全 文 ：果 树 学 报 2012，29（4）: 598~604
Journal of Fruit Science
石榴 2种外植体再生方法在遗传
转化研究中的优势比较
陈延惠 1，2，谭 彬 1，2，李洪涛 3，胡青霞 1，2，叶 霞 1，2，孟海军 1，2，冯建灿 1，2*
（1河南农业大学园艺学院，郑州 450002； 2河南省果树瓜类生物学重点实验室，郑州 450015；
3郑州市城市园林科学研究所，郑州 450003）
摘 要: 【目的】为了利用‘突尼斯软籽’石榴开展遗传转化研究，【方法】分别以叶片和茎段为外植体，探讨了不同灭
菌时间和不同植物生长调节物质对 2 种外植体再生的影响，并对 2 种愈伤组织再生体系进行了比较。 【结果】结果表
明，茎段比叶片更容易灭菌，但叶片更容易长出绿色致密愈伤组织并分化更多的不定芽，而茎段分化的愈伤相对较
为疏松，分化的不定芽也相对较少；来自茎段愈伤组织的不定芽比来自叶片的更容易长高；叶片比茎段再生体系建
立所需时间要短；少量翠绿的叶片刀口处可以直接产生不定芽，可以直接利用叶片进行遗传转化的侵染，简化愈伤
形成这一步骤，而茎段未发现此现象。 在遗传转化试验中，茎段和叶片 2 种外植体愈伤组织抗生素敏感性试验结果
均无显著性差异。 【结论】研究结果认为，2 者相比，叶片愈伤组织再生体系更适宜于石榴的遗传转化研究。
关键词: ‘突尼斯软籽’石榴； 再生体系； 遗传转化
中图分类号：S665．4 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)04－0598－07
Comparison of advantages of two kinds of explant regeneration methods
for studies on genetic transformation in pomegranate
CHEN Yan-hui1，2， TAN Bin1，2， LI Hong-tao3，HU Qing-xia1，2， YE Xia1， MENG Hai-jun1，2，FENG Jian-
can1，2*
（1College of Horticulture，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450002 China； 2Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit
Biology，Zhengzhou，Henan 450015 China； 3Zhengzhou Institute of Urban Landscape and Architecture，Zhengzhou， Henan 450003 China）
Abstract: 【Objective】 The leaf and stem segments of ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate were used as the
explants for genetic transformation research. 【Method】 The effects of different sterilization time and dif-
ferent growth regulators on the in vitro leaf and stem segment regeneration were studied， and the advan-
tages of two regeneration systems were compared. 【Results】 The results showed that it was easier for stem
segments to be sterilized than for the leaf， but the green and compact callus from leaves were more likely
to be obtained and then more adventitious buds differentiated. The callus from stem segments were crisp，
and the adventitious buds were less. The adventitious buds from the stem segment callus grew more quick-
ly， but the time consuming of leaf regeneration system was shorter. The adventitious buds could be in-
duced from a few emerald green leaves， which could be used for transformation， but the adventitious buds
could not be induced directly from stem segments.There was not any significant difference between stem
and leaf explants in callus sensitivity to antibiotics. 【Conclusions】 As a result， the leaf callus regeneration
system might be more appropriate for the genetic transformation research of pomegranate.
