全 文 ：笃斯越橘 CBF 基因的克隆及序列分析
臧建磊1 , 李亚东1 , 刘庆忠2 , 3 , 宗晓娟2 , 3 , 王甲威2 , 3
1.吉林农业大学园艺学院 ,长春 130118;2.山东省果树研究所 ,泰安 271000;3.山东省果树
生物技术育种重点实验室 ,泰安 271000
摘　要:根据近缘植物中同源 CBF 基因的序列保守区设计引物 ,采用 PCR方法 , 克隆出野生种笃斯越橘的
CBF 基因片段 ,将其克隆到 pMD18-T Vector上。序列分析结果表明 , 笃斯越橘的 CBF 基因序列全长 678 bp , 编
码225个氨基酸。同源性分析表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物 CBF 类基因具有较
高的同源性 ,与桃 DREB 基因和蓝莓(Blue crop)DREB1 基因氨基酸同源性高达 85%以上。
关键词:笃斯越橘;CBF 转录因子;克隆
中图分类号:S663.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2011)05-0532-04
DOI:CNKI:22-1100/ S.20110518.0915.001
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20110518.0915.001.html
引文格式:臧建磊 , 李亚东 ,刘庆忠 , 等.笃斯越橘 CBF 基因的克隆及序列分析[ J] .吉林农业大学学报 , 2011 ,
33(5):532-535.
Cloning and Sequence Analysis of CBF gene in Blueberry (Vaccinium
uliginosuml L.)
ZANG Jian-lei1 , LI Ya-dong1 , LIU Qing-zhong2, 3 , ZONG Xiao-Juan2,3 , WANG Jia-wei2, 3
1.College of Horticulture , J ilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Shandong In-
stitute of Pomology , Tai′an 271000 , China;3.ShandongKey Laboratory of Fruit Biotechnology Breed-
ing , Tai′an 271000 , China
Abstract:Primers were designed according to the sequence of CBF gene in other plants.Fragment of
CBF gene was isolated from Blueberry (Vaccinium uliginosuml L.)by PCR , and transferred into the
pMD18-T Vector.The result derived from the sequence analysis showed that the sequences obtained the
full-length cDNA was 678 bp long , and encoded a putative protein of 225 amino acids.Homology analy-
sis showed that the nucleotide and the deduced amino acids sequences were homologous to the CBF genes
in other species , especially strongly homologous to the DREB gene of Prunus persica and DREB1 gene of
Blueberry (Blue crop)and the homology was up to above 85%.
Key words:Vaccinium uliginosuml L.;CBF transcription factor;cloning
　　在我国北方地区 ,低温冷害是果树生产中的
主要障碍因素 ,在果树的整个生长过程中均能造
成不利影响。因此果树的抗寒性机理研究具有重
要的意义 ,培育抗寒性果树品种是果树育种的重
要目标之一 。CBF 转录激活因子是近几年从拟
南芥[ 1-4] 、油菜[ 5-6] 、水稻[ 7] 、大麦[ 8] 以及小麦 、黑
麦和番茄[ 6]等多种植物中分离和鉴定出来的一类
受低温特异诱导的反式作用因子[ 9] ,能与 CRT/
DRE顺式作用元件特异结合 ,可激活启动子中含
有这一调控元件的多个基因协同表达 ,提高植物

通讯作者
基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(201103037)
作者简介:臧建磊 ,男 ,硕士研究生 ,研究方向:果树生物技术。
收稿日期:2011-01-19　　网络出版时间:2011-05-18 09:15
吉林农业大学学报　2011 ,33(5):532 ～ 535 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
抵抗低温胁迫的能力 ,同时也能提高植株多方面
的抗逆性[ 3] 。因此从果树中分离 CBF 基因 ,并研
究其抗寒性机制 ,对改良果树抗性和果树育种具
有重要意义。
相对于栽培种越橘 ,笃斯越橘是一种耐寒性
极强的野生种越橘 ,分布在中国的长白山地区 ,可
抵御-50 ℃的严寒[ 10] ,在抗寒性研究中较有优
势。前人对笃斯越橘抗寒性的研究多集中于其生
理特性或次生代谢物的分离提取 ,关于该植物材
料抗寒基因的分离鉴定以及在分子育种学上的应
用价值尚未见报道。因此 ,克隆笃斯越橘 CBF 转
录因子基因 ,进一步分析其序列 、结构与功能 ,对
研究笃斯越橘的抗寒分子机制具有重要意义 ,为
下一步利用该基因改良越橘抗逆性储备了宝贵的
基因资源 ,为通过基因工程手段改良越橘的抗寒
性奠定基础。
1　材料与方法
根据 GenBank 中已发表的越橘品种“蓝丰”
CBF 转录因子基因序列 ,通过与其他植物中 CBF
基因序列的比对 , 确定该基因的保守区 , 应用
Primer Premier 5.0软件设计特异引物 ,上游引物:
5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′;下游引物:
5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。引物由上海
BioSune公司合成。
试验以杜鹃花科越橘属野生笃斯越橘(Vac-
cinium uliginosum L.)组培苗为材料 ,采用改良的
SDS 法提取基因组 DNA ,通过 PCR反应扩增目的
片段。本试验于 2009—2010 年在山东果树研究
所山东省果树生物技术育种重点实验室完成 。
PCR产物按照 Omega 的柱式 DNA 胶回收试
剂盒的使用说明进行回收 。将回收的目的片段与
pMD18-T Vector 载体(TaKaRa 公司)连接 ,连接产
物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,LB/Amp平板
上培养过夜挑取菌落进行菌落 PCR筛选阳性克
隆 ,提取质粒对重组子进行 PCR 检测和酶切鉴
定 ,基因测序由上海生工生物技术有限公司完成。
应用 DNAMAN等生物软件进行序列和结构分析。
2　结果与分析
2.1　PCR产物扩增和克隆
提取的笃斯越橘基因组 DNA经测定OD260/280
平均值为 1.75 ,采用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检
测DNA纯度及完整性 。用所设计的特异性引物
对笃斯越橘基因组DNA进行 PCR扩增 ,扩增出一
条与预计长度相符 、约 700 bp 的 DNA 条带(图
1)。
M.DL2000 Marker;a1.重组质粒 Xba Ⅰ 和 Pst Ⅰ 双酶切 Re-
striction analysis of recombinant plasmids with Xba Ⅰ and Pst Ⅰ ;
b1.笃斯基因组 The genome of Vaccinium uliginosuml L.;b2.
