全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 565573 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)和国家科技支撑计划项目(2010BAD01B10)资助。
通讯作者(Corresponding author): 戚存扣, E-mail: qck9898@sina.com
Received(收稿日期): 2014-07-11; Accepted(接受日期): 2015-02-05; Published online(网络出版日期): 2015-03-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150302.0301.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00565
甘蓝型油菜 BnADH3基因的克隆及转 BnADH3拟南芥的耐淹性
吕艳艳 付三雄 陈 松 张 维 戚存扣*
江苏省农业科学院经济作物研究所 / 江苏省现代作物生产协同创新中心, 江苏南京 210014
摘 要: 利用 RT-PCR技术从甘蓝型油菜耐淹品系 WR-4中克隆获得 BnADH3基因, 其完整开放阅读框为 1137 bp。
该基因编码 379 个氨基酸, 与甘蓝 BoADH3 基因和拟南芥 AtADH3 基因高度同源, 同源性分别达到 96%和 91%。利
用定量 RT-PCR检测 BnADH3基因在油菜耐淹系 WR-4和不耐淹系 WR-24中的表达表明, 在淹水处理下该基因表达
受到一定的诱导, 淹水处理 6 h后表达开始上调, 说明 BnADH3基因在油菜耐淹机制中发挥作用; 将其转化到模式生
物拟南芥中, 采用幼苗淹水 3 d后去水处理, 测定表明转基因株系叶片和根系中乙醇脱氢酶活性均高于野生型; 生长
4周和 6周的拟南芥植株淹水 3 d后的表型显示, BnADH3的表达可增强拟南芥对淹水胁迫的耐性, 处理的 T2代转基
因幼苗大部分恢复, 但野生型幼苗枯死; 调查表明, 淹水 5 d后野生型植株的存活率为 26.7%, 转基因株系 ADH33和
ADH44的存活率分别为 80.0%和 66.7%。
关键词: 甘蓝型油菜; 基因 BnADH3; 转基因拟南芥; 淹水胁迫; 耐淹性
Cloning of BnADH3 Gene from Brassica napus L. and Submergence Tolerance
of BnADH3 Transgenic Arabidopsis
LÜ Yan-Yan, FU San-Xiong, CHEN Song, ZHANG Wei, and QI Cun-Kou*
Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nan-
jing 210014, China
Abstract: BnADH3 gene was cloned from submergence-tolerant line WR-4 of Brassica napus L. using RT-PCR technique. The
full-length open reading frame is 1137 bp, encoding 379 amino acids. Homology analysis showed that BnADH3 gene was highly
homologous to BoADH3 from Brassica oleracea and AtADH3 from Arabidopsis, with the 96% and 91% similarity, respectively.
Quantitative RT-PCR assay was carried out to compare BnADH3 expression between the submergence-tolerant line WR-4 and the
submergence-susceptible line WR-24. The result showed that the BnADH3 expression was induced by submergence and the
up-regulation occurred since 6-hour post treatment. The BnADH3 transgenic Arabidopsis was obtained and the transgenic seed-
lings were exposed to three-day submergence stress. Overexpression of BnADH3 resulted in higher ADH activity in leaf and
root of transgenic Arabidopsis compared to that of the wild type. The four- and six-week seedlings of T2 generation showed
higher tolerance to submergence stress after three-day submergence treatment and most T2 seedlings were recovered with nor-
mal growth when the stress was relieved for three days. However, the wild-type seedlings withered until death. After five-day
submergence, the survival ratios were 26.7% for the wild type, 80.0% for transgenic line ADH33, and 66.7% for transgenic line
ADH44.
