全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(9): 14401449 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30800077)资助。
第一作者联系方式: E-mail: biowxr@126.com, Tel: 020-89003226
Received(收稿日期): 2010-03-10; Accepted(接受日期): 2010-04-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01440
含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力
万小荣 1 莫爱琼 2 郭小建 1 杨妙贤 1 余土元 1 曹锦萍 1
1 仲恺农业工程学院生命科学学院, 广东广州 510225; 2 仲恺农业工程学院教学科研基地, 广东广州 510225
摘 要: AhNCED1 是干旱胁迫下调控花生 ABA 生物合成的关键基因。以 pCAMBIA1301 为基本双元表达载体, 分
别构建 CaMV 35S 启动子和拟南芥 AtNCED3 基因启动子(AtNCED3p)驱动花生 AhNCED1 基因的 2 个植物双元表达
载体 p35S::ORF 和 pAtNCED3p::ORF, 通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和 129B08/nced3
突变体拟南芥, 经潮霉素筛选和 PCR 鉴定分别获得 35S::ORF-WT 和 A3p::ORF-B08 转基因植株, RT-PCR 证实花生
AhNCED1 基因已在转基因植株中稳定表达, 并对野生型、129B08/nced3 突变体和转基因拟南芥进行外源 ABA 敏感
性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明, 129B08/nced3 突变体对外源 ABA 的敏感性下降, 而花生 AhNCED1 基因在拟
南芥中的异位表达提高了对外源 ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下, 129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于
野生型的, 而 A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当, 显著高于 129B08/nced3突变体的, 且
300 mmol L–1山梨醇胁迫下, 35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在 300 mmol L–1山梨
醇胁迫下, 129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化, 根的形成和幼苗生长受到严重抑制, 而 A3p::ORF-B08转基因突
变体与野生型相似, 叶片仅轻度黄化, 幼苗生长势良好; 35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果
说明, 拟南芥 129B08/nced3 突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性, 异位表达花生 AhNCED1 基因能恢复
该突变体对山梨醇的超敏性, 提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。
关键词: AhNCED1基因; 异位表达; 转基因拟南芥; 渗透胁迫; ABA敏感性
Osmotic Stress Tolerance Improvement of Arabidopsis Plants Ectopically Ex-
pressing Peanut AhNCED1 Gene
WAN Xiao-Rong1, MO Ai-Qiong2, GUO Xiao-Jian1, YANG Miao-Xian1, YU Tu-Yuan1, and CAO Jin-Ping1
1 College of Life Sciences, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2 Teaching and Researching Base,
Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
Abstract: The phytohormone abscisic acid (ABA) is a key regulator of seed development, root growth, stomatal aperture in
higher plants and it is also involved in adaptation of plants to various stresses. The oxidative cleavage of cis-epoxycarotenoids
catalyzed by nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) is considered to be the rate-limiting step in ABA biosynthesis in
higher plants. The AhNCED1 gene plays a vital role in the regulation of ABA biosynthesis in peanut plants in response to drought
stress. Two binary vectors, p35S::ORF and pAtNCED3p::ORF, were established which harbored the AhNCED1 gene, respectively,
driven by the CaMV 35S promoter originated from pCAMBIA1301 and the AtNCED3 gene promoter from wild type Arabidopsis.
Wild type and 129B08/nced3 mutant Arabidopsis plants were separately transformed with Agrobacterium harboring p35S::ORF
or pAtNCED3p::ORF vectors, generating 35S::ORF-WT and A3p::ORF-B08 transgenic plants, respectively, after hygromycin
screening and PCR detection. The stable expression of AhNCED1 gene in Arabidopsis plants was confirmed by duplex RT-PCR
performance. Wild type, 129B08/nced3 mutant and transgenic Arabidopsis plants were subsequently tested for sensitivity to ex-
ogenous ABA and tolerance to osmotic stress. The results showed that the ABA sensitivity of 129B08/nced3 mutant declined, and
that of Arabidopsis plants ectopically expressing the AhNCED1 gene increased. Under sorbitol stress, the relative germination rate
of 129B08/nced3 mutant seeds was far lower than that of wild type seeds; however, the relative germination rate of
A3p::ORF-B08 transgenic seeds was close to that of wild type seeds, significantly higher than that of 129B08/nced3 mutant seeds.
The relative germination rate of 35S::ORF-WT transgenic seeds was higher than that of wild type seeds at the treatment of 300
mmol L–1 sorbitol. Under 300 mmol L–1 sorbitol stress, leaf of 129B08/nced3 mutant plants was highly chlorotic, and root forma-
第 9期 万小荣等: 含异位表达花生 AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1441