Key words: ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate； Callus regeneration system； Genetic transformation
石榴 （Punica granatum L.） 为石榴科 （Puni-
caceae）石榴属（Punica）落叶果树，灌木或小乔木 [1]。
作为栽培的只有 1个种，即石榴，在我国已有 2 000 a
的栽培历史[2]。 石榴是集生态、经济、社会效益、观赏
收稿日期： 2012－03－26 接受日期: 2012－05－16
基金项目： 河南省科技攻关项目（072102150001）；郑州市科技攻关项目（083SGYG24123-6）
作者简介： 陈延惠，女，副教授，硕士，研究方向:果树遗传育种。 Tel: 0371-63579623，E-mail: chenyanhui188@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． E-mail: jcfeng@henau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.04.021
与药用价值于一体的优良树种[3]。 石榴耐干旱瘠薄，
花果共赏，同时早果、丰产是一种高效益的栽培果树，
目前，栽培范围遍布南北 20多个省、市、自治区[4]。
‘突尼斯软籽’石榴品种引入河南，历经了多年
的引种栽培和优选， 目前被认为是我省鲜食石榴最
优品种之一。 但是在栽培中发现， 存在着突出的缺
点:生长势弱、不耐寒，在温度较低的年份，很容易受
低温的影响。为了改善‘突尼斯软籽’石榴的不足，获
得抗寒品种， 转基因技术是实现这一目标的快捷途
径。
组织培养再生体系是遗传转化的基础。目前，在
石榴的胚培养研究方面， 研究者最终已经获得了试
管苗[5]。除此之外，石榴的茎段、叶片培养也取得了一
定的进展[6-8]，最终获得了完整的植株，但真正用于遗
传转化研究方面却未见报道。 为此，我们选用‘突尼
斯软籽’石榴叶片和茎段为外植体，研究并筛选适宜
于遗传转化的‘突尼斯软籽’石榴再生体系，为利用
‘突尼斯软籽’石榴开展遗传转化研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
采 4 a 生‘突尼斯软籽’石榴结果树枝条，并置
于人工气候室中培养， 待其发芽后分别采其茎段和
叶片作为外植体材料。
乙酰丁香酮（Acetylic Syringone，AS）购自 San-
gon公司，头孢霉素（Cefotaxime，Cef）购自鼎国生物
公司 ，卡那霉素 （Kanamycinm，Kan）购自 Sigma 公
司，其他主要生化试剂购自 Sigma、Takaya。试验使用
农杆菌菌株 EHA105。
1.2 方法
1.2.1 叶片再生体系的建立 叶片接种与培养。 采
摘叶片经过前处理后，用 0.1%的氯化汞灭菌，灭菌
时间分别设为 2、3、4、5、6、7、8 min 7个处理。叶背朝
下平铺在分化培养基上，利用 NAA 和 BA 不同浓度
组合，BA 设 3 个浓度梯度 0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA
设 3 个浓度梯度 0.1、0.3、0.5 mg·L-1 共设 9 个不同
生长调节物质的处理组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、
Ⅷ、 Ⅸ， 激素组成分别为 : BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1
mg·L-1、BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1、BA 0.5 mg·L-1
+NAA 0.5 mg·L-1、BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、
BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1 L、BA 1.0 mg·L-1+
NAA 0.5 mg·L-1、BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、BA
1.5 mg·L-1+ NAA 0.3 mg·L-1、BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5
mg·L-1，基本培养基为 MS。 先暗处理 2周，后转移到
光下培养，光强 1 500~2 000 lx，光照时间 16 h/d，培
养温度为（25±1）℃，培养条件下同。
不定芽的培养。愈伤组织出现不定芽芽眼后，转
入设置不同激素配比的 MS 培养基，KT 浓度为 1.0
mg·L-1的条件下，NAA 设 3 个浓度梯度 0.1、0.3、0.5
mg·L-1，TDZ设 4 个浓度梯度 0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1。
共 12个不同生长调节物质的处理组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，激素组成分别为: NAA
0.1 mg·L-1+TDZ 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 1.0
mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1+ TDZ 1.5 mg·L-1、NAA 0.1
mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+TDZ 0.5
mg·L -1、NAA 0.3 mg·L -1+TDZ 1.0 mg·L -1、NAA 0.3
mg·L-1+TDZ 1.5 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+ TDZ 2.0
mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1+ TDZ 0.5 mg·L-1、NAA 0.5
mg·L-1 +TDZ 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 1.5
mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1，培养条件如
上。 形成不定芽后， 更换新的激素配比的 MS 培养
基，此培养基保持 KT 浓度 1.0 mg·L-1，BA 设 3 个浓
度梯度 0.1、0.2、0.3 mg·L-1，NAA 设 3 个浓度梯度
0.3、0.5、1.0 mg·L-1， 共 9 个不同生长调节物质的处
理组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ，激素组成分别
为 : BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1、BA 0.1 mg·L-1+
NAA 0.5 mg·L-1、BA 0.1 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1、BA
0.2 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1、BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.5
mg·L-1、BA 0.2 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1、BA 0.3 mg·L-1
+NAA 0.3 mg·L-1、BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1、
BA 0.3 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1， 促使不定芽抽生茎
段和增高。
不定芽抽生茎段的培养。 当增殖芽长到 3.5 cm
时，从茎基部切下，分别放人 1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1
的生根培养基上。 先暗培养 7 d，然后放入光照培养
箱中培养。 再生植株生根和移栽: 将生根 40 d 试管
苗强光下闭瓶炼 15 d，移栽。
1.2.2 茎段再生体系的建立 有以下步骤: 1） 灭菌
方法。 茎段用自来水冲洗 5～10次，用 75％的乙醇浸
泡 30 s，预处理后用 0.1%的氯化汞灭菌，灭菌时间
设置 7个处理，分别为 1、2、3、4、5、6、7 min。
2）茎段接种与愈伤培养。 将灭菌的茎段分别接
种在含有不同质量浓度 NAA 和 TDZ 组成的 MS 培
养基，NAA设 3 个浓度梯度 0.1、0.2、0.3 mg·L-1，TDZ
设 4 个浓度梯度 0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1。 共设 12个
处理组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，
激素组成分别为: NAA 0.1 mg·L-1+ TDZ 0.5 mg·L-1、
NAA 0.1 mg·L-1+ TDZ 1.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1+
陈延惠等: 石榴 2 种外植体再生方法在遗传转化研究中的优势比较4 期 599
果 树 学 报 29 卷
表 1 不同灭菌时间对叶片和茎段的影响
Table 1 Effect of different sterilization time on pomegranate leaf and stem explants
灭菌时间
Sterilization time/min
污染率 Contamination rate/% 褐变率 Browning rate/%
叶片 Leaf 茎段 Stem 叶片 Leaf 茎段 Stem
1
2
3
4
5
6
7
8
-
100 aA
50 bB
15 cC
10 cdCD
5 deCD
0 eD
0 eD
75 aB
50 bB
12 cC
8 bD
5 eE
1
0 fF
-
-
30 eD
35 deCD
38 dC
75 cB
79 cB
95 bA
100 aA
5 gG
7 fF
10 eE
15 dD
50 cC
80 Bb
90 aA
-
注： 表中数字后小写和大写英文字母分别表示 LSR 测验 5%和 1%水平的显著性差异。 下同。