Keywords: Brassica napus L.; Gene BnADH3; Transgenic Arabidopsis; Submergence stress; Submergence tolerance
我国是油菜生产大国, 种植面积和产量约占世
界的 30%左右。长江流域种植面积占我国油菜总面
积的 70%左右, 我国长江中下游地区油菜生长期间,
尤其在苗前期处于多雨季节 , 加上特有的水稻–油
菜轮作方式导致油菜苗期产生严重湿害[1]。
在湿害导致的缺氧或无氧环境下, 植物主要通
过无氧呼吸产生能量来进行生理代谢, 以度过缺氧
逆境, 而无氧呼吸主要是通过乙醇发酵途径来进行[2]。
566 作 物 学 报 第 41卷
该途径主要由 2种酶参与催化过程, 首先是在丙酮
酸脱羧酶的作用下将丙酮酸脱羧生成乙醛, 然后乙
醛在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下还原生成乙醇, 同
时产生氧化型 NAD+ [3]。其中乙醇脱氢酶催化的反
应是可逆反应, ADH 可以作为分子开关在乙醛浓度
过高的情况下将其还原为乙醇, 进而避免了对细胞
的伤害; 另一方面ADH也可以重新将乙醇氧化为乙
醛, 同时生成还原性 NADPH, 为植物的代谢提供中
间产物。因此, 在湿害胁迫下, 植株体内 ADH 的活
性对植物在湿害逆境下的防御起着重要的作用。目
前 , 已经在多种植物中研究了缺氧或无氧环境下
ADH 基因及酶活性的变化[4]。淹水处理下玉米[5]和
花生[6]的 ADH活性显著增加; 水稻中 ADH2基因的
表达在淹水胁迫 8 h后达到最大[7]。Xie和 Wu[8]早期
研究发现, 缺氧环境下水稻的 ADH基因在根系、新
叶、老叶以及发育的胚胎中活性均增强, 并且 ADH
活性还受到植物生长素的诱导。但是, 不同植物中
研究结果不同, Andrews等[9]在对玉米的研究中发现,
幼嫩植株的根系ADH活性较高, Adh1基因的转录水
平受缺氧的诱导较明显, 但是在成熟的植株中, ADH
的活性及 Adh1基因的表达受缺氧诱导并不明显。
本研究从甘蓝型油菜中克隆 BnADH3 基因, 转
化拟南芥, 通过淹水处理, 旨在了解 BnADH3 在耐
淹胁迫下的作用, 以证明转基因拟南芥是否通过过
量表达 BnADH3基因而增强了其耐淹性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)耐淹品系 WR-4
和不耐淹品系 WR-24由本实验室留存; 拟南芥哥伦
比亚野生型(Arabidopsis thaliana Colombia)种子由
南京农业大学生命科学学院植物营养生理实验室提
供, 购于 ARBC (拟南芥种植资源中心); 农杆菌菌
株 EHA105、植物表达载体 pBI121 (携带 CaMV35S
启动子)由本实验室留存, 购于上海迈其生物科技有
限公司。
1.2 甘蓝型油菜的种植与淹水处理
将WR-4和WR-24的种子置培养皿中湿润的滤
纸上催芽(25℃, 36 h)。种子露白后播于盛有营养土
和蛭石(1∶1)的盆钵(高 8 cm, 直径 12 cm)中, 于
16 h 光照/8 h 黑暗的光周期下生长, 将其光照时温
度调至 25℃, 黑暗时温度为 22℃。待植株生长至三
叶期时, 进行淹水处理。分单钵置水桶(高 21 cm, 直
径 22 cm)中淹水处理, 水面距幼苗顶部 2 cm。
设对照(不进行淹水处理 , 于淹水处理当天取
样)、淹水 1 h、淹水 3 h、淹水 6 h、淹水 12 h、淹
水 24 h, 共 6个处理, 每个处理设 3个重复。取各个
处理的植株叶片, 迅速置液氮中保存。
利用定量RT-PCR试剂盒 PrimeScript RT reagent
kit (TaKaRa, 日本)分析淹水处理下 BnADH3在油菜
耐淹品系(WR-4)和不耐淹品系(WR-24)以及在转基
因拟南芥中的表达。引物 P3 (5′-GATGAACGACC
GTAAGAGC-3′)和 P4 (5′-ACACCGCACCCAAGAA
GG-3′)用于扩增 BnADH3, P5 (5′-CTGGTGATGGTG
TGTCTCACAC-3′)和 P6 (5′-GTTGTCTCATGGATT
CCAGGAG-3′)用于扩增油菜的内参基因 , P7
(5′-GAGTAACTCAGGCAAACCG-3′)和 P8 (5′-GATT
TCCTGCCTTGACTAAG-3′)用于扩增拟南芥的内参
基因。
1.3 BnADH3 基因的克隆及植物表达载体的构
建
利用引物 P1 (5′-ATGGCGACTCAAGGTCAG-3′)
和 P2 (5′-ATCGCTGGTACTGAGGAC-3′)克隆获得
