全 文 ：华北农学报·2011，26(3) :100 -105
收稿日期:2011 － 02 － 10
基金项目:“十五”国家科技攻关项目(2004BA52511)
作者简介:李保印(1965 －) ，男，河南兰考人，教授，博士，主要从事园林植物种质资源创新利用研究。
通讯作者:张启翔(1966 －) ，男，湖北黄冈人，教授，博士生导师，主要从事园林植物种质资源研究。
中原牡丹品种资源的核心种质构建研究
李保印1，周秀梅1，张启翔2
(1． 河南科技学院，河南 新乡 453003;2． 北京林业大学 国家花卉工程技术中心，北京 100083)
摘要:根据已经获得的中原牡丹品种资源的初级核心种质 120 个品种的表型性状信息和 ISSR、AFLP分子标记遗
传信息，采用单一表型性状、分子、表型结合分子信息聚类压缩取样及随机取样的方法，进行了构建中原牡丹品种核
心种质的研究。结果表明:采用表型信息结合两种分子标记信息聚类压缩的方法构建核心种质的方法最好。经检
验，各种检验指数及品种间平均遗传距离均高于初级核心种质，也均高于保留种质，表型保留比例达 99%，多态性位
点及百分率、平均观测等位基因数的保留率达到了 94． 65%以上。核心种质很好地代表了中原牡丹品种初级核心种
质的遗传多样性，可为杂交育种和种质保存提供参考。
关键词:牡丹;核心种质;表型性状;分子标记
中图分类号:S602． 4 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2011)03 － 0100 － 06
Establishment of Core Collection for Tree Peony Cultivars from Central China
LI Bao-yin1，ZHOU Xiu-mei1，ZHANG Qi-xiang2
(1． Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China;
2． Beijing Forestry University，The Engineering and Technological Research Center of China，Beijing 100083，China)
Abstract:Based on the data of morphological and agronomic traits and the molecular marker information of IS-
SR and AFLP of the primary core collection including 120 tree peony cultivars from Central China，the study of how
to establish a core collection of tree peonies from Central China was carried out． The result showed that the best
method for establishing the core collection was from the UPGMA cluster drawing samples which combined the phe-
notypic traits with two kinds of molecular marker information． Test results showed that some testing parameters and
the average genetic distance between cultivars of the core collection were bigger than the primary collection and the
reservation collection． The ratio of retained phenotype traits exceeded 99% ． The retention rates of polymorphic lo-
cus and the average allele number observed were more than 94． 95% ． Therefore，the core collection could furthest
