全 文 ：收稿日期:2007-07-03;　修订日期:2007-11-18
基金项目:桂林三金药业股份有限公司横向课题 [ 2004]
作者简介:周中流(1981-),男(汉族),湖南邵阳人 ,现为北京中医药大学
在读博士研究生 ,硕士学位 ,主要从事天然有机化学研究工作.
＊通讯作者简介:尹文清(1968-),女(汉族),湖南郴州人 ,现任广西师范大
学化学化工学院副教授 ,博士学位 ,主要从事天然产物研究与开发工作.
毛冬青根中木脂素配糖体提取工艺及纯化鉴定研究
周中流1 , 邹节明 2 , 王力生2 , 曾　立 1 , 尹文清1 , 2＊
(1.广西师范大学化学化工学院 ,广西 桂林 　541004;　2.桂林三金药业股份有限公司 ,广西 桂林　541004)
摘要:目的 研究毛冬青总木脂素配糖体最佳提取工艺 , 并将总木脂素配糖体进行纯化鉴定。 方法 采用正交实验 ,考察
乙醇浓度 、提取温度 、固液比及提取时间 4个因素对该工艺的影响;利用 D101大孔树脂分离纯化毛冬青总木脂素配糖
体。结果 确定了毛冬青木总脂素配糖体的最佳提取工艺为:提取时间为 1.5 h, 提取温度为 80℃,乙醇浓度 70%, 固液比
1∶5;纯化后的总木脂素配糖体经红外光谱初步鉴定与 tortosideA对照品都具有木脂素母核的基本结构特征。 结论 优
选出的最佳提取工艺条件及纯化总木脂素配糖体的方法 ,对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
关键词:毛冬青;　木脂素配糖体;　提取工艺;　纯化;　鉴定
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)04-0868-02
Extraction, PurificationandCharacterizationofTotalLignansfrom Ilexpubescens
Hook.etArn.
ZHOUZhong-liu1 , ZOUJie-ming2 , WANGLi-sheng2 , ZENGLi1 , YINWen-qing1, 2＊
(1.SchoolofChemistry＆ChemicalEngineering, GuangxiNormalUniversity, Guilin541004, China;2.Guilin
SanjinPharmaceuticalCo.Ltd., Guilin541004, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheoptimumextractionprocessforthetotallignansfromPubescentHollyroot, andlignanswaspurifiedandcharacterized.MethodsByorthogonaldesign, theefectsofconcentrationofethanol, temperature, ratioofsolidto
liquidandtimeofextractiononthetotallignansextractionratewereinvestigated.Thetotallignanswereseparatedandpurifiedby
D-101porousresinabsorption.ResultsTheoptimumextractionconditionwasattemperatureof80 ℃, concentrationofalcohol
was70%, solid/lipuidratiowas1:5 andextractiontimewas1.5 h.ItsstructurewascharacterizedbyIRspectrum, theresult
showedthatboththetotallignansandtortosideAhadthesameconstructurefractions.ConclusionTheoptimumextractioncondi-
tionandpurificationexperimentareveryusefulforfurtherdevelopmentofindustrialprocess.