tion and seedling growth were severely inhibited. In contrast, at this concentration of sorbitol, leaf of A3p::ORF-B08 transgenic
seedlings was only slightly chlorotic, just similar to that of wild-type plants; the growth of 35S::ORF-WT transgenic seedlings
was nearly not affected. Germination assay and phenotypic evaluation revealed that 129B08/nced3 mutant was hypersensitive to
the nonionic osmotic stress induced by sorbitol, and that ectopic expression of peanut AhNCED1 gene reverted the hypersensitiv-
ity of 129B08/nced3 mutant Arabidopsis to sorbitol and conferred enhanced osmotic stress tolerance of transgenic Arabidopsis
plants. These observations and an improved understanding of the roles of AhNCED1 gene in stresses adaptation could provide the
basis for engineering greater stress tolerance in crops.
Keywords: AhNCED1 gene; Ectopic expression; Transgenic Arabidopsis; Osmotic stress; ABA sensitivity
花生(Arachis hypogaea L.)是广东省主要的油料
和经济作物, 在省国民经济中占有重要位置, 广东
是我国南方花生产区播种面积最大、单产和总产最
高的省份, 但其种植面积 60%以上分布在干旱、半干
旱地区[1], 干旱胁迫成为提高花生产量和品质的主要
限制因子[2]。
脱落酸(abscisic acid, ABA)作为一种胁迫激素,
在植物对胁迫环境的适应中起重要调节作用, 大量资
料表明, 逆境条件下, 植物体内源 ABA 含量增加,
以提高抗逆性[3]。近年来, 已经明确高等植物 ABA
生物合成的主要途径(C40间接途径)可分为 3个阶段:
(1)在质体内形成胡萝卜素; (2)在质体内形成玉米黄
质, 玉米黄质环化形成环氧类胡萝卜素(9-顺式新黄
质及 9-顺式紫黄质), 然后 9-顺式新黄质或 9-顺式紫
黄质裂解形成黄质醛; (3)黄质醛在细胞溶胶内转变
形成 ABA[4-5]。生物化学[6]和遗传学[7]的实验结果证
明, 9-顺式新黄质或 9-顺式紫黄质裂解形成黄质醛
是这一途径的限速步骤, 催化该裂解反应的 9-顺式
环氧类胡萝卜素双加氧酶(nine-cis-epoxycarotenoid
diox- ygenase, NCED)则是调控高等植物 ABA生物
合成的关键酶[4-5]。自从通过鉴定玉米突变体 vp14,
进而克隆了 ZmVp14基因(即 NCED基因)以来[8], 已
相继在番茄[9]、菜豆[10]、豇豆[11]、美国鳄梨[12]、拟
南芥[13]、葡萄[14]、柑橘[15]、马铃薯[16]、柱花草[17]、
龙胆[18]、猪殃殃[19]、云南菟丝子[20]、玫红岩蔷薇[21]
和柿果[22]中克隆鉴定了 NCED 基因。本实验室曾从
抗旱性强的花生品种叶中克隆到 NCED 基因, 被命
名为AhNCED1 (GenBank登录号为AJ574819), 发现
其表达受脱水胁迫诱导[1], 并证实 AhNCED1是干旱
胁迫下花生叶中调控 ABA生物合成的关键基因[23]。
AtNCED3 基因调控水分胁迫下拟南芥中 ABA 生物
合成[13,24], 129B08/nced3 突变体是 T-DNA 插入到拟
南芥 AtNCED3 基因(At3g14440)外显子上所获得的,
水分胁迫时, 植株不能累积 ABA, 对水分胁迫敏感,
呈叶片萎蔫等表型[23,25]。
本文实验分别构建 CaMV 35S启动子和拟南芥
AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1
基因的 2个植物双元表达载体 p35S::ORF和 pAtNCED-
3p::ORF, 通过根癌农杆菌介导法将上述 2个表达载
体分别转化野生型和 129B08/nced3 突变体拟南芥,
经潮霉素筛选和 PCR鉴定转基因植株后, 并对野生
型、129B08/nced3 突变体和转基因拟南芥进行外源
ABA 敏感性和耐渗透胁迫能力分析, 为通过植物基
因工程提高农作物抗旱性及农作物抗旱育种奠定实
验基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌株和质粒
野生型(wild type, WT)拟南芥(哥伦比亚生态型,
Col-0)种子由本实验室繁种保存; 129B08/nced3 突变
体拟南芥种子购自德国 GABI-Kat (http://www.gabi-
kat.de/)[26]拟南芥 T-DNA 插入突变体数据库。大肠杆
菌菌株 DH5α、根癌农杆菌菌株 LBA4404、植物双元
表达载体 pCAMBIA1301 由本实验室保存; 克隆载体
pMD 18-T购自宝生物(TaKaRa)工程有限公司。
1.2 植物双元表达载体构建
构建 p35S::ORF表达载体时, 选用 pCAMBIA1-
301 为基本双元载体。以引物 ORF-F(5-AGA TCT
CAT GGC AGC AAC TTC AAA CAC ATG-3)和
ORF-R(5-GGT CAC CAA TCA AGC CTG CTT
CCG GAG ATC-3)扩增花生 AhNCED1基因的完整
开放阅读框(open reading frame, ORF)序列, 根据克
隆需要在两引物的 5端分别引入 Bgl II和 BstE II限
制性内切酶酶切位点, 将 PCR扩增产物克隆到 pMD
18-T载体上, 得到 pMD 18-AhNCED1克隆, 测序验
证后, 以 Bgl II和 BstE II双酶切 pMD 18-AhNCED1
质粒, 回收酶切得到的 AhNCED1 ORF 片段, 并连
接于同样经 Bgl II 和 BstE II 双酶切的 pCAMBIA
1301载体 CaMV 35S启动子下游, 构建成植物双元
表达载体 p35S::ORF(图 1)。构建 pAtNCED3p::ORF
表达载体时 , 根据 GenBank 数据库中报道的
AtNCED3 基因组 DNA 序列(At3g14440)设计特异性
1442 作 物 学 报 第 36卷