Note: The little and capital English letters indicate the difference in 5% and 1% level，respectively，by LSR test. The same below.
TDZ 1.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1+ TDZ 2.0 mg·L-1、
NAA 0.2 mg·L-1+ TDZ 0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1+
TDZ 1.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1+ TDZ 1.5 mg·L-1、
NAA 0.2 mg·L-1+ TDZ 2.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+
TDZ 0.5 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+ TDZ 1.0 mg·L-1、
NAA 0.3 mg·L-1+ TDZ 1.5 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+
TDZ 2.0 mg·L-1，pH 5.8。 放入光照培养箱中培养，温
度（25±1）℃，光照时间 16h/d，光照强度 15 00~2 000
lx（培养条件下同）。 30 d 后统计茎段增殖愈伤的结
果。 增殖系数=分化愈伤数/接种外植体数。
3） 不定芽的诱导。 愈伤组织出现不定芽芽眼
后， 转入设置不同激素配比的 MS 培养基，KT 浓度
为 1.0 mg·L-1，NAA 设 3 个浓度梯度 0.1 mg·L-1、0.2
mg·L-1、0.3 mg·L-1，TDZ 设 4 个浓度梯度 0.5 mg·L-1、
1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1。 共 12个不同生长
调节物质的处理组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、
Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，激素组成分别为:NAA 0.1 mg·L-1+TDZ
0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 1.0 mg·L-1、NAA 0.1
mg·L -1+TDZ 1.5 mg·L -1、NAA 0.1 mg·L -1+TDZ 2.0
mg·L -1、NAA 0.2 mg·L -1+TDZ 0.5 mg·L -1、NAA 0.2
mg·L -1+TDZ 1.0 mg·L -1、NAA 0.2 mg·L -1+TDZ 1.5
mg·L -1、NAA 0.2 mg·L -1+TDZ 2.0 mg·L -1、NAA 0.3
mg·L -1+TDZ 0.5 mg·L -1、NAA 0.3 mg·L -1+TDZ 1.0
mg·L -1、NAA 0.3 mg·L -1+TDZ 1.5 mg·L -1、NAA 0.3
mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1，培养条件同上。 当形成不定
芽之后， 更换新的激素配比的培养基，NAA 设 3 个
浓度梯度 0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1，KT 设 4
个浓度梯度 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0
mg·L-1， 共 12 个不同生长调节物质的处理组合Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，激素组成分
别为:NAA 0.1 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-
1+KT 1.0 mg·L -1、NAA 0.1 mg·L -1+KT 1.5 mg·L -1、
NAA 0.1 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1+KT
0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、NAA 0.2
mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1、
NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+KT
1.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1、NAA 0.3
mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1，培养条件同上。
4）不定芽抽生茎段的培养。 当愈伤组织增殖芽
长到 3.5 cm 左右时，从茎基部切下，分别放人附加
0.5 mg·L-1 NAA 的 1/2MS（大量元素减半）的生根培
养基上，先暗培养 7 d，后放入光照培养箱中，培养条
件同上。
再生植株生根和移栽。 同叶片再生。
1.2.3 愈伤组织对抗生素敏感性试验 遗传转化培
养基本培养基为 MS， 共培养培养基 : MS+NAA 0.1