Keywords:IlexpubescensHook.etArn.;　Totallignans;　Extractingprocess;　Purification;　Characterization
　　毛冬青 IlexpubescensHook.etArn是冬青科冬青属下的一种
植物 , 常绿灌木 ,产于广东 、广西 、安徽等地。毛冬青的根是我国
江南一些省区民间常用药 ,经现代药理实验和临床应用证明 ,是
治疗心血管疾病较好的药物 [ 1] 。据文献报道 [ 2] , 毛冬青根中含
liriodendrin、tortosideA、(+)-medioresinoldi-O-β -D-gluco-
pyranoside、(+)-pinoresinol-4, 4-O-bisglucopyranoside等木
脂素成分 , 都是以木脂素为苷元的配糖体 , 结构在局部有高度的
对称性。据报道 [ 3]它们用来制备补药 , 能够降压 , 调节神经系
统 , 增强身体抵抗力 ,且对血压有双相调节等功效。
毛冬青根中总木脂素配糖体的提取工艺尚未见报道 ,本文拟
通过正交实验研究毛冬青根中总木素配糖体的最佳提取工艺条
件 , 以总木脂素配糖体提取率为指标 ,系统地考察了溶剂浓度 、固
液比 、提取时间 、提取温度等因素的影响 ,最后优选出最佳提取方
案 , 并对采用该方案提取的毛冬青总木脂素配糖体进行分离 、纯
化及鉴定 , 为本地毛冬青及毛冬青木脂素配糖体的开发利用提供
实验数据和理论指导 。
1　器材与方法
1.1 　材料与试剂 毛冬青干燥根由广西柳州市中药饮片厂提
供 , 药材经由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为冬青科
植物毛冬青 IlexpubescensHook.eLAm的干燥根;木脂素配糖体
tortosideA对照品系笔者从广西毛冬青根中分离得到的单体 ,其
它试剂均为分析纯。
1.2　仪器 TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通
用仪器有限责任公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电
子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)。
1.3　方法
1.3.1　样品提取工艺 称取毛冬青干燥根粗粉 100.0 g, 按表 1
所示的正交条件 ,采用不同体积分数的乙醇加热回流提取 , 合并
所得浸膏加水溶解 ,依次用石油醚 、水饱和的正丁醇萃取 ,减压蒸
干萃取液 ,干燥得到粗提物用 150 ml甲醇溶解 ,作为待测液。
1.3.2　毛冬青干燥根中总木脂素配糖体的定量测定 以木脂素
配糖体 tortosideA为对照品 ,用分光光度法测定木脂素配糖体含
量并计算毛冬青总木脂素配糖体提取率。
总木脂素配糖体提取率(%)=[ (提取液中木脂素配糖体
总量)/(所用毛冬青干燥根原料量)] ×100%
1.3.3　正交实验 选取乙醇浓度 、提取温度 、固液比及提取时间
四因素作 L9(34)正交实验 , (见表 1, 2)。并对结果进行方差分
析和显著性检验。见表 3。
2　结果
2.1 　毛冬青总木脂素配糖体的定量测定
2.1.1　标准溶液和标准曲线的测定 tortosideA对照品经无水
甲醇溶解后于 TU-1901双光束紫外可见分光光度计上作最佳
吸收波长扫描并绘制扫描曲线 ,实验结果显示在 275 nm处有最
大吸收且反应 3 h内其吸光度保持稳定。
精确称量木脂素配糖体 tortosideA对照品 5 mg, 用无水甲醇
溶解并定容至 25 ml, 再依次配制成 5, 10, 15, 20, 40, 80 μg/ml的
标准溶液 ,以无水甲醇为空白 , 在 275 nm处测定吸光度 , 回归分
析得到标准曲线为 Y=0.021 4X+0.035,式中 Y为吸光度 , X为
tortosideA含量 (μg/ml), X的取值在 5 ～ 80μg范围内线性关
系良好 ,相关系数 r=0.998 9。
2.1.2　毛冬青总木脂素配糖体的提取率测定 精确吸取
“ 1.3.1”项下待测液 0.2 ml并稀释定容至 25 ml,在 275 nm处测
定吸光度 ,从而可以得到毛冬青总木脂素配糖体的提取率。结果
·868·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.4　
见表 2。
2.2　正交实验的设计及结果 用乙醇为溶剂提取的 4因素 、3水
平正交实验因素 、水平见表 1, 结果见表 2。对表中总木脂素配糖
体提取率进行方差分析和显著性实验 ,结果见表 3。表 2中出现的
k1 , k2 , k3分别代表某个因素的不同水平的指标值加和 , K1 , K2 ,K3分别代表某个因素的不同水平的指标平均值 , R代表极差。
通过比较各因素的极差值 (R)可以看出 , 影响总木脂素配
