全 文 ：第 30卷　第 2期
2012年 6月 　　　　
广西师范大学学报:自然科学版
Journa l o f Guangx i No rmal Univ ersity: Na tural Science Edition
　　　　　　 Vol. 30　No. 2
Jun. 2012
收稿日期: 2011-07-21
基金项目: 广西自然科学基金创新团队项目 ( 2010GXN SFF013001) ;药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室
科研项目 ( 07109001-03)
通信联系人: 尹文清 ( 1968— ) ,女 ,湖南郴州人 ,广西师范大学教授 ,博士。 E-mail: yinw q0000@ yahoo. com. cn
毛冬青叶三萜酸提取纯化研究
尹文清 ,冯华芬 ,段少卿 ,谭　强 ,岑宁才
(广西师范大学化学化工学院 ,药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室培育基地 ,广西桂林 541004)
摘　要:以毛冬青叶为原料 ,齐墩果酸为标准品 ,用香草醛比色法测毛冬青叶三萜酸的含量 ,通过单因素试验
和正交试验相结合的方法考察了提取次数、料液比、乙醇浓度、提取时间对毛冬青叶三萜酸提取的影响。 结果
表明 ,提取的最佳工艺条件为料液比 1∶ 16,乙醇浓度 70% ,提取时间 90 min,提取 2次 ,在此条件下所得三萜
酸含量为 6. 18% 。此方法简单易行 ,为进一步开发利用毛冬青叶提供科学依据。
关键词: 毛冬青叶 ;三萜酸 ;提取工艺 ;正交试验
中图分类号: O629; R284. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2012) 02-0088-06
毛冬青 Ilex pubescens Hook. et Arn为冬青科 Aquifoliaceae冬青属植物 ,为常绿灌木或乔木 ,主要分
布在我国广东、广西、福建、江西、湖南等省 (区 ) ,根和叶均能入药 ,具有活血通络、消肿止痛、清热解毒之功
效 [1-3 ]。 现代临床试验证明 ,毛冬青作为治疗冠心病的处方用药显示较好疗效 [4-5 ]。
目前为止 ,国内外学者对毛冬青三萜酸类化合物的研究主要集中在根和根皮两个部位 [6-12 ] ,对毛冬青
叶中三萜酸的提取工艺尚未见报道。目前三萜酸类化合物已成为天然产物开发中最活跃、进展最快的领域
之一。三萜酸类化合物具有多种重要的生物活性和广泛的药理作用 ,是很多中药的主要活性成分。初步研
究发现毛冬青叶中含有多种三萜酸类化合物 ,因此对毛冬青叶中的三萜酸类化合物进一步研究具有重要
的实用价值。 本文通过系统考察提取次数、料液比、乙醇浓度、提取时间等因素的影响 ,优选出最佳的提取
方案 ,并对采用该方案提取得到的三萜酸进行纯化、鉴定 ,为进一步开发和利用毛冬青叶资源提供理论参
考。
1　仪器与药品
T U-1901双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司 ) ; JA1003N型电子天平 (上
海精密科学仪器有限公司 )。
无水乙醇、冰乙酸、高氯酸、香草醛等均是分析纯 ;齐墩果酸对照品 (生化试剂 ,购自中国药品生物制品
检定所 ,批号: 0709-9803) ; Ilex g enin A对照品是本实验室从毛冬青根中分离得到的单体化合物 [13 ] ;毛冬
青叶购自桂林中南药业有限公司。
2　方法与结果
2. 1　毛冬青叶中三萜酸的含量测定
2. 1. 1　齐墩果酸标准曲线绘制
精确称取齐墩果酸标准品 10. 0 mg置于 50 mL容量瓶中 ,加入无水乙醇溶解 ,定容 ,即得 0. 2 g /L的
标准品溶液。根据文献 [14]的方法 ,分别精确吸取齐墩果酸标准品溶液 25、 50、 100、 150、 200μL于 10 mL
具塞试管中 ,水浴蒸干 ,加 0. 3 mL新配制的质量分数为 5%香草醛 -冰醋酸溶液和 0. 8 mL的高氯酸 ,于
80°C水浴中加热 10 min,取出置冰水中冷却 ,加冰醋酸 5 mL,摇匀 ,即得待测液 ,在 550 nm处测定吸光
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2012. 02. 009
度 ,以吸光度 ( A )为横坐标 ,齐墩果酸质量体积浓度为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,如图 1所示。通过线性回归
