全 文 ：分子植物育种，2005年，第 3卷，第 1期，第 31-35页
M olecularPlantBreeding,2005,Vol.3,No.1,31-35
研究报告
RESEARCH REPORT
拟南芥 TCP家族转录因子 !#$%&’(’的转录激活活性鉴定与表达谱分析 雷娟 魏刚 朱玉贤 * 北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室,北京,100871 *通讯作者,zhuyx@ water.pku.edu.cn TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子家族，它主要在分生组织中起作用，与细胞分化和生 长有很大联系。我们以哥伦比亚野生型拟南芥为模板得到基因 !#$%&’(’的全长 ORF，生物信息学分析结
果表明它具有 TCP家族保守结构域，属于 TCP家族的转录因子。以拟南芥成株不同组织的 RNA 为模板进
行 RT-PCR 实验，结果发现较之其它组织，该基因在花中有比较高的表达量；通过酵母单杂交实验鉴定该基
因具有转录激活活性。综合以上结果，我们认为 !#$%&’(’基因在拟南芥花形成发育的过程中发挥转录因 子的作用，在一定程度上调控和影响了这个过程。 TCP,转录因子,拟南芥,RT-PCR,酵母单杂交 C haracterization of Transcription Activity and Expression Profile of !#$%&’(’,aM emberofTCP Fam ilyin!)*+,-./0,0
LeiJuan W eiGang ZhuYuxian*
NationalLaboratoryofProteinEngineeringandPlantGeneticEngineering,PekingUniversity,Beijing,100871
*Correspondingauthor:zhuyx@ water.pku.edu.cn
TCP family isa transcription factorfam ily which particularly existsin plantgenom e.Itm ostly
worksin m eristem and hasgreatrelationship with celldifferentiation and cellgrowth.W ecloned thefulllength
ORF ofgene!#$%&’(’ from Colum biawild type!)*+,-./0,0.According to theresultofbioim formaticsanaly- sis,!#$%&’(’ hastheconserved TCP domain so belongsto TCP fam ily.UsingthecDNA from differenttissues
ofadult!)*+,-./0,0 astem plates,wegottheresultofRT-PCR whichtoldusthatgeneexpressedahigherlevelin
flowerthan anyothertissues.Afterward weproved thatithad transcription activation function viayeastone-hy-
brid technique.Alltheseresultsaboveshowed usgene!#$%&’(’ worksasatranscription factorin theprogress of!)*+,-./0,0 flower’sgrowth. TCP,Transcriptionfactor,!)*+,-./0,0,RT-PCR,Yeastone-hybrid TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子 家族(RiechmannandRatcliffe,2000)，它主要在分生 组织中起作用，与细胞分化和生长有很大联系（ Ko- sugiand Ohashi,2002）。TCP转录因子家族最早的 成员是金鱼草基因 +&，玉米基因 121和水稻基因 3140，+)*5678- &(+&)和 696:.,-8*(696)编码的蛋白 都形成不典型的螺旋—环—螺旋结构(non-canoni- calbasic-Helix-Loop-Helix (bHLH)structure)，在水 稻 PCF DNA 结合蛋白中也发现这种 bHLH 结构的 存在。这种 bHLH 结构在结构和功能上都与经典的 HLH 不同，它是转录因子二聚化和结合 DNA 所必 须的(KosugiandOhashi,2002)。于是含有这种保守 结构域的转录因子被定义为一个新的转录因子家 族——TCP转录因子家族。除此之外，-,67..;* (-,67)基因和许多功能未知的蛋白也属于这个家族 (Doebleyetal.,1997,Cubasetal.,1999)。TCP家族 的转录因子主要在分生组织中起作用，与植物细胞 分化和发育有很紧密的关系。玉米中 +&基因主要 影响叶腋中的芽的生长发育，有抑制侧枝生长和雄 花形成的功能；如 +&野生型的侧枝上芽停止发育 分子植物育种 M olecularPlantBreeding 且带有正在形成的雌花，而突变株侧枝上的初生茎 成倍增长，末端产生穗状的雄花（ LiandHerskowitz, 1993）。金鱼草中 !!与 #$%&基因对花的发育有很
大作用。金鱼草开唇形花，两侧对称但沿背腹轴花
瓣形状显著不同。%%和 #$%& 2个基因的同时突变 会产生辐射对称的花。%%单基因突变产生半辐射 状的花，原腹部的花瓣移到侧旁，原侧瓣移到背部。 ’$!&单基因的突变只影响背部花瓣的形状。这 2个
基因的功能有重叠但是对花的发育又有不同的作
用（ Luoetal.,1999）。水稻中 ()*+，(),-转录因子
是促使分生组织中 PCNA (proliferatingcellnuclear
antigen)启动子的组织特异性表达所必需的，否则便
不能进行正常的 DNA 复制和修复 (Kosugiand O-
hashi,1997)。
pG222质粒和 pYF503质粒为大肠杆菌和酿酒
酵母的穿梭质粒，他们在酿酒酵母中的选择标记基
因分别为尿嘧啶（ Ura）合成酶基因和色氨酸（ Trp）合
成酶基因。PG222质粒带有酵母 .%+基本启动子控
制的 /0!1基因，在 .!+基本启动子的上游 2&3!