糖体提取率的因素顺序为 D>A>C>B,具体见表 2。从表 3可
以看出 , 乙醇浓度和提取时间对毛冬青总木脂素配糖体的提取有
显著性影响 , 并考虑总木脂素配糖体的提取率和实际生产情况 ,
最终确定的最佳提取工艺条件为:D1A1C1B3 , 即乙醇的体积分数
为 70%, 固液比为 1∶5, 提取时间为 1.5 h, 提取温度为 80℃。此
条件下提取后测得总木脂素配糖体的含量为 0.438%。
2.3　最佳提取工艺的验证 精密称取 3份干燥的毛冬青干燥根
50.0 g,按最佳工艺条件平行操作 , 按照 “ 1.3.1”项下和 “ 1.3.2”
项下测定吸光度 , 根据回归方程得出毛冬青总木脂素配糖体的含
量 , 其结果见表 4。由表 4最佳工艺验证结果表明 ,用最佳工艺
条件提取 , 毛冬青总木脂素配糖体提取率均高于其它各正交实验
值 , 故本最佳工艺条件合理。同时 RSD=2.2%也表明此工艺重
复性好 , 具有较好的稳定性。
表 1　正交实验因素水平
水平 A乙醇浓度(%)
B
温度 /℃
C
固液比 /g:ml
D
时间t/h
1 70 60 1:5 1.5
2 80 70 1:10 3
3 90 80 1:20 4.5
表 2　L
9
(34)正交实验结果
实验号 A B C D 木脂素配糖体提取率(%)
1 1 1 1 1 0.389
2 1 2 2 2 0.311
3 1 3 3 3 0.341
4 2 1 2 3 0.305
5 2 2 3 1 0.361
6 2 3 1 2 0.306
7 3 1 3 2 0.298
8 3 2 1 3 0.327
9 3 3 2 1 0.359
k
1 1.041 0.992 1.022 1.109k2 0.972 0.999 0.975 0.915k3 0.984 1.006 1.000 0.973K1 0.347 0.331 0.341 0.370K2 0.324 0.333 0.325 0.305K3 0.328 0.335 0.333 0.324
R 0.023 0.004 0.016 0.065
表 3　正交实验方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
乙醇浓度 0.000 906 2 0.000 453 37.75 ＊
温度 0.000 024 2 0.000 012 1
固液比 0.000 192 2 0.000 096 8
时间 0.006 702 2 0.003 351 279.25 ＊＊
　　F0.99(2, 2)=91.01, F0.95(2, 2)=19.00, F0.9(2, 2)=9.00;＊代表
显著;＊＊代表特别显著
2.4 　毛冬青总木脂素配糖体的纯化 称取 500 g的毛冬青干燥
根粉末按正交实验中确定的方法提取 , 减压浓缩至无醇味 , 加蒸
馏水溶解 , 静置过夜 ,过滤 , 将滤液稀释定容至 1 000 ml。定量取
100ml溶液 ,加到已经预处理好的 D101大孔树脂柱上 , 先用蒸
馏水洗脱 , 除去糖类 、无机盐等不易被吸附的物质 , 然后用 30%
的乙醇水溶液进行洗脱 , 合并洗脱液并浓缩至干 , 得到干燥浸膏。
然后按 “ 2.1.2”项操作 ,测定吸光度 , 根据回归方程计算纯化后
上述浸膏中总木脂素配糖体的含量 ,所得总木脂素配糖体的纯度
为 51.6%。
表 4　最佳工艺验证结果 %
编号 总木脂素配糖体的含量 平均值
1 0.454
2 0.439 0.438
3 0.421
2.5　毛冬青总木脂素配糖体的初步鉴定
2.5.1　定性检测 按照毛冬青木脂素配糖体的定性检测方法进
行试验 , FeCl3反应和 Molish反应检测现象明显 ,初步说明纯化
后的毛冬青浸膏中含有木脂素配糖体。
2.5.2　红外光谱检测 取毛冬青提取纯化后的样品毛冬青总木
脂素配糖体与 tortosideA对照品分别用 KBr压片 , 在红外光谱仪
上进行扫描 , 所得谱图见图 1 ～ 2。从图 1的红外光谱中可以看
出 , 在 3 444, 2 937, 2 852, 1 595, 1 510, 1 128, 1 081, 1 054cm-1左
右有典型的吸收;从图 2中同样可以看出 , 在 3 427, 2 937, 2 856,
1 597, 1 508, 1 128, 1 080, 1 053cm-1左右有较明显的吸收峰;通
过对比不难发现 ,纯化后的毛冬青总木脂素配糖体的红外吸收在
tortosideA对照品中都可以找到 , 说明都含有取代苯基 、羟基 、甲
氧基和 C-O-C(糖苷键结构片断), 表明提取纯化的毛冬青总
木脂素配糖体与 tortosideA对照品都具有木脂素糖苷的基本结
构特征 。两图中存在部分的差异 ,因为提取纯化的毛冬青总木脂
素配糖体中仍然有杂质或含有与 tortosideA对照品母核结构有
部分差异的木脂素配糖体。
图 1　tortosideA对照品
图 2　毛冬青总木脂素配糖体