计算 ,得出回归方程: C= 0. 016 4A- 0. 001 8,线性相关系数: R2= 0. 999 2。
图 1　齐墩果酸标准曲线
Fig . 1　 Standa rd curv e o f oleanolic acid
2. 1. 2　毛冬青叶三萜酸的提取及含量测定
准确称取 5. 0 g毛冬青叶置于 100 mL圆底烧瓶中 ,在一定乙醇浓度、一定料液比、一定提取次数、一
定提取时间下回流提取 ,将提取液浓缩后转移至 100 mL容量瓶中 ,用 50%的乙醇定容至刻度 ,即得供试
品溶液。
准确移取供试品溶液 10μL于 10 mL具塞试管中 ,按 2. 1. 1的方法测定吸光度 ,通过线性回归方程
计算毛冬青叶中三萜酸含量。
2. 1. 3　精密度试验
精密量取同一提取液 6份 ,按 2. 1. 2的方法测定吸光度 ,结果见表 1,其 RSD为 2. 107 0% ,表明该测
定方法具有良好的重现性。
2. 1. 4　稳定性试验
取供试品溶液一份 ,按 2. 1. 2的方法在 550 nm处每隔 10 min测定一次吸光度 ,考察 1 h内吸光度的
稳定性 ,结果如表 2所示 ,其 RSD为 0. 392 0% ,表明在 1 h内稳定性较好 ,吸光度变化很小。
表 1　精密度实验结果
Tab. 1　Result of stability tests
试验次数 A RSD /%
1 0. 229 5
2 0. 207 5
3 0. 231 2
4 0. 220 8
5 0. 218 2
6 0. 227 5
2. 107 0
表 2　稳定性实验结果
Tab. 2　Result of precision tests
静置时间 /min A RSD /%
0 0. 229 5
10 0. 228 3
20 0. 227 1
30 0. 226 4 0. 392 0
40 0. 225 7
50 0. 225 2
60 0. 225 0
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表 3　重复性实验结果
Tab. 3　 Result of repeatability tests on the total triterpenes
实验次数 吸光度 RSD /%
1 0. 229 1
2 0. 207 5
3 0. 231 0 2. 457 0
4 0. 220 4
5 0. 218 2
6 0. 227 3
2. 1. 5　重复性实验
准确量取同一提取液 6份 ,按 2. 1. 2的方法测定吸光度 ,结果见表 3,其 RSD为 2. 457 0%。
2. 1. 6　加样回收率试验
精密量取 6份已知浓度的提取液 1 mL于试管中 ,分别加入 0. 1 mL的齐墩果酸标准溶液 ,按 2. 1. 2
的方法测定吸光度 ,计算回收率 ,结果如表 4所示 , RSD为 1. 958 8% ,结果表明回收较完全 ,方法可靠。
表 4　回收率实验结果
Tab. 3　 The result of recovery tests on the total triterpenes
实验次数 样品含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% RSD /%
1 0. 005 2 0. 02 0. 024 34 95. 69
2 0. 005 2 0. 02 0. 025 02 99. 08
3 0. 005 2 0. 02 0. 024 67 97. 37 1. 958 8
4 0. 005 2 0. 02 0. 025 29 100. 45
5 0. 005 2 0. 02 0. 024 51 96. 54
6 0. 005 2 0. 02 0. 024 36 95. 82
2. 2　单因素试验结果
2. 2. 1　提取次数对三萜酸提取的影响
准确称取 5. 0 g毛冬青叶于 100 mL圆底烧瓶中 ,固定乙醇浓度 80% ,料液比 1∶ 10,回流提取 60
min,考察提取次数对提取的影响 ,结果见图 2。
由图 2可知 ,三萜酸含量随提取次数增加不断增加 ,但超过 3次以后 ,三萜酸含量随提取次数增加而
增加得较为缓慢 ,所以本实验选择提取次数为 3次。
　　　　 图 2　提取温度对三萜酸提取的影响　　　　　　　　　 图 3　料液比对三萜酸提取的影响
　　 Fig . 2　 Effect of tempera ture on the ex trac tion　　 Fig. 3　 Effect o f th e radio ma teria l to liquid on the ex tr action
efficiency efficiency
2. 2. 2　料液比对三萜酸提取的影响