油菜 BnADH3 基因的完整开放阅读框。利用纯化试
剂盒(天根 , 中国北京)将 PCR 产物纯化 , 连接到
pMD18-T (TaKaRa, 日本)中测序。利用 Pfu 聚合酶
扩增 BnADH3 基因的开放阅读框, 用带有 Xba I 和
Sma I 酶切位点的引物 P1 和 P2, 将克隆得到的
BnADH3 基因片段连到 pMD18-T 载体上 , 利用
BnADH3基因与载体 pBI121上共有的 Xba I和 Sma I
双酶切位点, 将目的基因从 pMD18-T质粒中双酶切
后, 利用胶回收试剂盒回收, 用 T4 DNA 连接酶连
接到经过 Xba I和 Sma I双酶切过的 pBI121植物表
达载体上 , 构建成重组植物表达载体 pBI121-
BnADH3, 用以转化大肠杆菌 Top10感受态细胞。通
过 PCR扩增、酶切及序列测定鉴定阳性克隆。提取
阳性菌株质粒, 以冻融法转化农杆菌 EHA105, 在含
有 50 mg L−1卡那霉素的 YEB培养基上筛选, 鉴定
阳性克隆, 并保存于–80℃冰箱备用。
1.4 拟南芥的转化
利用农杆菌转化法转化拟南芥[10]。转化前一天
将拟南芥苗浇足水, 转化时将荚果及已开的花朵剪
去; 将花序于农杆菌菌液中浸泡 50 s, 用保鲜膜包
裹植株, 在弱光、23℃条件下培养 24 h; 之后除去保
鲜膜, 一周后可进行第 2 次转化。种荚成熟时收获,
将种子于室温干燥, 保存于 4℃冰箱。
第 4期 吕艳艳等: 甘蓝型油菜 BnADH3基因的克隆及转 BnADH3拟南芥的耐淹性 567
1.5 转基因拟南芥的筛选
将 T1代拟南芥的种子于 4℃春化 36~48 h, 经
75%的乙醇消毒 1 min, 5%的次氯酸钠消毒 5 min,
用无菌水冲洗 4~6次, 播于含有 50 mg L−1卡那霉素
的MS培养基中, 将Kan抗性植株转移至盆钵中, 取
抗性植株的叶片提取总 RNA, 以野生型为对照, 利
用半定量 RT-PCR 和定量 RT-PCR 检测 BnADH3 基
因在不同转基因植株中的表达。
1.6 GUS染色检测转基因拟南芥
利用 GUS 染色法验证转基因拟南芥[11]。1 mL
X-Gluc染色缓冲液含 50 µL N、N-二甲基甲酰胺、
0.5 mg X-Gluc、930 µL磷酸缓冲液(100 mmol L−1 pH
7.0)、10 µL铁氰化钾(5 mmol L−1)、10 µL亚铁氰化
钾(5 mmol L−1)、1 µL Triton X-100。在无菌超净台
上, 将要检测的植物材料放入 X-Gluc 染色缓冲液,
于 37℃恒温箱温浴 12~16 h; 待 X-Gluc染液渗入材
料后, 将材料转入 95%的乙醇脱去叶绿素。将材料
置载玻片上, 显微镜下观察染色的结果, 表达 GUS
的组织和器官呈蓝色。野生型和转基因拟南芥的处
理同步进行。
1.7 拟南芥植株种植与淹水处理
野生型和 2个转基因拟南芥(ADH33和 ADH44)
株系的种子(T2代)经 75%的乙醇消毒 1 min和 5%次
氯酸钠消毒 5 min后, 用无菌水冲洗 4~6次, 分别播
于MS和MS+Kan (50 mg L−1)的培养基中发芽(22℃,
36 h)。植株生长 1 周后, 将抗性的转基因拟南芥植
株转移至 MS 培养基中生长 1 周。之后分别将野生
型和转基因拟南芥植株转移至盛有营养土和蛭石
(1∶1)的盆钵(高 8 cm, 直径 12 cm)中, 每钵 15 株,
在 12 h光照(23℃)/12 h黑暗(19℃)的光周期条件下
生长 2周和 4周。然后分单钵于水桶中(高 21 cm, 直
径 22 cm)淹水处理, 水面距幼苗顶部 2 cm。
观察淹水后植株形态的淹水处理为淹水 3 d; 淹
水 3 d+去水 3 d。
统计植株存活率的淹水处理为淹水 3 d+去水 3
d (T1); 淹水 5 d+去水 3 d (T2); 淹水 7 d+去水 3 d
(T3); 淹水 9 d+去水 3 d (T4)。
1.8 乙醇脱氢酶活性的测定
测定乙醇脱氢酶活性参考 Andrews [9]方法。反
应混合液含 50 mmol L−1 TES缓冲液(pH 7.5, 0.17
mmol L−1 NAD) 940 μL, 50 μL酶提取液, 用 10 μL乙
醇(40%)启动反应, 利用 SHIMADZU UV-2450 分光
光度计在 340 nm 处检测吸光值(OD 值)的变化, 以
每分钟 OD值变化 0.01为一个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 BnADH3基因的克隆
本研究克隆获得的 BnADH3 基因的完整开放
阅读框为 1137 bp (图 1), 编码 379 个氨基酸。通
