全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 563569 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30870142和 30400022)和华中师范大学中央高校基本科研业务费(120002040249)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 许文亮, E-mail: wenliangxu@yahoo.com.cn, Tel: 027-67867814
第一作者联系方式: E-mail: zj270989057@163.com
Received(收稿日期): 2012-07-10; Accepted(接受日期): 2012-10-09; Published online(网络出版日期): 2012-12-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121211.1708.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00563
异源表达棉花 GhPRP5 基因增强了拟南芥对盐和 ABA 的敏感性
张德静 秦丽霞 李 龙 饶 玥 李学宝 许文亮*
华中师范大学生命科学学院 / 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室, 湖北武汉 430079
摘 要: 富含脯氨酸的蛋白(proline-rich proteins, PRPs)代表一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白质, 最先
在伤害诱导的胡萝卜贮藏根中被发现。越来越多的证据显示这类蛋白在应答多种生物和非生物胁迫中起作用。我们
之前从棉花 cDNA文库中分离了一个命名为 GhPRP5的编码富含脯氨酸蛋白的基因, 为研究其功能, 构建了 GhPRP5
的过量表达载体, 转化拟南芥, 获得 GhPRP5高表达的 8个株系的纯合体。在正常培养条件下, 转基因株系和野生型
种子的萌发率一致, 但盐胁迫和 ABA处理显著抑制了转基因拟南芥株系种子的萌发。盐胁迫条件下野生型的绿苗率
明显高于转基因拟南芥株系 , 与正常生长条件相比 , ABA 处理抑制转基因拟南芥主根伸长的程度更大。利用
Quantitative RT-PCR技术分析几个胁迫相关标记基因的表达情况表明, 盐和 ABA诱导了 RD29A、RD29B和 KIN1的
表达, 但诱导水平在转基因株系和野生型中不一样, 说明 GhPRP5 参与调控拟南芥胁迫相关标记基因的表达, 但具
体参与的胁迫应答信号传导途径仍需进一步研究。
关键词: 棉花 GhPRP5; 转基因拟南芥; 盐胁迫; ABA
Expression of Cotton GhPRP5 Gene in Arabidopsis Enhances Susceptibility to
ABA and Salt Stresses
ZHANG De-Jing, QIN Li-Xia, LI Long, RAO Yue, LI Xue-Bao, and XU Wen-Liang*
Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology / College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079,
China
Abstract: Pro-rich proteins (PRPs) represent one family of Pro- and Hyp-rich structural cell wall proteins that are initially identi-
fied as wound-induced gene products in carrot storage roots. Accumulated evidences demonstrate that PRP genes are regulated by
various abiotic and biotic stresses and may play a role in plant responses to changes in living conditions. In our previous study, a
gene encoding a proline-rich protein designated as GhPRP5 was isolated from cotton cDNA libraries. To validate its function, in
this study, we introduced the coding region of GhPRP5 into the vector pBI121 under the control of the CaMV 35S promoter and
then transformed the vector into Arabidopsis thaliana. Eight independent T4 homozygous lines with high expression of GhPRP5
were obtained. Germination rate of transgenic lines overexpressing GhPRP5 was not affected under normal conditions; however,
salt stress and ABA significantly inhibited the germination of the transgenic lines. When growing on media with NaCl, the
GhPRP5-overexpressed plants displayed much less cotyledon greening rate compared with the wild type. In contrast to the normal
growth conditions, ABA inhibited the elongation of primary root more severely in the transgenic lines. Quantitative RT-PCR tech-
nique was used to analyze the transcription of several stress gene markers (RD29A, RD29B, KIN1, and ABI1) in the transgenic
lines and the wild type plants under salt stress and ABA treatments. Expressions of RD29A, RD29B, and KIN1 were induced by
ABA and NaCl in the transgenic and the wild type plants, though the induction levels in the transgenic lines were different from
those in the wild type. This finding suggests that GhPRP5 is implicated in the regulation of stress gene expression in Arabidopsis.