准确称取 5. 0 g毛冬青叶于 100 mL圆底烧瓶中 ,固定乙醇浓度 80% ,回流提取 60 min,提取 1次 ,考
察料液比对提取的影响 ,结果见图 3。
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由图 3可知 ,料液比在 1∶ 8至 1∶ 16之间 ,三萜酸含量增加的趋势非常明显 ,说明随着乙醇溶液量的
增加 ,毛冬青叶中的三萜酸浸出越充分 ,但当料液比大于 1∶ 16时 ,随乙醇溶液量的增加三萜酸含量反而
减少 ,这可能是由于其他物质的溶出量增加 ,抑制了三萜酸的吸收。所以选择料液比 1∶ 16。
2. 2. 3　乙醇浓度对三萜酸提取的影响
准确称取 5. 0 g毛冬青叶于 100 mL圆底烧瓶中 ,固定提取时间 60 min,回流提取 1次 ,料液比 1∶
10,考察乙醇浓度对提取的影响 ,结果见图 4。
由图 4可知 ,随着乙醇浓度增加 ,三萜酸含量逐渐增大 ,但当乙醇浓度高于 70%以后 ,三萜酸含量增
大的趋势变慢 ,所以选择乙醇浓度 70% 。
　　　　　　图 4　乙醇浓度对三萜酸提取的影响　　　　　　　　　图 5　提取时间对三萜酸提取的影响
　　　 Fig . 4　 Effect of concentr ation of ethanol on the　　　　　 Fig. 5　 Effect of time of ex tr action on the
ex tra ction efficiency ex traction efficiency
2. 2. 4　提取时间对三萜酸提取的影响
准确称取 5. 0 g毛冬青叶于 100 mL圆底烧瓶中 ,固定料液比 1∶ 10,乙醇浓度 80% ,提取 1次 ,考察
提取时间对提取的影响 ,结果见图 5。
由图 5可知 ,在其他因素不变的情况下 ,提取时间越长 ,三萜酸含量越大 ,但当提取时间大于 60 min
时 ,三萜酸含量增加的速度变慢 ,这可能是由于毛冬青叶中的三萜酸提取趋于完全 ,考虑到节约的原则 ,选
择提取时间为 60 min。
2. 3　正交试验设计及结果
在单因素试验的基础上 ,为考查各因素之间相互作用 ,我们采用 L9 ( 34 )正交设计 ,考察提取次数、料液
比、乙醇浓度、提取时间对三萜酸得率的影响 ,如表 5所示。
表 5　正交设计及数据处理
Tab. 5　 Table for orthogonal test and the result of extraction with alcohol
因素 提取次数 ( A) 料液比 /( g· m L- 1 ) (B ) 乙醇浓度 /% (C ) 提取时间 /min(D) 三萜酸含量 /%
1 1 1∶ 14 70 60 3. 42
2 1 1∶ 16 80 90 5. 08
3 1 1∶ 20 90 120 2. 91
4 2 1∶ 14 80 120 3. 34
5 2 1∶ 16 90 60 5. 93
6 2 1∶ 20 70 90 5. 89
7 3 1∶ 14 90 90 5. 81
8 3 1∶ 16 70 120 5. 42
9 3 1∶ 20 80 60 2. 84
K 1 11. 42 12. 57 15. 73 12. 20
K 2 15. 17 17. 43 11. 27 16. 78
K 3 15. 07 11. 65 14. 66 12. 68
R 3. 75 5. 78 4. 47 4. 58
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　　表 5表明 ,影响毛冬青叶三萜酸提取的因素大小为: B> D> C> A ,即料液比> 提取时间> 乙醇浓度
> 提取次数。 由表 6方差分析可知 ,料液比为最显著因素 ,其他 3个都为差异不显著因素。 通过以上分析
得出最佳工艺组合为 A2B2C1D2 ,即提取次数为 2次 ,料液比为 1∶ 16,乙醇浓度为 70% ,提取时间为 90
min。
表 6　方差分析结果
Tab. 6　 Result of analysis of variance
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性水平
A 3. 048 5 2 1. 524 2 1 524. 2 *
B 6. 437 8 2 3. 218 9 3 218. 9 * *
C 3. 622 1 2 1. 811 0 1 811. 0 *
D 4. 226 3 2 2. 113 1 2 113. 1 *
误差 0. 002 2 0. 001
　注: * 表示差异性不显著 ;* * 表示差异性显著