过 RT-PCR 分析发现 , BnADH3 基因在植株的地上
部和根系中均有表达 , 如图 2 所示。将 BnADH3
的氨基酸序列分别与甘蓝 BoAHD3 (JX104828.1)
和拟南芥 AtADH3 (BT010169.1)的氨基酸序列比
对 , 比对效率分别为 96%和 91%, 具有高度同源
性(图 3)。由此可知 , 本研究克隆获得的 BnADH 基
因属于乙醇脱氢酶 ADH3 基因 , 因此将其命名为
BnADH3。
图 1 BnADH3的克隆
Fig. 1 Clone of BnADH3
M: DL2000 marker 1: BnADH3.
图 2 BnADH3的组织表达
Fig. 2 Tissue-specific expression of BnADH3
2.2 BnADH3 基因在耐淹品系和不耐淹品系中
的表达
对生长 3 周的甘蓝型油菜耐淹品系 WR-4 和不
耐淹品系 WR-24 淹水处理后, 定量 RT-PCR 检测
BnADH3基因的表达结果见图 4。BnADH3在 2个品
系中的表达变化趋势是一致的。在淹水后, BnADH3
的表达下降, 淹水 3 h时, BnADH3的表达降到最低;
随着淹水时间的延长, BnADH3的表达逐渐上调。淹
水 12 h时, 耐淹品系 WR-4中 BnADH3的表达量是
对照的 1.2 倍, 不耐淹品系 WR-24 中 BnADH3 的表
达为对照的 1.4倍。可见, 相对于耐淹品系, 不耐淹
品系受到的淹水伤害更大。乙醇脱氢酶可能在不耐
淹品系中发挥着更重要的作用。
568 作 物 学 报 第 41卷
图 3 BnADH3与芸薹属 BoADH3 (JX104828.1)和拟南芥 AtADH3 (BT010169.1)氨基酸序列的比对
Fig. 3 Alignment of the deduced amino acid sequence of BnADH3 with sequences of BoADH3 (JX104828.1) and AtADH3
(BT010169.1) from Brassica and Arabidopsis
图 4 定量 RT-PCR分析淹水胁迫下 BnADH3基因在耐淹油菜
WR-4和不耐淹油菜 WR-24中的表达
Fig. 4 Quantitative RT-PCR analysis of BnADH3 gene expres-
sion in submergence tolerant line WR-4 and susceptible line
WR-24 of Brassica napus L. under submergence stress treatments
Control: 对照; 1: 淹水 1 h; 2: 淹水 3 h; 3: 淹水 6 h; 4: 淹水 12 h;
5: 淹水 24 h。
1: 1 h submergence; 2: 3 h submergence; 3: 6 h submergence;
4: 12 h submergence; 5: 24 h submergence.
2.3 转 BnADH3基因拟南芥的获得及验证
通过农杆菌转化法获得转基因拟南芥 T1代植株,
经 Kan 筛选后, 首先利用 P1和 P2引物进行半定量
RT-PCR验证(图5), 同时利用 BnADH3基因的定量引
物 P3和 P4进行定量 RT-PCR验证, 获得阳性转基因
植株, 对 BnADH3在不同转基因株系中的定量表达
分析结果见图6, 经验证最终利用 ADH33和 ADH44
2个转基因株系的 T2代进行后续的实验。GUS 染色
分析结果显示转基因株系的叶片和根系中均检测到
GUS 的表达 , 而野生型拟南芥植株中没有检测到
GUS的表达(图7)。
2.4 短时间淹水处理下 BnADH3 增强了转基因
拟南芥的耐淹性
无论是生长 4 周还是生长 6 周的拟南芥植株,
在未进行淹水处理的情况下, 野生型和转基因株系
在表型上没有明显的差异。生长 4 周的野生型拟南
芥淹水 3 d 后, 大部分植株出现叶片透明状的伤害
图 5 RT-PCR分析不同转基因拟南芥株系中 BnADH3基因
的表达
Fig. 5 RT-PCR analysis of BnADH3 gene expression in
different transgenic Arabidopsis lines
M: DL2000 marker; ADH66、ADH44、ADH33 和 ADH1为转基
因株系; N: 阴性对照; P: 阳性对照。
M: DL2000 marker; ADH66, ADH44, ADH33, and ADH1:
transgenic lines; N: negative control; P: positive control.