The plant stress signal transduction pathway in which GhPRP5 may be involved needs to be further studied.
Keywords: GhPRP5; Transgenic Arabidopsis; Salt stress; ABA
富含脯氨酸的蛋白(proline-rich proteins, PRPs)代表
一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白质, 被认
为在建造围绕特定细胞型的初生壁结构方面起作用。它们
最先在胡萝卜贮藏根中被发现, 并认为是伤害诱导的基
564 作 物 学 报 第 39卷
因产物 [1], 后来的研究显示它们存在于多种植物的多个
组织中, 在植物生长和发育过程中的表达受到时空的调
节。例如, 在大豆中至少找到 3个 PRP基因, SbPRP在大
豆幼苗的上胚轴和叶子中表达, 在下胚轴、子叶和根中没
有表达[2-3]。油菜 SAC51 只在豆荚裂开区特异表达[4]。菜
豆 PVR5在根顶端高效表达, 离顶端越远, 表达量越少[5]。
玉米 ZmPRP mRNA在木质部和其周围细胞及表皮中积聚,
在韧皮部中则没有表达[6]。马铃薯 StGCPRP 在保卫细胞
中高量表达 , 而在叶肉和根中表达量很低 [7]。拟南芥
AtPRP3 只在根毛中表达, 沉积在活跃生长的根毛顶端的
细胞壁上, AtPRP4在成熟的保卫细胞中表达[8-9]。上述研
究表明这类蛋白在多种植物中表达, 具有组织特异性并
受发育阶段调控。越来越多的研究也表明这类蛋白质在应
答多种生物和非生物胁迫, 如伤害、干旱、盐、冷、ABA
和病原菌等的侵扰时 , 表达上调或下调。如矮牵牛
MsPRP2在根中特异表达, 盐胁迫下其表达上调[10]; 低温
诱导油菜 BnPRP 的表达, 而其他非生物胁迫如高温, 干
旱和伤害未影响表达 [11]。在大豆中, 干旱和盐胁迫诱导
SbPRP 的表达, 而 ABA、激动素和茉莉酸甲酯抑制其表
达[12]。利用生物信息学的方法, Showalter 等[13]在拟南芥
中识别了 18个 PRP基因, 其中的 8个基因(PRP1、PRP2、
PRP3、PRP4、PRP8、PRP9、PRP10 和 PRP15)在 ABA
处理时表达下调, 而 PRP6和 PRP14在 ABA处理时表达
上调。此外, 3个 PRP 基因(PRP2、PRP3和 PRP11)在玉
米素处理时表达上调, 线虫感染诱导了 PRP4、PRP11 和
PRP16 的表达, 而假单胞菌感染诱导了 PRP9 和 PRP10
的表达。近来的研究显示水稻 OsPRP3在冷胁迫时大量积
累, 过量表达 OsPRP3增强了水稻对冷胁迫的耐受性[14]。
EARLI1 编码 1 个杂合的 PRP 蛋白, 过量表达 EARLI1 的
拟南芥在萌发时期对外源ABA更敏感, 过量表达 EARLI1
的酵母在冷处理时存活率增加[15-16]。上述研究结果显示
富含脯氨酸的蛋白在应答不同的非生物和生物胁迫中发
挥重要作用。
棉花的生长和发育过程经常受到高盐、干旱等非生
物胁迫因素的影响, 导致产量的降低。Feng等[17]从快速
生长的棉纤维中利用抑制差显杂交的方法分离了 6 个
PRP 基因, 我们之前也从棉花 cDNA 文库中分离了 5 个
PRP 基因[18-19]。但到目前为止, 对这些 PRP 基因的功能
还未见报道。GhPRP5编码一个典型两结构域的富含脯氨
酸的蛋白质 [18-19], 为研究其在植物逆境应答中可能的功
能, 本研究构建了 GhPRP5 的过量表达载体, 转化拟南芥,
结果显示表达异源 GhPRP5 的转基因拟南芥增强了对盐
和 ABA的敏感性。
1 材料与方法
1.1 植物材料