represent the genetic diversity of the primary collection and made a basement to hybrid breeding and germplasm res-
ervation of Chinese tree peony cultivars．
Key words:Chinese tree peony;Core collection;Phenotypic traits;Molecular mark
牡丹(Paeonia suffruicosa)是中国特产传统名
花，为多年生木本植物，作为资源保存，占地面积大、
管理费用高。目前，种质资源保护和利用中无效收
集较多，一些优质基因不能够得到很好的开发利用，
而构建出核心种质，虽然其包含的资源数量最少，但
是却能够覆盖该种植物整个遗传资源的多样性，而
且具有代表性、实用性［1］。观赏植物与农作物中，
对郁金香、梅花和蜡梅等进行了核心种质构建研
究［2 － 7］。随着中原牡丹品种育种目标的多元化，进
行中原牡丹品种核心种质的构建，对资源考察、收
集、种质创新和有效保护利用以及品种改良、新品种
选育等，都具有十分重要的意义和广阔的应用前
景［8，9］。核心种质构建所用的数据包括多种类型，
其中形态农艺性状数据作为研究核心样品的指标，
有简便和研究费用低的优点，但易受环境和基因显
隐性的影响。DNA 分子标记数据能够直接反映出
DNA序列水平上的变化，具有多态性高、不受环境
3 期 李保印等:中原牡丹品种资源的核心种质构建研究 101
影响和基因表达与否的限制等特点，已经成为检测
植物种质遗传多样性、构建高质量核心种质的有效
特征数据［10］。但是利用分子标记信息计算遗传相
似系数的方法只适用于显性标记，对于共显性则没
有考虑。研究表明，利用单一数据进行遗传多样性
研究有其局限性，而综合利用多种数据时，由于数据
之间的互补性使研究结果更具有可靠性，能最大限
度的代表物种的遗传多样性［11］。笔者对 400 个原
始种质进行了初级核心种质构建的取样策略研究，
并获得了 120 份初级核心样本［12］。本研究旨在利
用形态农艺性状数据和 ISSR、AFLP 等位基因数据
对已构建的初级核心种质进行聚类压缩，构建核心
种质并对其代表性进行检验评价，从而为中原牡丹
品种资源的有效利用奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料
本研究以采用中原牡丹品种的 31 个表型性状
按 30%的总体取样比例抽取样本建立的 120 份初
级核心种质(Primary core collection，简称 Pc)为材
料，采用其表型性状和 ISSR、AFLP 两种分子标记信
息数据。
1． 2 方法
31 个表型性状的数据按参考文献［8，12］获得，
评价参数的计算公式见参考文献［10］。
ISSR分子数据根据 8 个引物的扩增结果获
得。ISSR-PCR扩增的最适反应体系为 20 μL，其
中 dNTP浓度 0． 3 mmol /L、引物浓度 0． 4 μmol /L，
Taq DNA 聚合酶 1 U，10 × Buffer (含 MgCl2 15
mmol /L)2 μL，模板 DNA 20 ng。扩增反应程序
为:94℃预变性 5 min → 94℃变性 40 s → 各 ISSR
引物的退火温度 40 s → 72℃延伸 90 s →45 个循
环，完成最后一个循环后于 72℃延伸 7 min，然后
PCR产物在 4℃保存。用 2%的琼脂糖凝胶电泳，
在 1 × TAE 缓冲液中进行，于 3 V /cm 条件下电泳
2 ～ 3 h，溴化乙锭染色，用 BIO-RAD 公司的凝胶成
像系统成像。
AFLP分子数据根据 8 对 EcoR I /Mse I 引物对
120份初级核心种质的 DNA 选择性扩增反应获得。
AFLP-PCR选择性扩增体系及反应条件见表 1。扩增
产物在电压 1 200 V下电泳 2． 5 h，用 ABI-PRISM 377
sequencer收集条带，部分引物选择性扩增结果的电
泳检测见图 1。扩增阳性有带出现记为 1，扩增阴性
无带出现记为 0。用 POPGENE1． 32 软件，得出多态
性位点数(NPL)、多态性位点百分率(PPL)、平均观
测等位基因数(NA)、平均有效等位基因数(NE)、Nei
s基因多样性指数(H)、Shannon 信息指数(I)、Neis
基因遗传距离(GD)等指数;最后采用 Neis遗传距离
进行 UPGMA(非加权算术平均)聚类。
取样方法:以初级核心种质 120 份样品的表型