图 6 BnADH3在野生型和转基因拟南芥中的表达
Fig. 6 Relative expression of BnADH3 in wild-type and
transgenic Arabidopsis lines
WT: 野生型; ADH66、ADH44、ADH33和 ADH1为转基因株系。
WT: wild type; ADH66, ADH44, ADH33, and ADH1: transgenic lines.
第 4期 吕艳艳等: 甘蓝型油菜 BnADH3基因的克隆及转 BnADH3拟南芥的耐淹性 569
表型, 在淹水 3 d+去水后 3 d时, 野生型拟南芥植株
死亡, 但是转基因植株已开始恢复生长(图 8-A); 生
长 6 周的拟南芥淹水 3 d 后, 野生型叶片失绿变黄,
而转基因株系叶片呈深绿色。但在淹水 3 d+去水后
3 d时, 野生型拟南芥部分叶片枯萎死亡, 仅少数植
株恢复生长; 而转基因株系大部分植株恢复生长(图
8-B)。淹水胁迫严重抑制了根系的生长(图 9-A, B)
但是转基因拟南芥根系受到的伤害明显小于野生
型。通过对植株地上部和根系的干重统计(图 9-C)
图 7 GUS染色检测转基因拟南芥
Fig. 7 Identification of transgenic Arabidopsis by GUS staining
图 8 生长 4周(A)及 6周时(B)野生型和转基因拟南芥在淹水胁迫下地上部生长状况
Fig. 8 Growth of four-week (A) and six-week (B) seedlings of wild-type and transgenic Arabidopsis under submergence treatments
Wild type: 野生型; ADH33和 ADH44: 转基因株系。ADH33 and ADH 44: transgenic lines.
图 9 生长 6周时野生型和转基因拟南芥根系生长状况(A)及生物量统计(B, C)
Fig. 9 Growth (A) of six-week seedlings of wild-type and transgenic Arabidopsis under submergence treatments and the statistics
of biomass (B, C)
Wild type: 野生型; ADH33和 ADH44: 转基因株系。ADH33 and ADH 44: transgenic lines.
570 作 物 学 报 第 41卷
得出 , 淹水胁迫下 , 野生型的生长缓慢 , 而转基因
株系的生物量增加明显。由此可以看出, 淹水胁迫
明显抑制了野生型植株的生长, 对野生型植株的伤
害明显大于对转基因株系的影响。
2.5 淹水处理下野生型和转基因拟南芥乙醇脱
氢酶的活性
从图10可知, 在未进行淹水处理时, 转基因拟
南芥地上部和根系的乙醇脱氢酶的本底活性高于野
生型。淹水3 d处理后, 野生型和转基因拟南芥地上
部和根系的乙醇脱氢酶活性都明显增强, 野生型叶
片中为5.2 U mg–1蛋白, 而2个转基因株系叶片中分
别为8.9 U mg–1蛋白和8.6 U mg–1蛋白, 显著高于野
生型。在淹水3 d+去水后3 d处理中, 野生型和转基
因株系叶片中乙醇脱氢酶的活性都逐渐降低, 且没
有明显差异。根系中乙醇脱氢酶的活性变化与叶片
中的趋势一致, 只是在淹水3 d处理后, 野生型根系
中的乙醇脱氢酶活性比对照显著增强 , 且高于2个
转基因株系。
图 10 淹水胁迫下野生型和转基因拟南芥中乙醇脱氢酶的活性
Fig. 10 ADH activity in wild-type and transgenic Arabidopsis seedlings under submergence treatments
Wild type: 野生型; ADH33和 ADH44: 转基因株系; Shoot: 地上部; Root: 根系。
ADH33 and ADH 44: transgenic lines.