拟南芥 (Arabidopsis thaliana, 生态型 Columbia) 种
子经 70%的乙醇表面灭菌 1 min, 吸除乙醇, 加入 1 mL无
菌水冲洗一次, 再加入 10%的 NaClO溶液处理 5 min, 吸
除 NaClO 溶液, 用无菌水冲洗 4 遍。将无菌的拟南芥种
子铺在正常的 0.5MS培养基上(0.5MS, 10 g L–1蔗糖, pH
5.8), 4℃处理 3 d, 然后移至植物生长培养箱中(Sanyo)水
平培养(16 h光照, 8 h黑暗, 22±1℃), 生长 1周后, 将拟南
芥幼苗种在直径为 15 cm的花盆中, 于培养室(16 h光照,
8 h黑暗, 22±1℃)中培养。
1.2 GhPRP5过量表达载体构建与拟南芥转化
GhPRP5的 cDNA全长片段经 pfu酶扩增获得, 引物
序列见表 1, 在两条引物的 5端和 3端分别引入 BamH I
和 Sac I 酶切位点。将 PCR 产物克隆到 pBluescript 质粒
中, 测序验证后利用 BamH I和 Sac I两个酶切位点将其导
入 pBI121载体, 转化农杆菌 GV3101, 然后利用浸花法转
化拟南芥[20]。将收获的种子铺在含有 50 μg mL–1卡那霉
素的 0.5 MS培养基(10 g L–1蔗糖, pH 5.8)上进行筛选培养,
选取 T4代的纯合体转基因株系进行分析。
1.3 RNA 提取和半定量 RT-PCR 分析拟南芥株系中
GhPRP5基因的表达
将灭菌后的野生型拟南芥和 T4代过量表达 GhPRP5
的转基因拟南芥纯合体的种子铺在 0.5 MS培养基上, 4℃
低温处理 3 d后, 于光照培养箱生长 2周。使用 RNA-Solv
Reagent (Omega)提取 T4 代幼苗的总 RNA, 经 DNase
(RQ1 RNase-Free DNase, Promega)消化干净残留的基因
组 DNA 后, 用逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase,
Promega)合成 cDNA。以拟南芥的 Actin2 基因作为内参,
用 GhPRP5 的特异引物进行 RT-PCR 分析(表 1), PCR 程
序为 94 5 min; 94 1 min, 58 1 min, 72 30 s, 28℃ ℃ ℃ ℃ 个
循环; 72 10 min, ℃ 最后 4℃保温。实验重复 3次。
1.4 萌发分析
将同一时间种植和收获的野生型拟南芥和 T4代过量
表达 GhPRP5的转基因拟南芥 2个株系种子在 4℃存放 1
个月后, 经灭菌处理, 铺在 0.5 MS及分别含有 150 mmol
L–1 NaCl、0.5 μmol L–1 ABA的 0.5 MS培养基上, 4℃低温
处理 3 d后, 转移至植物生长培养箱中培养。生长 7 d后,
统计萌发率, 将 2 片子叶均变成绿色的小苗定义为萌发
苗。每个株系每次统计约 300颗种子, 试验重复 3次, 统
计分析实验结果。
1.5 根长分析
采用 Zhu 等[21]的方法分析根长。将灭菌后的野生型
拟南芥和 T4代过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥 2 个株
系种子铺在 0.5 MS培养基上, 4℃低温处理 3 d后, 于正常
光照培养箱培养 48 h, 选择萌发一致的种子转移至 0.5
MS及分别含有 150 mmol L–1 NaCl、1.0 μmol L–1 ABA的
0.5 MS培养基上进行垂直培养。幼苗生长 9 d后, 用尺子
测量拟南芥主根的长度, 计算转基因拟南芥主根长度相
对于该处理下野生型主根长度的百分比; 统计含有 150
mmol L–1 NaCl的 0.5 MS培养基上的绿苗数目, 计算绿苗