性状数据、ISSR 和 AFLP 标记信息，采用 50%取样
比例，按表型聚类、分子标记单独聚类、两种分子标
记结合聚类、表型 +分子标记 7 种聚类压缩和随机
共 8 种抽样法，得到各自包含 60 个品种的 8 个候选
核心种质，分别用 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7 和 C8 表
示。通过综合比较 8 个候选核心种质对初级核心种
质的代表性，选择其中一个最能代表初级核心种质
的候选核心种质作为代表中原牡丹 400 个品种的核
心种质。
核心种质的检验参数:根据核心种质的概念，
综合前人的研究选择了表型多样性指数(I)、表型
方差(VPV)、变异系数(CV)、表型频率方差
(VPF)、表型保留比例(RPR)5 个表型检验参数
(计算公式参见李自超研究结果［13，14］)和多态位点
数、等位基因数、基因多样性、Shannon 指数等参
数［15］，检测候选核心种质的遗传多样性及对总体
种质的代表性。
表 1 AFLP-PCR选择性扩增体系及反应条件
Tab． 1 Reaction component and volume and condition of AFLP-PCR selective amplification
组成 Component 体积 /μL Volume 选择性扩增条件 Condition of selective amplification
Preamplification DNA template 2
EcoR I primer(5 ng /μL) 1
Mse I primer(30 ng /μL) 1
dNTP 0． 5
10 × PCR Buffer 2
Taq DNA polymease 0． 5
DDH2O 13
第 1 轮扩增 94℃ 30 s ，65℃ 30 s，72℃ 80 s;以后每轮温
度递减 0． 7℃，扩增 10 个循环;再按 94℃ 30 s，55℃ 30 s，
72℃ 80 s，扩增 23 个循环;最后延伸，72℃ 5 min。
102 华 北 农 学 报 26 卷
图 1 引物 E4 /M2(左)和 E7 /M1(右)的 AFLP-PCR选择性扩增结果
Fig． 1 Results of gel electrophoresis of AFLP-PCR selective amplification with primer E4 /M2(left)and E7 /M1(right)
2 结果与分析
2． 1 核心种质的表型性状与等位基因的保留比例
8 个候选核心种质的表型性状保留比例，以及
通过 AFLP、ISSR 分子标记获得等位基因位点的保
留比例见图 2(左)。可以看出，8 个候选核心种质
样本表型性状保留比例均在 97%以上，远远超过了
70%的最低要求［16］。从等位基因保留比例上看，以
单用 AFLP分子标记信息聚类压缩成的候选核心种
质 C3 的等位基因保留比例最高，为 94． 00%;以 IS-
SR分子标记信息聚类压缩所得核心样本 C2 的等位
基因保留比例最低，为 91． 00%;以 ISSR + AFLP 两
种分子标记信息聚类压缩成的候选核心种质 C6 的
等位基因保留比例介于二者之间。采用表型 +分子
标记信息聚类压缩得到的 C4、C5、C7 候选核心种质
中，以表型 + AFLP + ISSR两种分子标记相结合的聚
类压缩法获得的 C7 表型保留比例最高，达
99． 20%。
图 2 8 种候选核心种质表型与多态位点百分率保留比例(左)和表型多样性指数(右)
Fig． 2 RPR and percentage of alleles reserved (left)and phenotypic genetic diversity (right)of the 8 candidates for the core
2． 2 核心种质的遗传多样性
2． 2． 1 核心种质的表型遗传多样性 从图 2(右)
可以看出，以表型、表型 +分子标记信息聚类压缩所
得的候选核心种质 C1、C4、C5、C7 的表型性状遗传多
样性指数较高，基本上高于单用 1 种或 2 种分子标
记信息压缩的结果，如 C1 为 1． 055 5，C4 为 1． 072 7，
C6 为 1． 010 1。同时，不同压缩方法平均看来，聚类
法抽样所得的核心种质的表型遗传多样性指数高于
随机抽样法。
2． 2． 2 核心种质分子水平上的遗传多样性 比较
不同压缩方法得到的候选核心种质的 Neis 等位基