表 7　重复性实验结果
Tab. 7　 Result of repeat tests on the total triterpenes
次数 三萜酸含量 /% 平均含量 /% RSD /%
1 5. 97
2 6. 27 6. 18 1. 254 3
3 6. 31
2. 4　最佳工艺条件的验证
对最优水平作进一步验证实验 ,重复 3次 ,最后得出三萜酸平均含量为 6. 18% ,如表 7所示 ,表明在
最优条件下三萜酸含量高于其他各正交实验值 ,其 RSD%为 0. 254 3% ,说明该方法稳定、可行。
2. 5　毛冬青叶三萜酸的纯化 [15 ]
称取干燥的毛冬青叶 100 g ,按正交试验中确定的最佳提取方案提取 ,滤去药渣 ,浓缩提取液至 100
m L,即得毛冬青叶三萜酸提取液 ,注入事先处理好的 D101-大孔吸附树脂柱分离系统 ,采用分段淋洗 ,先
用蒸馏水洗脱至无色 ,洗去未被吸附的物质及糖类和其他水溶性部分 ,然后用 70%的乙醇水溶液进行洗
脱 ,合并洗脱液并浓缩至干 ,即得三萜酸粗品 ,然后用无水乙醇溶解 ,用 5% NaOH调节溶液 pH= 8. 0,静
置 ,过滤 ,滤液用 10% HCL酸化至 pH= 2. 0～ 3. 0,滤集沉淀 ,用蒸馏水洗至中性 , 60°C真空干燥得毛冬
青叶三萜酸。
3　结论
采用单因素试验及正交试验相结合的方法研究毛冬青叶中三萜酸类化合物的提取工艺 ,结果表明 ,料
液比对实验结果的影响较为显著 ,其次是提取时间和乙醇浓度。最佳提取条件为: 料液比 1∶ 16,乙醇浓度
70% ,回流提取 90 min,提取 2次。在最优条件下平行实验 3次 ,三萜酸平均得率为 6. 18%。该研究为毛冬
青叶的开发利用提供科学的理论依据。
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Ex traction o f To tal Triterpenoids from Ilex pubescens Hook leav es
YIN Wen-qing, FENGHua-fen, DUAN Shao-qing, TAN Qiang, CEN Ning-cai
( Sta te Key Labo ra tor y Cultiv a tion Base fo r the Chemistry and Mo lecula r Engineering of M edicinal Resources,
Co llege o f Ch emistry and Chemical Eng ineering , Guangx i No rma l Univ er sity , Guilin Guangxi 541004, China)
Abstract: The ex t raction process of t riterpenoids f rom Ilex pubescens Hook leaves w as investig ated. The
t riterpenoids composition was determined by spect rumetric method w ith oleano lic acid as a reference.
The influence o f ex t racting times, radio o f liquid to ma terial, ex tracting time and concentration of ethanol
on the t ri terpenoids of yield w ere evalua ted by sing le factor experiments and or thogonal experiments.
The results show ed that the optimum condi tions w ere 1∶ 16 in radio o f liquid to material , concentration
o f ethanol 70% , ex t raction time 90 min and ex t racting tw o times. The content o f t ri terpenoids w as
6. 18% in ex t ract.
Key words: Ilex pubescens Hook leav es; t ri terpenoids; ex traction process; orthogonal test
(责任编辑　王龙杰 )
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