率。每个株系每次统计约 100棵幼苗的根长, 试验重复 3
第 3期 张德静等: 异源表达棉花 GhPRP5基因增强了拟南芥对盐和 ABA的敏感性 565
次, 统计分析实验结果。
1.6 胁迫相关标记基因在转基因拟南芥幼苗中表达分析
按照 Li等[22]的方法, 将灭菌后的野生型拟南芥和 T4
代过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥 2 个株系种子铺在
0.5MS培养基上, 4℃低温处理 3 d, 于植物生长培养箱中
培养 2周后, 将幼苗转移至分别含有 150 mmol L–1 NaCl、
100 μmol L–1 ABA的 0.5 MS液体培养基以及 0.5 MS液体
培养基处理 6 h, 收取幼苗材料。用 RNA-Solv Reagent
(Omega)提取幼苗总 RNA, 经 DNase (RQ1 RNase-Free
DNase, Promega)消化后 , 用逆转录酶 (M-MLV Reverse
Transcriptase, Promega)合成 cDNA。应用实时荧光定量
RT-PCR技术(MJ Research, Opticon 2), 以 cDNA为模板,
用基因特异性引物(表 1)和 Real-time PCR Master Mix
(TOYOBO)进行 PCR 反应。以拟南芥的 Actin2 作为内参
基因, 目标基因每一个循环的扩增都被 SYBR-Green荧光
检测, 具体步骤及分析参照 Li等[23]的方法, 重复 3次, 统
计分析实验结果。
2 结果与分析
2.1 转基因拟南芥中 GhPRP5的表达
为研究 GhPRP5 的功能, 我们构建了 GhPRP5 的过
量表达载体, 并转化拟南芥, 获得 8 个株系的纯合体, 这
8 个株系都检测到 GhPRP5 的表达, L4-1、L7-2 和 L11-1
株系的表达量很高 (图 1), 选择表达量最高的 L7-2 和
L11-1用于后续实验分析。
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
基因名
Gene name
引物
Primer (5–3)
F: CTTGGATCCATGGGGGAGAAGGTGACGATA
R: CTTGAGCTCTTACATGACTGAGCATTGTGG
F: TGAAAGGAGGAGGAGGAATGGTTGG
R: ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT
F: CCAGATAGCGGAGGGGAAAGGACAT
R: AAGTTCACAAACAGAGGCATCATAC
F: ACCAACAAGAATGCCTTCCAAGC
R: TCCCAACAGTTAATTAGAAAAGG
F: TCAAGAGCAAACCCTTGAACTG
R: TGCATATTACAATTAGCCCGGGAAG
F: GAAATCACAGCACTTGCACC
R: AAGCCTTTGATCTTGAGAGC
图 1 GhPRP5 在野生型和转基因拟南芥株系中的表达分析
Fig. 1 Expression analysis of GhPRP5 in wild type and transgenic Arabidopsis lines
WT: 野生型; L2-1、L3-1、L4-1、L7-2、L8-2、L9-2、L10-1和 L11-1: 不同转基因株系; Actin2: 内参基因, 重复 2次得到相似结果。
WT: wild type; L2-1, L3-1, L4-1, L7-2, L8-2, L9-2, L10-1, and L11-1: different transgenic lines; Actin2: internal control.