mg·L-1+TD Z 1.0 mg·L-1+AS （丁香酮）30 mg·L-1；筛
选培养基 : MS+Cef/Kan+NAA 0.1 mg·L -1+TDZ 1.0
mg·L-1。
1）对卡那霉素敏感性试验。 分别以叶片和茎段
愈伤组织为受体材料，研究其对卡那霉素的敏感性。
卡那霉素浓度梯度设置为 20、40、50、60、80、100
mg·L-1。 其中愈伤组织 26℃，暗培养 14 d，25℃培养
40 d统计愈伤组织颜色、 致密程度以及后期能否分
化成不定芽或芽分化的快慢、多少。
2）对头孢霉素敏感性试验。 分别以叶片和茎段
愈伤组织为受体材料，研究其对头孢霉素的敏感性。
头孢霉素浓度梯度设置为 0、200、400、500、600、800
mg·L-1。 在 26℃暗培养，暗培养 14 d，25℃培养 40 d
后统计愈伤组织颜色、 致密程度以及后期能否分化
成不定芽或芽分化的快慢、多少。
2 结果与分析
2.1 2种外植体愈伤组织再生体系的建立和比较
2.1.1 不同灭菌时间对叶片和茎段外植体灭菌效果
的影响和比较 灭菌后的外植体在培养基上， 叶片
3~7 d 后会出现褐变和污染的情况，而茎段 1～3 d 出
现褐变，3～7 d 出现污染。 从表 1 可以看出: 对于叶
600
4 期
表 2 不同处理对石榴叶片和茎段再生过程各阶段的影响
Table 2 Effects of different treatments on the different regeneration stages of pomegranate leaf and stem explants
处理编号
The codes
of treatment
愈伤组织状态
The state of callus
不定芽再生率
Proliferation rate of
adventitious buds/%
不定芽抽枝状况
Shooting from
adventitious buds
叶片
Leaf
茎段
Stem
叶片
Leaf
茎段
Stem
叶片
Leaf
茎段
Stem
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ
Ⅷ
Ⅸ
Ⅹ
Ⅺ
Ⅻ
少量的绿色愈伤组织
A few virent callus
少量的绿色愈伤组织
A few virent callus
少量绿色致密愈伤组织
A few compact virent callus
少量绿色致密的愈伤组织
A few compact virent callus
大量绿色致密愈伤组织
A lot of compact virent callus
大量绿色致密愈伤组织
A lot of compact virent callus
大量绿色膨大愈伤组织
A lot of swollen virent callus
绿色致密的愈伤组织中
带有黄白色膨大的愈伤组织
Compact virent callus with yellow-
white swollen callus
绿色黄白色愈伤逐渐膨大，出现
水浸状态
Virent and yellow-white callus swell
gradually to be water lixiviation state
少量的绿色愈伤组织
A few virent callus
少量的绿色愈伤组织
A few virent callus
少量绿色致密愈伤组织
A few compact virent callus
少量绿色致密愈伤组织
A few compact virent callus
大量绿色愈伤组织
A lot of compact virent callus
大量绿色致密的愈伤组织
A lot of compact virent callus
大量的绿色致密的愈伤组织
A lot of compact virent callus
大量的绿色致密的愈伤组织
A lot of compact virent callus
绿色愈伤中带有黄白色的愈伤组织
Compact virent callus with yellow-white
callus
黄白色的愈伤组织量较多，逐渐膨大现
象
A lot of yellow-white callus swelled
gradually
大部分黄白色膨大的愈伤组织
A lot of yellow-whitellen callus
大量的黄白色膨大的愈伤组织
A lot of yellow-white ollen callus
35 hG
40 gF
45 fEF
50 eD
46 fDE
67 cB
92 aA
85 bA
51 eD
52 fG
62 eF
59 eF
50 fG
71 dE
90 aA
82 bB
80 bBC
72 dDE
76 cCD
73 cdDF
83 bB
0.2 fF
0.7 dD
1.0 cC
0.2 fF
0.5 eE
2.0 aA
0.2 fF
1.0 cC
1.5 bB
0.2 iH
0.7 gFG
1.0 cE
0.3 iH
1.5 cCD
2.4 aA
1.8 bB
0.5 hGH
1.6 cBC
0.8 fgEF
1.3 dD
0.2 iH
陈延惠等: 石榴 2 种外植体再生方法在遗传转化研究中的优势比较
片， 灭菌 4 min与 5 min的污染率不存在显著差异，
灭菌时间 4 min 与 3 min 的褐变死亡率不存在显著
差异；灭菌 2 min 和 3 min 的褐变率虽低，但是污染
率极高；而灭菌时间 6、7、8 min 的污染率极低，但是