因多样性指数(图 3) ，发现采用表型 + ISSR + AFLP
两种分子标记信息聚类压缩得到 C7 的等位基因多
样性指数最高，其次是 ISSR + AFLP 两种分子标记
信息聚类压缩法，以 ISSR分子标记信息聚类压缩的
C2 和表型数据 + ISSR 聚类压缩法的 C4 较低，随机
法的 C8 最低。
利用 Popgen软件得出多态性位点百分率、观测
等位基因数、有效等位基因数、Neis 遗传多样性指
数和 Shannon s 信息指数等，结合遗传距离进行排
3 期 李保印等:中原牡丹品种资源的核心种质构建研究 103
秩序求秩和得到表 2。从表 2 可以看出，C7 的 Neis
基因多样性指数、有效等位基因数、Shannon 信息指
数均最高，综合各基因多样性指数及品种间距离按
秩和排序为:C7、C3、C6、C5、C4、C1、C8、C2。说明 C7
在分子水平上的遗传多样性最高。
2． 2． 3 核心种质在表型 +分子水平上的遗传多样
性 综合表型水平与分子水平上两种评价结果得到
表 3。从表 3 可以明显地看出，8 个候选核心种质的
排序是:C7 位列第 1 位，C4 位列第 2 位，C3 和 C5 并
列第 3 位，C1 列在第 4 位，最末是 C8。因此，就把采
用表型数据 + AFLP + ISSR 分子标记信息以 50%的
取样比例聚类压缩抽得的 60 份样品所构建而成的
核心种质 C7 作为中原牡丹品种的核心种质。初级
核心种质中余下的 60 份样品作为保留种质(Re-
serve collection，缩写为 Rc)。
图 3 8 个候选核心种质的 Neis基因多样性指数
Fig． 3 Nei genetic diversity indexes of 8 candidates
for the core
表 2 8 个候选核心种质的的等位基因多样性指数秩次
Tab． 2 Allele diversity parameters of the 8 candidates for the core
候选核心
种质
Candidate core
多态性带百
分率
RPPL
平均观测等
位基因数秩
RNa
平均有效等
位基因数秩
RNe
Neis基因多
样性指数秩
RH
Shannon
指数秩
RI
遗传距
离秩
RGD
秩和
Sum
位次
Order
C1 6 4 8 5 3 6 32 6
C2 7 6 4 7 6 4 34 8
C3 1 1 2 3 2 3 12 2
C4 3 3 6 6 5 5 28 5
C5 5 4 5 4 4 1 23 4
C6 3 3 3 2 2 3 16 3
C7 2 2 1 1 1 2 9 1
C8 4 5 7 8 7 3 34 7
表 3 表型和分子两种水平上对 8 个候选核心种质的评价
Tab． 3 Evaluation on the 8 candidates for the core based on phenotypic and molecular
候选核心种质
Candidate core
表形水平上评价的秩
Evaluation on phenotypic
分子水平上评价的秩
Evaluation on molecular
秩和
Sum
位次
Order
C7 4 1 5 1
C4 1 5 6 2
C3 5 2 7 3
C5 3 4 7 3
C1 2 6 8 4
C6 7 3 10 5
C2 3 8 11 6
C8 6 7 13 7
2． 3 核心种质对初级核心种质的代表性评价
2． 3． 1 核心种质对初级核心种质表型多样性上
的代表性 核心种质 C7 的遗传多样性指数、表型
方差、变异系数及遗传距离等指数值依次为
1． 039 1，1． 376 3，0． 800 1，99． 2%，4． 556，而初级
核心种质的则分别为 1． 027 6，1． 296 7，77． 93%和
4． 361。上述几个指数是越大越好，且 C7 的表型
保留比例为 99． 20%。因此，C7 对初级核心种质
的代表性较好，即最大程度地的保留了初级核心
种质的遗传多样性。
2． 3． 2 核心种质对初级核心种质基因多态性位点
上的代表性 计算核心种质与初级核心种质 2 个群
体的平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、
Neis 遗传多样性指数和 Shannons 信息指数并分别
作 t 测验，结果见表 4。
从表 4 可以看出，核心种质多态性位点百分率
的保留率达到了 95． 75%，平均观测等位基因数、平