PCR扩增片段PCR amplification fragment
图 1　笃斯越橘 CBF 基因的 PCR扩增与酶切鉴定
Fig.1.PCR amplification and Restriction analysis of
CBF gene from Vaccinium uliginosuml L.
将目的片段进行回收 、纯化 ,然后与 pMD18-T
Vector载体连接 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 ,在含有 50 mg/L Amp的 LB固体培养基上进行
过夜培养 , 挑取单菌落进行 PCR 检测 , 然后取
PCR检测为阳性的克隆菌落进行培养 ,提取质粒
DNA ,利用 pMD18-T Vector插入位点两端的 Pst Ⅰ
和 Xba Ⅰ酶切位点 ,进行酶切鉴定。从图 1中可
以看出 ,目的片段已经克隆到载体上。
2.2　序列测定和结构分析
将所克隆的重组质粒进行序列测定 , 得到
CBF 基因序列 。进一步序列分析表明 ,该序列包
含起始密码子ATG和终止密码子 TAG ,具有完整
的开放阅读框 ,基因全长 678 bp ,碱基序列如图 2
所示 ,图中划线部分为 CBF 蛋白家族特征序列 ,
黑点部分为AP2DNA结合域。
运用 DNAMAN软件推测其氨基酸序列 ,发现
该基因能编码 225个氨基酸 ,具有典型的转录因
子家族蛋白结构。
其编码的肽链具有 3个结构域(图 3),即 5′
端信号区域 NLS(第 1 ～ 67位),AP2/EREBP DNA
结合结构域 AP2Domain(第 68 ～ 126位 ,序列见图
2黑点部分)和 3′酸性激活区域 Acidic Region(第
127 ～ 225位)。其中在 5′端区域的第 21 ～ 65位序
列中富含多个碱性氨基酸(精氨酸 R和赖氨酸
533臧建磊等:笃斯越橘 CBF 基因的克隆及序列分析
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
K),推测其起到核定位信号的作用 。在 5′端区域
和AP2/EREBP DNA结合结构域中含有 2段作为
CBF 家族蛋白特征的短多肽序列 ,即 PKK/RPA-
GRxKFxETRHP和 DSAWR(见图 2下划线部分)。
图 2　笃斯越橘 CBF 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.2.Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of Vaccinium uliginosuml L.CBF gene
图 3　笃斯越橘 CBF 基因蛋白结构
Fig.3.Deduced protein structure of Vaccinium uligi-
nosuml L.CBF
　　将克隆基因序列在GenBank中进行同源性分
析 ,结果该基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
CBFs 转 录 因 子 基 因 (AF076155 , AF062924 ,
AF062925)、黄瓜(Cucumis sativus L.)CBF1 基因
(DQ776899)、烟草(Nicotiana tabacum L.)DREB1A
基因(DQ403814)、小盐芥(Thellungiella salsuginea
L.)DREB1基因(AY514018)、油菜(Brassica napus
L.)DREB 2-2 基因(AY444874)、芥菜(Brassica
juncea L.)DREB 1B 基因(EU136731)、草莓(Fra-
garia ananassa L.)CBF 1 基因(EU117214)、苹果
(Malus domestica L.)CBF 1 基因(DQ074478)、桃
(Prunus persica L.)DREB 基因(EF635424)和蓝莓
(Vaccinium cyanococcus L.)DREB1基因(FJ222601)
等都具有较高的同源性(图 4), 尤其与蓝莓
DREB 1基因和桃 DREB 基因同源性较高 , 达到
85%以上 。
图 4　一些植物 CBF s转录因子基因系统树
Fig.4.Phylogenetic tree of some CBF s transcription
factor genes
3　讨　论
本试验以杜鹃花科植物笃斯越橘为材料 ,首
次从笃斯中克隆出 CBF 转录因子基因 ,这将为利
用 CBF 转录因子进行杜鹃花科越橘属植物抗寒
性的基因工程改良提供前提条件。通过序列分析
发现笃斯越橘的 CBF 基因与其他植物中的CBF
534　　　吉林农业大学学报　2011年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2011 , October
基因在序列上具有很高的同源性 ,在其推测的氨
基酸序列中包含有 AP2/EREBP DNA 结合结构域
和 CBF 家族蛋白的特征序列 ,但其是否具有结合
CRT/DRE顺式作用元件从而激活相关功能基因
的表达 ,进而提高植株的抗寒性 ,尚有待于进一步
研究 。目前 ,正在进行该基因的功能鉴定试验 。
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