褐变死亡率过高， 其得到的有效愈伤较少。 对于茎
段，灭菌 3 min污染率比 4 min 污染率高，3 min 的褐
变率比 2 min高。 综合污染率和褐变率来看，叶片灭
菌 4 min、茎段灭菌 3 min效果最佳（图版-A，B）。
2.1.2 不同激素配比对叶片和茎段再生愈伤组织的
影响和比较 灭菌后的叶片放入暗培养条件， 叶片
刀口处贴紧培养基，而其他部位向上弯曲，叶片色泽
较亮。 暗培养 2周后，将其转入光培养条件下，叶片
刀口处皱缩卷曲，其他部位膨大，并在叶柄部位及刀
口处产生愈伤组织。 在叶片培养 45 d 后，叶片基本
被愈伤组织覆盖（图版-C~F）。 从表 2 中可以看出，
处理Ⅴ、Ⅵ均可得到大量的绿色致密愈伤组织。一般
来说，绿色致密的愈伤组织能够长出较多的不定芽。
而处理Ⅰ、 Ⅱ得到的是绿色愈伤组织， 其结构不致
密，最终产生不定芽的量较少；处理Ⅲ、Ⅳ得到的绿
色致密愈伤组织的量较少；处理Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ得到的愈
伤组织分化过度，有提前衰老的迹象。 因此，最佳的
处理为Ⅴ、Ⅵ。
而茎段放入光培养条件下，15 d 后茎段上的腋
芽会逐渐萌动开始生长，30 d后， 腋芽开始伸展，并
且茎段底部开始产生愈伤。 将愈伤挑下后继续培养
30 d后，愈伤逐渐长大。从表 2中可以看出:处理Ⅵ、
Ⅶ均能得到大量绿色致密的愈伤组织。 而处理Ⅰ和
Ⅱ只能得到少量的绿色愈伤组织，其结构不致密；处
理Ⅲ和Ⅳ可得到少量的绿色致密愈伤组织； 处理Ⅷ
至Ⅻ得到的是膨大或是黄白色的愈伤组织。因此，最
佳的处理为Ⅵ、Ⅶ。
2.1.3 不同激素配比对叶片和茎段再生不定芽的影
响和比较 叶脉清晰、叶面光亮和色泽翠绿的叶片，
灭菌后，放入暗培养条件下 14 d 后，继续在光培养
条件下培养 30 d 后， 刀口处紧贴培养基的部位，产
生不定芽，而不经过愈伤组织这一中间步骤，这可能
是叶片状况的原因。因此，可以直接利用叶片进行遗
传转化的侵染，简化愈伤形成这一步骤。而在茎段上
未发现此现象。
2.1.4 不同生长调节剂配比对愈伤再生不定芽的影
601
果 树 学 报 29 卷
表 3 愈伤组织在不同浓度卡那霉素中的状态
Table 3 The state of pomegranate callus in the different concentrations of Kan
卡那霉素浓度
The concentrations
of Kan/(mg·L-1)
愈伤组织 30 d 后的生长状态 The growing state of callus after 30 d
叶片 Leaf 茎段 Stem
20
40
50
60
80
100
愈伤组织生长减缓，但不影响其继续发芽
Callus grew slowly, but could differentiate adventitious buds
愈伤组织逐渐由绿变黄，稍褐化，分化成芽较慢
Callus gradually changed from green to yellow with browning，
and differentiated adventitious buds slowly
愈伤组织部分褐化，不再分化成芽
Part of the callus became brown，and stopped differentiation
愈伤组织 50%褐化，不分化成芽
50% callus became brown and stopped to differentiation
愈伤组织 80%褐化，逐渐死亡
80% callus became brown and died gradually
愈伤组织 100%褐化，全部死亡
All of callus became brown and died
愈伤组织生长减缓，但不影响其继续发芽
Callus grew slowly, but could differentiate adventitious buds
愈伤组织逐渐由绿变黄，稍褐化，分化成芽较慢
Callus gradually changed from green to yellow with
browning，and differentiated adventitious buds slowly
愈伤组织逐渐褐化，不再分化成芽
Part of the callus became brown，stopped differentiation
愈伤组织 60%褐化，不分化成芽
60% callus became brown and stopped to differentiation
愈伤组织 90%褐化，逐渐死亡
90% callus became brown and died gradually
愈伤组织 100%褐化，全部死亡
All of callus became brown and died
响和比较 当叶片转化成愈伤组织之后， 愈伤组织
继续培养约 30 d 后，在紧实的愈伤组织上面会出现
绿色的芽眼，之后会长出绿色的小叶片。不定芽继续
培养约 30 d 后，绿色的小叶片逐渐长成簇生的不定
芽。 从表 2 中可以看出: 在 5%水平上，处理Ⅶ与处
理Ⅷ存在显著性差异，而在 1%水平上，处理Ⅶ与处
理Ⅷ无显著性差异。从节省药品的角度考虑，处理Ⅶ
的用量较小，有可以达到效果，所以处理Ⅶ最好，其
再生不定芽诱导率可达 92%。 处理Ⅰ效果最差，与
处理Ⅱ存在着显著性差异。
当茎段转化成愈伤组织之后， 同样将愈伤组织
