艳等：秋水仙素诱导离体培养越橘多倍体研究第 1期 ·39·
表 2 不同秋水仙素浓度浸渍 24 h对不同品种单芽茎段诱导多倍体的影响
Table 2 Effect of different colchicine concentration and soaking 24 h on polypoid induction of
mutation from blueberry buds
存活数（个）
No. of survival
7
存活率（%）
Rate of survival
5.0
变异率（%）
Percentage of
variation
5.0
变异数（个）
No. of variation
7
28 16.5 20 11.8埃利奥特 Elliott
45 42.9 0 0
23 16.0 23 16.0
55 28.9 43 22.6达柔 Darrow
61 58.1 0 0
品种
Cultivars
美登 Blomidon
29 27.6 18 17.1
26 17.3 26 17.3
10 8.8 10 8.8
0.20
浓度（%）
Colchicine
concentration
0.10
0.05
0.20
0.10
0.05
0.05
0.10
0.20
芽数（个）
No. of buds
105
150
114
105
190
144
105
170
140
2.3 细胞学鉴定比较
2.3.1 根尖细胞染色体计数
对所获得的 3个品种诱变株系进行根尖染色体
鉴定（见表 3）。第一次继代的 8个株系全为嵌合体，
无一株是同质四倍体。从整体上看，几乎所有异常
株系染色体加倍细胞比例均较低，变动幅度 13.2%～
36.4%之间。其中最高是达柔，诱变株系染色体加
倍细胞为 36.4%，二倍体细胞占多数（见图 1）。
表 3 秋水仙素浸渍单芽茎段诱变株系倍性鉴定
Table 3 Chromosome variation of mutational lines induced by soaking buds in colchicine liquid
80.9 19.1
63.6 36.4达柔 Darrow
82.9 17.1
76.5 23.5
埃利奥特 Elliott
86.8 13.2
品种
Cultivars
美登 Blomidon
85.2 14.8
82.8 17.2
76.5 23.5
0.2%，12 h
处理
Treatment
0.2%，24 h
0.1%，24 h
0.2%，24 h
0.1%，24 h
0.05%，24 h
0.1%，24 h
0.2%，24 h
鉴定细胞数（个）
No. of cells observed
27
35
17
30
19
41
22
21
二倍体细胞和四倍体细胞百分数 Chromosome variation
2n=2x=24 2n=4x=48
图 1 达柔组培苗根尖染色体计数
Fig. 1 Chromosomes of root-tip cell in Darrow
A B
对照二倍体 2n=2x=24（×800）
Diploid as control 2n=2x=24 (×800)
诱变株系 2n=4x=48（×800）
Induced plant 2n=4x=48 (×800)
·40· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
3 讨论与结论
试验中选用了两种秋水仙素处理材料的方法，
但药剂培养基法处理效果不如浸渍法。浸渍法诱导
在本试验中获得了变异株系，其中达柔品种最高变
异率达 22.6%。本研究认为诱导处理中保证植株良
好的生长状况、创造细胞分裂的最佳生长条件、选
择适宜的秋水仙素浓度和作用时间，是诱导多倍体
成功的关键。王娜等用 50 mg·L-1 秋水仙素处理
40 d诱导酸枣和冬枣，得到了同质的四倍体[8]。刘
庆忠等将皇家嘎拉苹果离体新梢的叶片放入含 0～
200 mg·L-1秋水仙素的液体分化培养基上培养 5 d，
获得四倍体植株[9]。
在诱导植物多倍体时，嵌合体是一种常见的现
象。韩礼星等在诱导猕猴桃多倍体研究中发现诱导
后代全部为嵌合体[10]。马爱红等在进行四倍体葡萄
诱导的试验中得到了二倍体和四倍体的嵌合体[11]。
本研究通过根尖进行染色体鉴定，发现变异株系多
为二倍体和四倍体的嵌合体。利用流式细胞仪对
DNA含量进行检测也证明诱变材料后代均为嵌合
体。如何进行越橘诱变株系嵌合体的分离和纯化将
是下一步研究的重点。
利用流式细胞仪检测植物细胞倍性是近几年在
我国兴起的一项新技术。本试验对越橘组培苗变异
株鉴定采用根尖染色体计数和流式细胞仪测定
DNA含量相结合的方法，鉴定结果一致，说明流
式细胞仪检测方法可靠。李 等将流式细胞光度术
用于草莓倍性的鉴定，结果也证明随着倍性水平的
增加细胞核 DNA含量随之成倍增加 [12]。张俊娥等
采用倍性分析仪成功地鉴定了柑橘愈伤组织的遗传
变异[13]。但由于越橘试管苗单株小，单株重达不到
流式细胞仪测试用量（约 0.5～1.0 g），故测试结果
只能反应群体试管苗的倍性，不能反映越橘试管苗
单株的倍性。所以采用根尖压片法和流式细胞仪分
析相结合的方法鉴定越橘试管苗倍性是必要的。
[ 参 考 文 献 ]
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[ 2 ] Percy J L, Lyrene P M. In vitro induction of tetraploidy in Vacci-
nium darrowi, V.elliottii and V.darrowi ×V.elliotii with colchicine
2.3.2 流式细胞光度法鉴定
结果见图 2。
利用流式细胞仪对植物细胞倍性进行检测，横
座标是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”
（Channel No.）来表示，其值与细胞内 DNA含量成
正比。纵座标表示被测细胞的绝对数目。对变异株
系进行 DNA含量测定，达柔对照二倍体植株只有
一个主峰，位于横坐标大约 50的位置。变异株有
两个主峰，第一个峰的位置与对照相同，第二个峰
的位置是对照峰值的二倍。由于荧光强度与细胞内
DNA含量成正比，说明经秋水仙素浸渍诱导的变
异株系体内含有两种 DNA含量的细胞，即二倍体
和四倍体细胞的嵌合体。在嵌合体中，二倍体细胞
占优势，这与根尖染色体压片所得结果一致。
0 50 100 150 200
道数 Channels (FL2-A)
1000
800
500
400
200
0
0 50 100 150 200 250
1200
900
500
300
0
数
量
（
个
）
Nu
m
be
r
图 2 越橘达柔变异植株 DNA含量分析
Fig. 2 DNA content distribution of mutational Darrow plant
A-对照达柔试管苗 2n=2x=24
A-Darrow as control 2n=2x=24
B-变异株嵌合体
B-Variant plant
数
量
（
个
）
Nu
m
be
r
道数 Channels (FL2-B)
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贝
斌
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贝
斌汪攻
山一王
·42· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
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