2.2 过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥增强了对盐和
ABA的敏感性
我们之前的研究表明尽管过量表达 GhPRP5 的转基
因拟南芥幼苗矮小, 但是在正常 0.5MS 培养基上野生型
与转基因拟南芥萌发率之间并没有差异 (图 2-A 和图
3-A)。为了检测 GhPRP5在植物逆境应答中的作用, 将野
生型和转基因种子铺在含有 150 mmol L–1 NaCl的 0.5MS
培养基上生长 7 d, 统计萌发率, 发现野生型的萌发率仍
将近 99%, 转基因拟南芥的萌发率则明显降低, L7-2 和
L11-1都只有 60% (图 2-B和图 3-B)。为了进一步分析过
量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥在幼苗生长时期对盐胁
迫的抗性, 统计了在含有 150 mmol L–1 NaCl的 0.5 MS培
养基上垂直培养 9 d的野生型和转基因株系的绿苗率, 结
果显示, 150 mmol L–1 NaCl胁迫严重抑制了转基因株系
的根生长 , 主根长度可以忽略不计 , 而且许多幼苗白化
死亡, 转基因拟南芥 L7-2 和 L11-1 的绿苗率分别约为
38%和 16%, 野生型的绿苗率则达到了 67%, 二者差异显
著, 说明过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥幼苗增强了
对盐胁迫的敏感性(图 4-C和图 5-C)。
为研究 GhPRP5对 ABA的应答, 将野生型和转基因
拟南芥种子铺在含有 0.5 μmol L–1 ABA的 0.5MS培养基
上萌发生长 7 d 后, 统计萌发率, 结果显示, 转基因拟南
芥 L7-2和 L11-1的萌发受到严重抑制, 都只有 25%左右,
而野生型萌发率达 98% (图 2-C和图 3-C)。为进一步弄清
是否过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥幼苗也增强了对
ABA的敏感性, 测量了在含有 1.0 μmol L–1 ABA的 0.5 MS
培养基上生长 9 d的野生型和转基因株系的主根根长。图
5-A和 B结果显示, 转基因拟南芥主根根长占野生型主根
根长的百分比, L7-2和 L11-1分别为 45%和 20%, 比正常
0.5 MS 培养基上 70%和 33%小得多, 说明转基因拟南芥
主根生长受抑制的程度更大。以上结果表明, 过量表达
GhPRP5的转基因拟南芥对 ABA更敏感。
GhPRP5
(EF095706)
RD29A
(At5g52310)
RD29B
(At5g52300)
KIN1
(At5g15960)
ABI1
(At4g26080)
AtActin2
(AT3G18780)
566 作 物 学 报 第 39卷
图 2 过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥种子在盐和 ABA 处理时的萌发
Fig. 2 Seed germination of wild type and transgenic Arabidopsis lines under ABA and salt stresses
在 4℃层积处理 3 d的种子在 0.5 MS培养基(A)和分别含有 150 mmol L–1 NaCl (B)、0.5 μmol L–1 ABA (C)的 0.5 MS培养基上培养 7 d的萌发情况。
Seeds of wild type and transgenic lines stratified at 4℃ for three days germinated in half-strength MS-agar plates (A) or supplemented with 150 mmol
L–1 NaCl (B), 0.5 μmol L–1 ABA (C). The plates were put into a plant growth incubator for seven days.
图 3 过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥在盐和 ABA 处理时的种子萌发率
Fig. 3 Germination rates of wild type and transgenic Arabidopsis lines under ABA and salt stresses
在 0.5MS培养基(A)和分别含有 150 mmol L–1 NaCl (B)、0.5 μmol L–1 ABA (C)的 0.5 MS培养基上培养 7 d后, 统计萌发率, 误差线表示±SD,
n>300 (柱子上大写字母不同显示极显著差异, P <0.01), 重复 3次。
Seeds of wild type and transgenic lines germinated in half-strength MS-agar plates (A) or supplemented with 150 mmol L–1 NaCl (B), 0.5 μmol L–1
ABA (C), after stratification at 4℃ for three days. The plates were put into a plant growth incubator for seven days. Germination rate was measured.
Error bars represent ±SD, n>300. Bars with different letter designations are significantly different, at the 0.01 probability level.