3　讨论
毛冬青根的粉碎与否能显著影响提取效率 ,原因是粉碎能使
根皮破裂 ,有利于溶剂的渗透及有效成分的溶出 , 因此 ,提取时应
以粗粉为佳。
通过正交实验, 最终确定的最佳提取工艺条件为:D1A1C1B3 ,
即乙醇的体积分数为 70%,固液比为 1∶5, 提取时间为 1.5 h, 提
取温度为 80℃。此条件下提取后测得总木脂素配糖体的含量为
0.438%。提取时间和乙醇的浓度是影响提取效果的显著因素, 因
此 , 在提取过程中要注意控制提取时间和乙醇的浓度。
本文所用的对照品系笔者从广西毛冬青干燥根中分离得到
的木脂素配糖体 tortosideA, 其晶体经核磁共振图谱 、红外 、紫外
和质谱 ,结合旋光度和熔点测定 , 确认其纯度达到 98%以上。
·869·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.4 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期
按最佳工艺提取所得的总木脂素配糖体 ,大孔树脂纯化后测得
其含量达到 51.6%,经理化性质和红外光谱检测 ,毛冬青总木脂素
配糖体与 tortosideA对照品都具有木脂素糖苷的基本结构特征。
参考文献:
[ 1] 　熊友香 ,李　昶 ,罗宪堂.毛冬青的化学成分 、药理作用研究进展
[ J] .中药材 , 2002, 25(5):371.
[ 2 ] 　杨　鑫 ,丁　怡 ,孙志浩 ,等.毛冬青的化学成分研究 [ J] .中草药 ,
2005, 36(8):1146.
[ 3 ] 　JuneiKinjo, KatsuraFukui, ToshlhiroNohara, etal.Thefirstisolation
oflignantri-andtetra-glycosides[ J] .Chem.Pharm.Bul, 1991, 39
(6):1623.
收稿日期:2007-01-16;　修订日期:2007-10-27
基金项目:江西省教育厅课题 [ No.(2005)246号 ]
作者简介:王小丽(1977-),女(汉族),江西赣州人 ,现任赣南医学院讲师 ,
硕士学位 ,主要从事深部真菌及抗真菌中草药研究工作.
＊通讯作者简介:马廉兰(1952-), 女(汉族),江西赣州人 , 现任赣南医学
院教授 ,学士学位 ,主要从事深部真菌与抗真菌中草药研究工作.
白假丝酵母菌不同菌株对动物致病性的对比性观察
王小丽 , 马廉兰＊ , 刘志春 , 钟有添 ,谢水祥 ,曹镐禄
(赣南医学院 ,江西 赣州　341000)
摘要:目的 观察白假丝酵母菌标准菌株(CCCMC1a、ATCC14053)与临床分离菌株(C1-1, C1 -2, C1-3 , C1-4)对小
鼠与家兔的致病情况 , 并探讨不同菌株对动物致病性与荚膜厚薄的关系。方法 小鼠及健康成年家兔按上述菌株不同分
为 CCCMC1a, ATCC14053, C1-1, C1-2, C1-3 , C1-4共 6组 , 每组小鼠 20只 , 家兔 12只;将实验菌种沙保氏琼脂 36
h培养物用生理盐水配成约含 1×109个 / ml的菌悬液 ,家兔耳缘静脉注射 , 1 ～ 1.5ml/只;对 BALB/c小鼠腹腔注射 , 0.5
ml/只 ,于注射后 6 h开始密切观察动物的反应 ,连续观察 7 d,记录动物发病情况:发病天数 、死亡天数及死亡动物数 、动
物死亡率 、存活动物数等 ,比较不同菌株对动物的致病性。 待实验动物死亡后 , 分别取家兔肾组织印片及小鼠腹腔液涂
片进行 Hiss荚膜染色镜检 ,用显微测微计测量荚膜层的厚度 , 各菌株随机计数 40个酵母细胞的荚膜层的厚度值 ,取各菌
株荚膜层厚度的均值进行比较 ,并且与菌株的动物致病性相联系 , 观察是否具有一定的规律性。结果 C1-2和 C1-4相
对于 C1-1, C1-3, CCCMC1a, ATCC14053来说 , 具有很强的动物致病性。标准菌株和临床分离菌株在家兔及小白鼠体
内均可形成荚膜 , 荚膜层的厚度可因不同菌株和不同动物体内形成而有显著差异 , P<0.01或 P<0.05。结果显示 ,兔肾
感染灶的菌细胞较小鼠腹腔内菌细胞的荚膜明显宽厚 , C1-1, C1-2, C1-3 , C1-4组的兔肾感染灶的菌细胞及鼠腹腔
内菌细胞的荚膜比 CCCMC1a, ATCC14053明显宽厚 ,其中对动物高致病性的 C1-2和 C1 -4的兔肾感染灶的菌细胞及
鼠腹腔内菌细胞的荚膜最为宽厚 。结论 C1-2和 C1-4具有很强的动物致病性 ,它们的荚膜与其它菌株相比较也更宽
厚。荚膜可能是白假丝酵母菌的毒力因子 ,荚膜的宽厚与动物的致病性有着密切的联系。
关键词:白假丝酵母菌;　标准菌株;　临床菌株;　致病性;　荚膜
中图分类号:R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)04-0870-02