和 405H酶切位点间有 3个拷贝能够与酿酒酵母
Gal4调控蛋白结合的顺式作用元件。pYF503质粒
带有编码酿酒酵母 6078结合域（ 6078 B）的基因序
列，并由酵母 9:;启动子控制。在 6078 (B)下游有
多克隆位点，可用于质粒载体的构建，构建成功的
质粒在酿酒酵母中表达 6078 (B)与植物基因的融合
蛋白。在实验中我们将特定转录因子的 cDNA (记为
cDNA(T))连至 pYF503，用构建成功的质粒载体转
化带 pG222的酿酒酵母菌株 EGY48。融合产物
cDNA (T)!6078 (B)会与 pG222质粒 .!+!/0!1上
游的 6078 cis结合。如果该转录因子具有转录激活
活性，70!1基因的表达将被激活，从而在 X-gal平板
上产生蓝色的阳性菌落；反之，如果该转录因子没
有转录激活活性，则菌落将保持白色。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料、菌株、质粒载体
哥伦比亚野生型拟南芥（ :<0=$#3>?$? @&07$0A0） 植株。 酿酒酵母 EGY48(M AT!,his3trp1ura3-25leu:: pleu2-lexAop6)，质粒 pG221，pYF503。 1.1.2实验试剂 Q IAGEN RNeasy PlantM iniKit，Invitrogen 公 司的 SuperscriptFirst#strand cDNA SynthesisSys- tem forRT$PCR 试剂盒。引物合成及 DNA 序列测
定由华诺公司完成。
1.2实验方法
1.2.1:@-BC+DED全长 ORF的克隆
将拟南芥总 RNA 反转录生成第一链 cDNA，方
法参照 Invitrogen公司产品使用手册。并以此 cDNA
为模板，使用引物 (根据 GenBank 上预测的
:@-BC+DED ORF 序列设计所得)forward primer:5’-
GCGCGAATTCATGGGACTTAAAGGATAT-3’rev-
erse prim er: 5’-AAGCGCGTCGACTTAGAGGTGT-
GAGTTTGG-3’进行 PCR 扩增，反应条件为 94%预
变性 1m in，随之 94& 30s，58’ 30s，72( 1m in
30s，32个循环，最后 72)延伸 5m in。PCR 产物经回
收纯化后，酶切并连接到质粒 pYF503中，送华诺公
司测序。
1.2.2:@-BC+DED所含 TCP保守结构域分析
根据所克隆 ORF序列得到其可能的氨基酸序
列，使用生物信息学软件 clustalx将它与含有典型
TCP domain的其它几个物种的蛋白进行多序列同
源性分析。
1.2.3酵母单杂交验证激活活性
酵母感受态细胞的制备：用扁牙签挑取直径
2~3mm 的酵母菌落若干，至 1m lYPD 培养基中，vo-
tex 5m in使之混匀。转接进 50m lYPD 液体中，
30*，250r/min培养 16~18h，至平台期（ OD600>1.5）。
1:10转接使得终 OD600=0.2~0.3。30+，230r/min培
养 3h，使得终 OD600=0.4~0.6。菌液置 50m l离心管
中，室温离心 2890r/m in 5min；弃上清，30m lddH2O
重悬，室温离心 2890r/m in 5min，弃上清。1.5ml预
冷的 1TE/LiAc。
转化：向 1.5m ltube中加入 0.1g待转化质粒
及 0.1ml酵母感受态细胞，votex混匀；加入 0.6ml
PEG/LiAc 溶 液 ， 最 高 速 度 votex 10s 混 匀 ；
200r/min，30,培养 30min，加入 70#lDM SO，轻轻
颠倒混匀；42-热激 15s，冰上放置 1~2m in；
14000r/min离心 5s，弃上清，加入 0.5ml1TE溶液
重悬，取 100$l涂板(Sc-Trp)。 显色：将长出的酵母菌落用扁牙签在 Sc-Trp显 色平板上划线（ 加正负对照），30.培养过夜，观察 显色情况。 32 1.2.4!#$%&’(’在拟南芥成株不同组织中的表达
分别提取拟南芥根、茎、莲座叶、茎出叶、花及
果荚等不同组织的总 RNA（ 方法参见 QIAGEN
RNeasyPlantM iniKit使用手册），反转录合成第一
链 cDNA（ 方法见 Invitrogen 公司的 Superscript
图 1!#$%&’(’基因结构分析 Figure1Analysisof!#$%&’(’ gene’sstructure
First-strand cDNA SynthesisSystem forRT-PCR 试
剂盒使用手册），PCR 反应条件为 94!预变性
1m in，随之 94 30s，58# 30s，72$1min30s，32个 循环，最后 72%延伸 5min，同时设拟南芥 ubiquitin 为对照。 拟南芥TCP家族转录因子!#$%&’(’的转录激活活性鉴定与表达谱分析
CharacterizationofTranscriptionActivityandExpressionProfileof!#$%&’(’ 图 2At2g31070与几个带有保守 TCP domain的典型基因编码的蛋白多序列比对 注：图中黑色表示相似度 100%，深灰色表示相似度 75%，浅灰色表示相似度 50% Figure2AlignmentofAt2g31070withseveraltypicalproteinsequencecontainingTCP conservedomain Note:Blackmeansthesimilarityequals100% ,darkgraymeansthesimilarityequals75% andlightgraymeansthesimilarityequals50% 33 分子植物育种 M olecularPlantBreeding 图 3酵母单杂交实验验证 !#$%&’(’的转录活性。
注:a.阳性对照 )*+, activation domain in pYF503+pG222;b.