图 4 过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥幼苗对盐和 ABA 的应答
Fig. 4 Vegetative growth of wild type and transgenic Arabidopsis lines under ABA and salt stresses
将 0.5MS上萌发生长 48 h后的小苗转移至 0.5 MS培养基(A)及含有 1.0 μmol L–1 ABA (B)、150 mmol L–1 NaCl (C)的 0.5 MS培养基上垂直生
长 9 d的幼苗形态。
Seeds of wild type and transgenic lines were sown on half-strength MS-agar plates. After stratification at 4℃ for three days, the plates were put into a
plant growth incubator for two days; the germinated seeds were transferred to half-strength MS-agar plates (A) or supplemented with 1 μmol L–1 ABA
(B), 150 mmol L–1 NaCl (C). The plates were placed in vertical position in the same plant growth incubator for another nine days.
第 3期 张德静等: 异源表达棉花 GhPRP5基因增强了拟南芥对盐和 ABA的敏感性 567
图 5 过量表达 GhPRP5 的转基因拟南芥幼苗对盐和 ABA 的应答
Fig. 5 Analysis of vegetative growth of wild type and transgenic Arabidopsis lines under ABA and salt stresses
将 0.5 MS上萌发生长 48 h后的小苗转移至 0.5 MS培养基(A)及含有 1.0 μmol L–1 ABA (B)、150 mmol L–1 NaCl (C)的 0.5 MS培养基上垂直生
长 9 d, 统计含 1.0 μmol L–1 ABA的 0.5 MS培养基以及 0.5MS培养基上主根长度, 计算转基因拟南芥主根长度相对于该处理下野生型主根长
度的百分比(A、B); 统计含有 150 mmol L–1 NaCl培养基上的绿苗数目, 计算绿苗率(C)。误差棒表示±标准差, n>100。柱子上大写字母不同显
示差异极显著, P <0.01, 重复 3次。
Seeds of wild type and transgenic lines were sown on half-strength MS-agar plates. After stratification at 4℃ for three days, the plates were put into a
plant growth incubator for two days, then the germinated seedlings were transferred to half-strength MS-agar plates (A) or supplemented with 1 μmol
L–1 ABA (B), 150 mmol L–1 NaCl (C). The plates were placed in vertical position in the same plant growth incubator for another nine days, the primary
root length was measured (A, B), green seedlings were also counted (C). Error bars represent ±SD, n>100.
2.3 胁迫相关的标记基因的表达分析
图 6所示, RD29A基因在盐胁迫和 ABA处理后, 不论
是在野生型还是过量表达株系中的表达都出现了上调, 但
在过量表达株系中上调的程度不如对照中显著。RD29B 在
ABA 处理后, 在过量表达株系中上调的程度与野生型相比
呈显著性差异, 盐胁迫诱导基因表达的程度在野生型和过
量表达株系中类似, 而对 KIN1基因而言, 与 RD29B的表达
谱正好相反。KIN1 在盐胁迫处理后, 在过量表达株系中上
调的程度与野生型相比呈显著性差异, 在 ABA 处理时基因
表达的程度在野生型和过量表达株系中类似。尽管盐胁迫和
ABA诱导了 ABI1的表达, 但在野生型和过量表达株系中表
达谱基本相似。在正常培养条件下, RD29A基因在过量表达
株系中的表达水平是野生型的 2倍左右, 而另外 3个基因表
达水平在野生型和过量表达株系中无明显变化。
3 讨论
已有证据表明 PRPs 参与应答多种生物和非生物胁
迫。例如过量表达花特异表达的 OsPRP3基因的转基因水
稻增强了对冷胁迫的耐受性[14]。过量表达木豆 CcHyPRP
基因的拟南芥增强了对盐、干旱和热胁迫的耐受性[24-25]。
为明确 GhPRP5 参与生物和非生物胁迫应答中的功
能, 我们对过量表达 GhPRP5的转基因拟南芥进行了盐、
图 6 Quantitative RT-PCR 分析胁迫相关标记基因的表达
Fig. 6 Quantitative RT-PCR analysis of stress-responsive genes in wild type and transgenic Arabidopsis lines
在正常生长条件下, 转基因株系中 RD29A表达水平几乎是在野生型中的 2倍, ABA显著诱导转基因株系中 RD29B基因的表达, 盐胁迫显著诱
导了转基因株系中 KIN1基因的表达。误差棒表示±标准差, 柱子上不同字母显示显著差异, 重复 3次都得到类似结果。
The RD29A mRNA level in the transgenic lines was nearly twice as much as that in wild type plants under normal growth conditions. Induction of
RD29B by salt was affected similarly in the transgenic lines and the wild type plants, while ABA significantly up-regulated RD29B expression in the
transgenic lines. KIN1 gene induction by ABA was similar in transgenic lines and wild type plants, while the induction level by salt in transgenic lines
was significantly higher than that in the wild type. Error bars represent ±SD, Bars with different uppercase letters are significantly different at the 0.01
probability level, and those with lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level, the experiment was repeated three times with
similar results.