均有效等位基因数、Neis遗传多样性指数、Shannon
s信息指数和遗传距离的保留率分别为 97． 49%，
99． 56%，101． 19%，100． 81%，103． 26%。说明核心
104 华 北 农 学 报 26 卷
种质很好地保留了初级核心种质的遗传多样性。t
测验结果表明，仅平均观测等位基因数与初级核心
种质有极显著的差异，其他参数均与初级核心种质
差异不显著。
表 4 核心种质与初级核心种质的分子水平遗传多样性比较
Tab． 4 Comparison of genetic diversity parameters between the core and the primary collection
项目
Item
多态位
点数
NPL
多态性带
百分率
PPL
平均观测等位
基因数
NA
平均有效等位
基因数
NE
Nes基因多样
性指数
H
Shannons
指数
I
遗传距离
GD
核心种质 Core 1 309 89． 37 1． 933 7 ± 0． 249 1 1． 355 1 ± 0． 343 7 0． 221 3 ± 0． 177 1 0． 347 5 ±0． 239 2 0． 317
初级核心 Primary 1 383 93． 34 1． 983 4 ± 0． 127 8 1． 361 1 ± 0． 340 2 0． 218 7 ± 0． 176 0 0． 344 7 ±0． 237 3 0． 307
保留率 /%
Retention rate
94． 65 95． 75 97． 49 99． 56 101． 19 100． 81 103． 26
t 值 t-value 4． 260＊＊ 0． 183 5 0． 161 8 0． 129 3
注:＊＊ ． 0． 01 显著水平;t0． 01 = 2． 617
Note:＊＊ ． Indicates significant at 0． 01 probability level;t0． 01 = 2． 617
2． 4 核心种质与保留种质的比较
2． 4． 1 核心种质与保留种质表型多样性比较 从
表 5 可以看出，保留种质 Rc 的表型多样性指数、表
型方差、变异系数、及遗传距离等指数值依次为
0． 979 9，1． 208 2，0． 766 1，4． 207，均低于核心种质;
Rc 的表型保留比例仅为 90． 4%，明显低于核心种质
的 99． 2%，且表型频率方差大于核心种质，为 0． 046 3。
说明，保留种质的表型遗传多样性水平没有核心种
质的高。
表 5 核心种质与保留种质表型遗传多样性比较
Tab． 5 Comparison of phenotypic diversity parameters between the core and reservation collection
种质
Collection
表型多样性指数
NE
表型频率方差
VPF
表型方差
VPV
变异系数
CV
遗传距离
GD
核心种质 Core 1． 039 1 0． 045 9 1． 376 3 0． 800 1 4． 498
保留种质 Reservation 0． 979 9 0． 046 3 1． 208 2 0． 766 1 4． 207
2． 4． 2 核心种质与保留种质分子遗传多样性比较
表 6 表明，核心种质的平均观测等位基因数在概
率 0． 01 水平上与保留种质有极显著差异，Shannons
信息指数在概率 0． 05 水平上与保留种质有显著差
异，有效等位基因数和 Nei s 遗传多样性指数虽然
与保留种质无显著差异，但都大于保留种质，核心种
质的基因多态性位点数多于保留种质，多态性位点
百分率较高，品种间的平均遗传距离也大于保留种
质。说明，核心种质比保留种质具有丰富的遗传多
样性，比保留种质对初级核心种质的代表性高。
表 6 核心种质与保留种质分子水平上的遗传多样性比较
Tab． 6 Comparison of molecular genetic diversity parameters between the core and reservation collection
项目
Item
多态位
点数
NPL
多态性带
百分率
PPL
平均观测等位
基因数
NA
平均有效等位
基因数
NE
Neis基因多样
性指数
H
Shannons
指数
I
遗传距离
GD
核心种质 Core 1 309 88． 37 1． 933 7 ± 0． 249 1 1． 355 1 ± 0． 343 7 0． 221 3 ± 0． 177 1 0． 357 5 ±0． 239 2 0． 32