阴性对照空载体 inpYF503+pG222;c.阴性对照 ubiquitin in
pYF503+pG222;d.待检测的 !#$%&’(’ in pYF503+pG222;e. !#$%&’(’ in pYF503;f.!#$%&’(’ in pYF503!不带有 )*+, 顺势序列的 pG222。 Figure 3 Yeastone-hybrid technique oftranscription activation propertyof!#$%&’(’
Note:a.)*+, activation domain in pYF503!pG222;b.empty
vectorin pYF503+pG222;c.ubiquitin in pYF503+pG222;d.
!#$%&’(’ in pYF503!pG222;e.!#$%&’(’ in pYF503;f.
!#$%&’(’ inpYF503!pG222without)*+, ciselement. 图 4RT-PCR 检测 !#$%&’(’在不同组织中的表达
注:凝胶浓度为 1.2% ;上排 DNA 片段是 ubiquitin10;下排为
cDNA 扩增得到的目的基因片段。
Figure4 Expression profileof!#$%&’(’ in differenttissuesof adultplant Note:ThePCR fragmentswereseparatedby1.2% gel;theDNA fragmentsintheupperrow wereunbiquitin10;theonesinlower row weretargetgenesamplifiedfrom cDNA. 2结果与讨论 2.1!!#$%&’(’的分子生物学分析
PCR 扩增出 1 098bp大小的片断，测序结果表
明该片断序列与 GenBank所预测的 ORF序列完
全一致，该序列编码一条含有 365个氨基酸残基，
分子量约为 40.4kD 的蛋白（ 见图 1）。序列同源性
分析表明，At2g31070蛋白含有植物 TCP家族特征
保守结构域，该结构域与几种来自于其它物种的带
有 TCP保守区的典型蛋白具有较高的同源性（ 见
图 2），因此该基因应属于拟南芥 TCP转录因子家
族。
2.2酵母单杂实验检测 !#$%&’(’ 的转录激 活活性 将能够表达 !#$%&’(’ 与 GAL4 Binding Do-
main融合蛋白的质粒转入酵母中，在培养基上形成
蓝色菌落（ 如图 3）；同时以 Gal4activationdom ainin
pYF503+pG222作为阳性对照，空 pYF503质粒!