对生长 4 周的野生型和转基因株系不同淹水处
理后植株存活率的调查表明(图 11), 淹水 3 d+去水
后 3 d处理后, 野生型植株存活率为 35.6%, 2个转基
因株系 ADH33 和 ADH44 的存活率分别为 77.8%和
84%。在淹水 5 d+去水后 3 d处理后, 野生型植株的
存活率为 26.7%, 转基因株系 ADH33 和 ADH44 的
存活率分别为 80%和 66.7%。但是在淹水 7 d+去水
后 3 d处理下, 野生型植株的存活率为 33.3%, 而转
基因株系 ADH33和 ADH44的存活率也出现明显的
图 11 不同时间淹水处理下野生型和转基因拟南芥的存活率
Fig. 11 Survival rate of wild-type and transgenic Arabidopsis
seedlings under different submergence treatments
Wild type: 野生型; ADH33和 ADH44: 转基因株系; Control: 对
照; 1: 淹水 3 d+去水 3 d; 2: 淹水 5 d+去水 3 d; 3: 淹水 7 d+去水
3 d; 4: 淹水 9 d+去水 3 d。
ADH33 and ADH 44: transgenic lines; 1: 3 d submergence + 3 d
recovery; 2: 5 d submergence + 3 d recovery; 3: 7 d submergence +
3 d recovery; 4: 9 d submergence + 3 d recovery.
下降, 分别为 44%和 46%。在淹水 9 d+去水后 3 d
处理下 , 野生型和转基因植株的存活率均降低到
10%以下。说明短时间的淹水处理下转 BnADH3 基
因株系的耐淹性高于野生型。但是当淹水时间超过
7 d时野生型和转基因植株均受到了严重的伤害, 转
基因材料并未表现出比野生型强的耐淹性。
3 讨论
目前关于作物耐淹相关基因的研究主要包括两
大类, 其中一类是代谢功能基因, 包括碳代谢、乙醇
发酵、细胞分裂素合成等相关过程中的基因 [12-15];
另一类是转录因子基因, 包括乙烯响应因子(ERF)等
调控基因[16-19]。乙醇脱氢酶在乙醇发酵过程中催化乙
醛和乙醇之间相互转化, 进而使植物在缺氧或无氧环
境下对能量的获取及物质代谢得到一定的保障。
不同 ADH 基因的表达具有组织特异性。
Kürsteiner等[20]分析了拟南芥 ADH基因的表达情况,
发现 ADH 在拟南芥所有器官中都表达 ; 而水稻
ADH1主要在叶片和花粉中表达, ADH2主要在根系
中表达[21], 本研究中 BnADH3 基因在根系和叶片中
均有表达。很多研究表明, ADH 基因的表达受缺氧
或无氧环境的诱导, 通过微阵列技术对水稻的胚芽
第 4期 吕艳艳等: 甘蓝型油菜 BnADH3基因的克隆及转 BnADH3拟南芥的耐淹性 571
鞘分析发现, 无氧条件下 ADH1 的表达上调约 4 倍,
而 ADH2的表达上调 20多倍[21]。Komatsu等[22]研究
发现, 湿害胁迫 2 d 后大豆 ADH 基因表达增强, 其
中 GmADH2基因的上调幅度最为明显, 该基因在淹
水 6 h后表达量达到最大, 在去水 24 h后表达开始
下降。除此之外, ADH 基因还可以被其他多种胁迫
因素诱导 , 如在水稻、玉米和拟南芥中研究发现
ADH 基因能被冷害、机械伤害以及 ABA 等植物激
素诱导[20, 23-25]。本研究中, 在不同淹水时间处理下,
BnADH3 的表达也受到一定的诱导, 而且该基因的
表达在 2个甘蓝型油菜品系中的变化趋势是一致的,
淹水 3 h后, BnADH3的表达首先呈下降的趋势, 合
理的解释是, 淹水初期植物对逆境的应激反应导致
植物整个生命活动的减弱, 基因表达下调, 随着淹
水时间的延长, BnADH3的表达逐渐上调, 其中在淹