转接到新培养基上培养，大约 30 d 后，在翠绿的愈
伤组织上面也会出现绿色的芽眼， 之后会长出绿色
的小叶片。 不定芽继续培养 30 d 后，绿色的小叶片
会逐渐抽生不定芽。从表 2中可以看出:处理Ⅵ的效
果最佳，并且与处理Ⅻ存在显著性差异；处理Ⅶ和Ⅻ
效果其次，并且 2者无明显差异；处理Ⅳ和Ⅰ效果最
差，2者差异不显著。
2.1.5 不同激素配比对不定芽抽生茎段的影响和比
较 当叶片形成了不定芽之后， 将其转入新的培养
基中，逐渐开始抽生茎段（图版-G~K）。其中，处理Ⅵ
效果最佳，在 5%和 1%水平上，均与处理Ⅸ存在显
著差异；处理Ⅰ和Ⅶ效果最差，且与处理Ⅴ存在显著
差异。
而当茎段诱导形成不定芽之后， 将其转入新的
培养基中。 如表 2所示，处理Ⅵ效果最好，茎段可达
2.4 cm，并且与处理Ⅶ存在显著性差异；而处理Ⅰ和
Ⅳ效果最差，且 2者之间无显著性差异。
不定芽的生长状况主要取决于激素的浓度和配
比，当 NAA 的浓度过低时，茎段的伸长就会受影响，
但是浓度过高，就会抑制生长；当 KT 浓度过低时，
茎段的状态就比较瘦弱。 只有当 KT浓度合适，茎段
才能正常生长。
2.1.6 生根移栽 叶片和茎段再生体系抽生的幼梢
转入生根培养基 1/2MS+NAA0.5 mg·L-1中， 生根率
均可达 100%，移栽存活率分别为 85%和 83%，叶片
和茎段愈伤组织再生体系的生根率和移栽率均无显
著性差异（图版-L~N）。
通过以上比较可以看出， 叶片的灭菌时间比茎
段长，因为茎段比叶片更容易灭菌；从愈伤的再生状
况可以看出，叶片易长出绿色致密愈伤组织，但茎段
分化的愈伤相对较为疏松， 这对不定芽的分化有影
响，致密的愈伤组织会分化更多的不定芽，但是疏松
愈伤分化的不定芽相对较少； 从不定芽再生状况看
来，叶片可以不经愈伤阶段直接分化不定芽，但茎段
比叶片更容易长出高的茎段；再生体系的时间相比，
叶片比茎段再生所用时间要稍短。综合来看，叶片再
生体系的时间比茎段再生体系的时间要短， 而且叶
片刀口处还具有直接产生不定芽能力。因此，试验研
究结果认为， 用叶片作为石榴遗传转化的外植体效
果比茎段好。
2.2 愈伤组织对抗生素的敏感性
2.2.1 对卡那霉素的敏感性 本试验中利用叶片和
茎段两种外植体的愈伤组织进行卡那霉素的敏感性
评价，结果基本表现一致（表 3）。 Kan 在 50 mg·L-1
的时候，愈伤组织分化受到明显抑制，而且愈伤组
织逐渐变成黄褐色；质量浓度高于 50 mg·L-1，愈伤
组织会出现褐化死亡现象。 因此， 适宜筛选浓度为
50 mg·L-1。
2.2.2 对头孢霉素的敏感性 以石榴叶片和茎段愈
伤组织为试材， 分析了头孢霉素抑菌的有效浓度，2
种愈伤组织显示结果一致（表 4）: 2种愈伤组织经过
602
4 期
头孢霉素浓度
The concentrations
of Cef/(mg·L-1)
愈伤组织 30 d 后的状态 The growing state of callus after 30 d
叶片 Leaf 茎段 Stem
200
400
500
600
800
1000
愈伤组织生长良好，分化成芽不受影响
Callus grew normally，and could differentiate adventitious buds
愈伤组织生长稍缓，稍变黄，不定芽分化稍慢
Callus grew slowly,became yellow，and differentiated
adventitious buds slowly
愈伤组织生长慢，依然可以分化成不定芽
Callus grew slowly，and could differentiate adventitious buds
愈伤组织逐渐变黄，不定芽分化迟缓
Callus slowly turn yellow，and differentiated adventitious buds slowly
愈伤组织 30%褐化，不再分化不定芽
30% of callus became brown,stopped differentiation
愈伤组织 50%褐化，逐渐出现坏死
50% of callus became brown and died
愈伤组织生长良好，分化成芽不受影响
Callus grew normally，and could differentiate adventitious
buds
愈伤组织生长稍缓，稍变黄，不定芽分化稍慢
Callus grew slowly， became yellow， and differentiated
adventitious buds slowly
愈伤组织生长慢，依然可以分化成不定芽
Callus grew slowly， and could differentiate adventitious
buds
愈伤组织逐渐变黄，不定芽分化迟缓
Callus slowly became yellow， anddifferentiated adventitious
buds slowly
愈伤组织 40%褐化，不再分化不定芽
40% of callus became brown and stopped differentiation
愈伤组织 50%褐化，逐渐出现坏死
50% of callus became brown and died
表 4 愈伤组织对不同浓度头孢霉素的反应
Table 4 The state of pomegranate callus in the different concentrations of Cef.