pG222作为阴性对照，证明了 !#$%&’(’ 能够使 )!-,顺式序列调控下的报告基因 -*./得到表达， 亦即 At2g31070蛋白在酵母中具有转录激活活性。 2.3 !#$%&’(’ 在拟南芥成株不同组织中的
表达
以哥伦比亚野生型拟南芥的根、茎、莲座叶、茎
出叶、花和果荚 6种不同组织为模板，用 !#$%&’(’ 特异引物进行 RT-PCR 扩增。电泳结果显示该基因 在花和果荚中表达量明显高于其它组织，在茎中无 表达（ 如图 4）。 结合前人 TCP家族转录因子多在分生组织中 发挥作用的结论，我们估计 !#$%&’(’在拟南芥花
的形成中有比较重要的作用，进一步的实验可以从
两个方面入手：首先可以找到 !#$%&’(’的突变体， 筛选纯合体并观察它的花直至荚与 wild type有无 表型上的明显区别，从而确定该基因在花和生殖器 官形成发育过程中起到什么样的作用；同时，可以 考虑用其它进一步的实验找出与该基因作用的下 游基因，了解它调节花形成发育过程的原理。 此外，亦有报道可用 gateway技术对拟南芥转 录因子进行大规模的克隆(Gong etal.,2004)，该方 法高效且对载体和宿主没有依赖性 (梅文倩等, 2004)，我们正在克隆拟南芥 !0#123240转录因子 家族基因，以便进行蛋白表达和表型分析，细胞定 位以及类似于本文的目的蛋白与其他分子相互作 用等后续研究。 34 参考文献 CubasP.,LauterN .,Doebley J.,and Coen E.,1999,The TCP domain:a motiffound in proteinsregulating plantgrowth anddevelopment,PlantJ.,18(2):215-222 Doebley J.,Stec A.,and Hubbard L.,1997,The evolution of apicaldominanceinmaize,Nature,386:485-488 Gong W .,Shen Y.P.,M a L.G.,Pan Y.,Du Y.L.,W ang D.H., Yang J.Y.,Hu L.D.,Liu X.F.,Dong C.X.,M aL.,Chen Y. H.,YangX.Y.,GaoY.,ZhuD.,TanX.,M uJ.Y.,ZhangD. B.,LiuY.L.,Dinesh-KumarS.P.,LiY.,W angX.P.,Gu H. Y.,Qu L.J.,BaiS.N.,Lu Y.T.,LiJ.Y.,Zhao J.D.,Zuo J., HuangH.,DengX.W .,andZhu Y.X.,2004,Genome-wide ORFeomecloningandanalysisof!#$%&’()%) transcription
factorgenes,PlantPhysiol.,135(2):773-782
KosugiS.,and OhashiY.,1997,*+,- and .+/0 specifically
bind to cis elements in the rice proliferating cellnuclear
antigengene,PlantCell,9(9):1607-1619
KosugiS.,andOhashiY.,2002,DNA bindingand dimerization
specificityand potentialtargetsfortheTCP protein family,
PlantJ.,30(3):337-348
LiJ.J.,and HerskowitzI.,1993,Isolation ofORC 6,a compo-
nentofthe yeastorigin recognition complex by a one-hy-
bridsystem,Science,262(5141):1870-1874
LuoD.,CarpenterR.,CopseyL.,VincentC.,ClarkJ.,andCoen
E.,1999,Controloforgan asymmetryin flowersof123%!
4%256,Cell,99(4):367-376
M eiW .Q.,Song W .Q.,Pan Y.,Gong W .,and Zhu Y.X.,2004,
High throughputcloning of17$%&’()%) transcription fac-
tors using gateway cloning technology, Fenzi Zhiwu
Yuzhong(M olecularPlantBreeding),2(3):358-364(梅文
倩,宋文强,潘怡,巩威,朱玉贤,2004,利用 Gateway克
隆技术大规模克隆拟南芥转录因子,分子植物育种,2
(3):358-364)
Riechmann J.L.,and Ratcliffe O.J.,2000,A genomic perspec-
tiveonplanttranscriptionfactors,Curr.Opin.PlantBiol.,3
(5):423-434
拟南芥TCP家族转录因子13089:;<;的转录激活活性鉴定与表达谱分析
CharacterizationofTranscriptionActivityandExpressionProfileof13089:;<;
生命科学相关的国际学术期刊简介
IntroductiontoSCIJournalforLifeScience
THE PLANT CELL《 植物细胞》(foundedin1989),影响因子 /2003:10.679,单月刊,美国
ThePlantCell(ISSN 1040-4651),whichispublishedmonthly(onevolum eperyear)bytheAm ericanSoci-
etyofPlantBiologists (ASPB),isinits15thyearofpublication.W ithinthreeyearsofitsinitialpublication.The
PlantCellranked firstin impactamong journalspublishing prim aryresearch in theplantsciences.Ithascontin-
uedtom aintainthisstandardofexcellenceeversince.
The PlantCellpublishesnovelresearch ofspecialsignificance in plantbiology,especially in the areasof
cellularbiology,molecularbiology,genetics,developm ent,and evolution.Theprimary criterion forpublication
isnew insightthatisofbroad interestto plantbiologists,notonly to specialists,and the presentation ofresults
mustbeappropriateforawideaudienceofplantbiologists.
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEM Y OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AM ERICA
《 美国科学院汇刊》,（ foundedin1914）,影响因子 /2003:10.272,周刊,美国
ProceedingsOfTheNationalAcadem yOfSciencesOfTheUnitedStatesOfAm erica (PNAS)isoneofthe
world’smost-citedm ultidisciplinaryscientificserials.Sinceitsestablishm entin 1914,itcontinuesto publishcut-
ting-edgeresearchreports,comm entaries,reviews,perspectives,colloquium papers,andactionsoftheAcadem y.
Coverage in PNAS spansthe biological,physical,and socialsciences.PNAS ispublished weekly in print,and
dailyonlineinPNAS EarlyEdition.
PNAS isabstracted and/orindexed in:Index M edicus,PubM ed Central,CurrentContents,M edline,SPIN,
JSTOR,ISIW ebofScience,andBIOSIS.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
35