水 12 h时耐淹品系WR-4中 BnADH3的表达增至原
来的 1.2 倍, 而不耐淹品系 WR-24 中 BnADH3 的表
达为淹水前的 1.4倍。另外, 我们对淹水前耐淹和不
耐淹油菜品系 BnADH3 基因表达的定量研究发现,
BnADH3 在耐淹油菜品系中的本底表达量高于不耐
淹品系, 约是不耐淹品系的 2倍。淹水胁迫下, 耐淹
和不耐淹油菜品系中 BnADH3基因都受到诱导表达,
而且趋势相似, 只是在不耐淹油菜品系中表达增加
的幅度更大一些。因为植物的耐淹机制有很多, 例
如有机调节物质的增加 [26], 抗氧化酶活性的增强
等 [27], 耐淹植物因为具有较强的耐淹机制, 可能植
物本身受到的淹水伤害较小, 而不耐淹品系对缺氧
更加敏感, 同样在缺氧环境下, 不耐淹品系可能需
要更多的 ADH 表达来增强无氧呼吸途径以获取能
量, 所以 ADH表达量可能会高于耐淹品系。但是无
论是耐淹品系还是不耐淹品系, 淹水后 BnADH3 基
因的表达都受到了诱导。
ADH 的突变会使植物的缺氧耐受力降低, 如拟
南芥[28]、玉米[29]以及水稻[30]的 adh突变体都表现出
对缺氧的敏感。同时, 互补实验表明过量表达拟南
芥的 ADH 基因能增强拟南芥根系对低氧环境的耐
性[4, 31]。但是也有相关研究发现, 虽然 adh突变体对
缺氧更加敏感, 存活率下降, 但是过量表达 ADH 的
拟南芥对缺氧胁迫的耐性并没有增强反而降低 [32],
同样的研究在棉花中也得到类似的结果, 过量表达
ADH 基因的棉花虽然增强了乙醇发酵途径, 但是并
没有增强植株对缺氧的耐性 [33]。可能植物本身的
ADH 活性足以维持催化乙醇发酵途径的需要, 虽然
短时间内乙醇脱氢酶活性的增强能促进植株在淹水
胁迫下的无氧呼吸途径, 为植株代谢提供能量, 但
是, 长时间的淹水使乙醛和乙醇在植株体内大量积
累, 会对植株造成一定的伤害。本研究中, 在短时间
淹水处理下(淹水 3 d+去水后 3 d), 转基因拟南芥在
去水后植株的存活率明显高于野生型, 但是在淹水
7 d+去水后 3 d以及淹水 9 d+去水后 3 d, 转基因植
株的存活率也逐渐下降, 说明过量表达 BnADH3 后,
能在短时间淹水处理下增强转基因植株的耐性, 但
是, 在长时间淹水处理下, 转基因拟南芥并未表现
出高于野生型的耐性。对于 BnADH3过量表达的植
株来说, 虽然能在缺氧或无氧条件下维持较长时间
的乙醇发酵途径来保证能量的供应, 但是乙醇发酵
产生的乙醛和乙醇仍然会对植物产生不利的影响。
乙醇脱氢酶在多种植物生理代谢活动和发育过
程中都发挥着重要的作用, 因此乙醇发酵途径已经
不仅仅局限于缺氧逆境下植物产生能量的反应。本
研究表明, 过量表达 BnADH3 能增强转基因植株在
短期淹水胁迫下的缺氧耐受性, 但是在较长时间的
淹水处理下, 转基因拟南芥的耐淹性并没有增强。
另外, 不同的乙醇脱氢酶在不同植物应对湿害逆境
过程中所起到的作用也不同, 因此我们将进一步对
甘蓝型油菜其他 ADH 基因的功能进行发掘和研究,
这将为以后利用基因工程改善植物抗逆性提供一定
的科学依据。
4 结论
克隆获得甘蓝型油菜 BnADH3 基因, 其完整开
放阅读框为 1137 bp, 编码 379个氨基酸, 与甘蓝
BoADH3和拟南芥 AtADH3氨基酸序列的比对效率
分别为 96%和 91%, 具有高度同源性。BnADH3 基
因在甘蓝型油菜的根系和地上部均有表达, 且均受
淹水的诱导。短时间淹水处理下, 无论是生长 4 周
还是 6 周的拟南芥植株, 过量表达 BnADH3 均增强
对淹水胁迫的耐性 , 在淹水后恢复生长的过程中 ,
转基因植株的存活率明显高于野生型。但是, 在淹
水 7 d 或更长时间淹水处理后, 转基因植株的耐淹
性和存活率都明显降低。
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