陈延惠等: 石榴 2 种外植体再生方法在遗传转化研究中的优势比较
30 d培养后新愈伤组织生长团数无明显规律， 并且
Cef质量浓度为 500 mg·L-1时，可以有效地抑制菌体
的生长，并且外植体的正常分化不受影响。当 Cef质
量浓度低于 500 mg·L-1时，菌体的生长过旺，影响了
植物体的正常生长，最终使植物体受到干扰而死亡。
当 Cef 质量浓度高于 500 mg·L-1时， 菌体的生长可
以被抑制，但植物体的正常分化受到影响。该结果表
明，适宜 Cef筛选浓度为 500 mg·L-1。
3 讨 论
（1）组织培养中灭菌时间与外植体的状态有很
大关系。 在技术研究中，张晓申等 [9]的研究表明，石
榴组培快繁的最佳叶片外植体杀菌时间为 70%酒
精 30 s，0.1%的 HgCl2 2.5 min。 本试验中 0.1% HgCl2
灭菌时间为 4~5 min。可能是因为本试验中外植体在
采样时间、地块受外界的影响较大，污染程度较高。
（2） 在石榴组织培养中， 所用的激素主要有
NAA 和 6-BA。 矮化石榴‘nana’的离体叶片分化愈
伤组织和愈伤组织增殖过程中，主要的激素是 NAA
和 6-BA，质量浓度均为 0.5 mg·L-1 [10]；在矮化石榴品
种‘Issaizakuro’的叶片再生愈伤组织过程中，添加激
素为 6-BA 5.0 mg·L-1 和 NAA 0.5 mg·L-1[11]；同样是
矮化石榴品种‘nana’，外植体是组培苗的叶片，其再生
愈伤组织的激素为 1.0 mg·L-1 6-BA 和 1.0 mg·L-1
NAA[11]，而在品种‘worderful’的叶片再生愈伤的过程
中，仅使用 1.0 mg·L-1 6-BA[12]；张晓申等 [9]的研究中
指出， 突尼斯软籽石榴适宜的启动培养基激素为
6-BA 0.6 mg·L-1和 NAA 0.1 mg·L-1。在本实验中，离
体叶片再生愈伤组织的最佳激素组合是 NAA 0.3
mg·L-1和 6-BA 1.0 mg·L-1； 而不定芽最佳分化培养
基为 NAA 0.3 mg·L-1+TDZ 1.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1，
茎段增高的最佳培养基为 NAA 1.0 mg·L-1+BA 0.2
mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。在生根阶段，本试验研究结果
与文献报道相符，均用的为 MS 培养基，添加一定浓
度的 NAA。
本试验的激素种类中有 TDZ， 而在相关的文献
中，没有用到 TDZ。 然而 TDZ 在本试验中的诱导不
定芽的分化效果非常明显。
（3） 在茎段再生愈伤组织过程中， 相关文献报
道 ， 茎段增殖和不定芽分化的培养基为 MS 和
WPM， 生根培养基主要为 1/2MS [11]， 激素主要为
NAA、KT 和 6-BA；本试验中增殖培养基为 MS 培养
基， 生根培养基 1/2MS， 激素主要为 NAA、KT 和
TDZ，效果很好。
（4）本试验虽然能诱导出石榴再生芽，但是从接
种叶片到再生芽长到 2~4 cm，约 2.5 个月左右，与其
他果树比较历时较长。 王艳等[13]在苹果砧木罗 6 和
株美海棠的再生研究中认为， 一般叶片接种 1 个月
后能明显的看到分化的单芽和芽丛， 这可能与基因
型有关。 本试验从叶片到形成愈伤组织的过程比较
正常，但是愈伤组织分化出芽眼到芽的过程，前期愈
伤组织形态变化不大， 经历的时间较长约 1 个月左
右。 在进一步试验中，可以具体从叶片基因型、细胞
分裂素种类或者采用两步法 （先在诱导愈伤组织培
养基上培养，然后转至诱导分化培养基上培养）等方
面考虑， 缩短石榴叶片再生时间， 建立高频再生体
系。
（5）果树对抗生素的敏感性试验中，苹果和枣
603
的合适的卡那霉素的筛选浓度为和 20 mg·L-1 左
右 [14-15]。 而在‘nana’侏儒型石榴中，其愈伤组织卡那
霉素的筛选浓度为 50 mg·L-1 [16]，本实验与之相符。
这也从一定程度上说明石榴对卡那霉素的敏感性不
强。但是在文献报道中，合适的头孢霉素浓度为 400
mg·L-1 [16]，而在本试验中为 500 mg·L-1。 可能是因为
品种不同，而有所差异。 并且一般试验中，卡纳霉素
的敏感性试验在植物的各个生长阶段均有筛选，但
是在侏儒型石榴‘nana’的研究中，卡纳和头孢霉素
的敏感性试验也仅在愈伤组织中做了检验， 但是这
个浓度适用于愈伤组织分化的各个阶段。
4 结 论
‘突尼斯软籽’石榴外植体愈伤组织再生体系相
对比，叶片在遗产转化研究中优越性更强。 首先，茎
段虽然比叶片更容易灭菌， 但叶片更容易长出绿色
致密愈伤组织并分化更多的不定芽；其次，虽然来自
茎段愈伤组织的不定芽更容易长高， 但叶片再生体
系建立所需时间更短， 叶片还有直接产生不定芽的
机会， 且 2种来源的愈伤组织抗生素敏感性实验结
果无显著性差异。因此本研究结果认为，叶片愈伤组
织再生体系更适宜于石榴的遗传转化研究。（本文图
版见封底）
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