保留种质 Reservation 1 161 84． 78 1． 817 7 ± 0． 386 6 1． 322 8 ± 0． 347 0 0． 196 6 ± 0． 183 6 0． 307 4 ±0． 254 7 0． 30
t 值 t-value 3． 287＊＊ 1． 021 3 1． 143 7 1． 977 1*
注:* ． 0． 05 显著水平，＊＊ ． 0． 01 显著水平，t0． 05 = 1． 960;t0． 01 = 2． 617。
Note:* ，＊＊ ． Indicates significant at 0． 05 and 0． 01 probability levels;t0． 05 = 1． 960;t0． 01 = 2． 617．
3 讨论
3． 1 核心种质的代表性、异质性和多样性
构建核心种质时要选择有代表性、异质性和多
样性、类型齐全的样本作为核心种质。本研究采用
表型性状数据 + AFLP + ISSR 两种分子标记信息相
结合的方法所构建的核心种质中，不仅包含了中原
牡丹品种的两种花类 10 种花型，而且包含了某些特
殊性状的种质，如 3 倍体的首案红，1 花 2 色的二
乔，1 回 3 出复叶的种生黑，株型矮枝条极短的罗汉
红，产根量高、落叶晚、抗叶斑病的玉楼点翠等。与
初级核心种质比较，核心种质的 Nei s 遗传多样性
指数和 Shannon＇s信息指数都显著高于保留种质，说
明构建的 60 份核心种质群体具有很高的遗传多样
性。因此，在对中原牡丹品种资源进行保存与研究
利用时，应该优先考虑使用核心种质。
3． 2 核心种质构建的性状数据
形态性状是研究核心群体最常用的指标［17］。
3 期 李保印等:中原牡丹品种资源的核心种质构建研究 105
形态性状包括数量形状与质量性状两部分。数量性
状在田间会受栽培、管理条件上的影响，从而使性状
的表现受环境条件的影响较大。因此，利用形态学
数量性状所得的表现型来计算样品间的遗传距离，
其结果不一定能准确代表基因型间的遗传变异，在
此基础上进行的遗传分类也不能正确地反映种质资
源间固有的遗传结构［18］。相对而言，形态学质量性
状由于受环境的影响较小，具有稳定、准确、直观的
优点，它是植物种质资源基因型在表现型上直观反
映。因此，形态学质量性状应该是构建植物核心种
质的重要参考。但是，质量性状控制基因在植物遗
传结构的地位还很不明确，而且其赋值的评价也为
其应用带来了一定困难，目前未见单一使用质量性
状构建核心种质的报道。可见，形态学数量性状和
质量性状各具优、缺点，为弥补单一性状的不足，本
研究中综合利用了形态学数量与质量性状。
3． 3 核心种质构建的分子数据
分子标记现在已经广泛应用于植物遗传资源的
研究。RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP等标记能直接
反映 DNA序列水平的变化，逐渐成为评价植物资源
多样性、构建核心种质的好方法［19，20］。但是由于费
用高、技术难度大以及不同分子标记可能产生不同
的分类结果等诸多问题，因而限制了其应用规模及
可靠性。因此，针对小样本，采用基因型结合多个分
子标记构建核心种质将会提高结果的可靠性。本研
究成功运用表型 + ISSR + AFLP 标记构建了中原
牡丹品种的核心种质 60 个核心样品。
4 结论
分别使用表型数据、AFLP、ISSR、AFLP + ISSR、表
型数据 + AFLP、表型数据 + ISSR、表型数据 + AFLP +
ISSR和随机抽样共 8 种压缩方式对初级核心种质进
行抽样压缩，构建了 8 个各自含有 60 份样本的中原
牡丹品种的核心种质候选群体。根据表型和分子水
平检验上综合检测结果，选择了以表型数据 + AFLP
+ ISSR聚类压缩法构建的核心种质作为中原牡丹品
种的核心种质。它既很好地代表了初级核心种质，又
很好地代表了总体种质。这个核心种质，覆盖了中原
牡丹品种资源的所有花类与花型，为中原牡丹的杂交
育种和种质保存提供了理论依据。
本研究采用的原始基因库尚不完善，特别是缺
乏品种抗性和耐性等方面的数据，需在今后的研究
中不断补充。核心种质的大小及内容也应随种质资
源的变化而有所调整，以满足牡丹的遗传多样性和
种质资源的长期保存、利用的需要。
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