StudyofthePathogenicityofCandidaalbicansinAnimals
WANGXiao-li, MALian-lan＊ ,LIUZhi-chun, ZHONGYou-tian,XIEShui-xiang, CAOGao-lu
(DepartmentofMicrobiology, GannanMedicalColege, JiangxiGanzhou341000, China)
Abstract:ObjectiveToobservethepathogenicityofthestandardstrain(CCCMCIaATCC14053)andtheclinicalisolationstrain
(C1-1 C1-2C1-3C1-4)ofcandidaalbicansinmiceandrabbits, andtostudytherelatiorshipbetweenitandthethickness
ofthecapsule.Methods 120 BALB/cmiceand72rabbitsweredividedequalyintosixgroups.Thestrainssmearedonsabou-
randagermediumfor36hweredilutedintothebacterialsolutionof1×109 /mlbyphysiologicalsaline.1ml-1.5mlofthissolu-
tionwasinjectedinarabbitsvergeveinofear, and0.5mlinamouseabdominalcavity.Theanimalswereobservedandrecorded
for7d.Aftertheepisoded, theanimalsweredissectedandthethicknessofcapsulewasobservedbyHisscapsulestain, andsur-
veyedbymicroscopicsurveyinginstrument.Thethicknessofaspecimansaveragecapsuledefinedbytheaveragethicknessof40
sacccharomyceticcelwascomparedwiththeothers.ResultsComparedwithC1-1, C1-3, CCCMC1a, ATCC14053, C1-2and
C1-4 hadstrongpathogenicitytoanimals.Capsularstructuresdistinctborderlinecouldbeseenintheyeast-likecellsonthe
smearfromthethestandardstrainandtheclinicalisolationstrain, infectedmouseandrabbittissues(P<0.01 orP<0.05).
Buttheformationofthecapsulewasapparentlyrelatedtoanimalsandthestrainspecimen.Resultsshowedthatthethicknessof
thecapsuleinrabbitwaslargerthanthatinmouse.ThethicknessofthecapsuleinrabbitsandinmouseofC1-1, C1-2, C1-3
, C1-4 werelargerthanthatofCCCMC1a, ATCC14053.C1-2 andC1-4 whichhadhighpathogenicityhadthelargestcap-
sule.ConclusionThepathogenicityofcandidaalbicansisrelatedtothethicknessofthecapsule.
Keywords:Candidaalbicans;　Standardstrain;　Clinicalisolationstrain;　Pathogenicity;　Capsule
　　白假丝酵母菌 S.albicans, 俗称白色念珠菌 Candidaalbicans, 是假丝酵母菌属(Saccharomyces)中最常见的病原菌。新近报告
临床标本中分离的真菌以白色念珠菌为主 ,占 45.3%[ 1] 。真菌
感染在化疗相关性腹泻中占重要地位 [ 2] , 也为 AIDS病人并发感
染的常见致病菌 [ 3] 。过去认为其不具有荚膜 [ 4] 。马廉兰等 [ 5 , 6]
从女性性病患者的阴道分泌物中分离到多株菌株具有荚膜结构。
有关白假丝酵母菌的致病因素 ,现认为白假丝酵母菌的芽管及形
成的假菌丝是其重要的致病物质 [ 7 , 8] 。荚膜与该菌的毒力是否
有关未见报道 , 本文就白假丝酵母菌不同菌株对动物的致病性及
·870·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.4