568 作 物 学 报 第 39卷
干旱、冷害、重金属以及一定浓度的 IAA、2,4-D、GA、
ABA处理。除盐胁迫和 ABA处理显著降低转基因拟南芥
的萌发和幼苗生长外, 其他处理都未见明显差异(资料未
显示)。为进一步研究 GhPRP5对盐胁迫和 ABA应答可能
的机制, 我们分析了一些与胁迫相关标记基因的表达情
况。已有研究表明 RD29A和 RD29B受冷、盐和干旱胁迫
的诱导[26], 在拟南芥中, RD29A 和 RD29B 在盐或干旱胁
迫处理时表达上调, 而这些胁迫应答基因的高表达有助
于植物增强对胁迫的耐受性[27-28]。ABI1 受 ABA 的诱导,
并在拟南芥的 ABA信号转导途径中起负调控作用, abi1-1
突变体降低了对 ABA的耐受性[29]。KIN1参与应答 ABA、
干旱、冷和盐胁迫[30]。我们的研究显示, 在野生型拟南芥
中 4 个标记基因都被盐和 ABA 处理所诱导, 与之前报道
的研究结果是一致的[26,30-31], 然而在转基因株系中, 与野
生型相比, 这些基因表达上调的程度很不一样。例如, 在
盐胁迫后, KIN1在转基因拟南芥中表达显著上调。经ABA
处理后, RD29B在转基因拟南芥中显著上调, 这些结果说
明 GhPRP5参与调控拟南芥中胁迫基因的表达。
转录因子 CBFs/DREBs 结合 RD29A 和 KIN1启动子
的顺式作用元件 CRE/DRE, 进而调节 RD29A 和 KIN1 基
因的表达。而编码 CBFs/DREBs 的基因也被胁迫条件和
ABA 诱导[31-32], RD29B 表达是被结合 RD29B 启动子里
ABRE 元件的转录因子调节的[33]。RD29A 基因启动子含
有 1个 ABRE元件, 而 RD29B基因启动子含有 2个 ABRE
元件。因此, 很可能胁迫信号首先传递到激活转录因子表
达的因子, 接着转录因子结合到胁迫基因启动子的顺式
元件上, 进而激活胁迫基因转录。本文结果显示 GhPRP5
影响盐和 ABA 诱导的 RD29A, RD29B 和 KIN1 基因的表
达 , 很可能是通过影响转录因子的表达来完成的 , 但盐
和 ABA 对不同标记基因在转基因株系中影响的程度不同,
说明 GhPRP5参与对 ABA和盐响应的内在调节机制是不
同的。尽管 RD29A, RD29B和 KIN1这几个标记基因不同
程度地显示了上调, 转基因拟南芥还是增强了对盐胁迫
和 ABA的敏感性, 正如 Kim等[34]提出的, 在一些场合中,
胁迫应答基因表达水平越高 , 越显示对胁迫的耐受性 ,
但在有些场合, 胁迫基因表达水平上调不足以提高对胁
迫的抗性。GhPRP5在植物胁迫信号转导中的机制还需进
一步研究。
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