引物 (A3p-F: 5-GAG CTC CAC CAG ACA ATT
CAA AGT TA-3和 A3p-R: 5-AGA TCT ACC ATT
TTT CAA GTG TGT TCA-3), 用于 PCR 扩增
AtNCED3 基因启动子片段(AtNCED3p), 在两引物
的 5端分别引入 Sac I和 Bgl II酶切位点, 将 PCR产
物克隆到 pMD 18-T载体上, 得到 pMD 18-AtNCED
3p克隆, 测序验证后, 以 Sac I和 Bgl II双酶切 pMD
18-AtNCED3p质粒, 回收酶切得到的 AtNCED3p启
动子片段, 并连接于同样经 Sac I和 Bgl II双酶切的
双元表达载体 p35S::ORF 花生 AhNCED1 基因上游,
替换 CaMV 35S 启动子, 构建成植物双元表达载体
pAtNCED3p::ORF(图 2)。
1.3 拟南芥转基因
将 p35S::ORF和 pAtNCED3p::ORF表达载体分
别转化根癌农杆菌 LBA4404, 参阅Clough和Bent[27]
的方法, 以含 p35S::ORF 表达载体的农杆菌转化野
生型拟南芥, 得到的转基因植株称为 35S::ORF-WT,
以含 pAtNCED3p::ORF 表达载体的农杆菌转化
129B08/nced3 突变体拟南芥, 得到的转基因植株称
为 A3p::ORF-B08。
1.4 转基因拟南芥筛选与检测
1.4.1 以潮霉素筛选转基因拟南芥 收取转化后
拟南芥种子, 消毒并在 0.1%的琼脂糖中重悬种子,
均匀分散到潮霉素筛选培养基(1/2 MS+0.8%琼脂+
25 μg mL1潮霉素, pH 5.8)上, 4℃均一化处理 2~3 d
后, 置光下 22 /℃ 暗处 20℃的培养室中进行培养, 光
周期为 16 h光照/8 h黑暗。约 10 d后, 将生长较快
的绿苗移栽到培养土中继续生长以收取种子, 其余

图 1 花生 AhNCED1 基因过表达双元载体 p35S::ORF 的构建
Fig. 1 Establishment of binary vector p35S::ORF harboring peanut AhNCED1 gene driven by CaMV 35S promoter
第 9期 万小荣等: 含异位表达花生 AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1443



图 2 拟南芥 AtNCED3 基因启动子驱动花生 AhNCED1 基因的双元表达载体 pAtNCED3p::ORF 的构建
Fig. 2 Establishment of binary vector pAtNCED3p::ORF harboring peanut AhNCED1 gene driven by AtNCED3 gene promoter

非转化黄苗在筛选培养基上逐渐死亡。为得到纯合
的转基因株系, 取 T1代植株所收种子表面消毒后播
种于含 25 μg mL1潮霉素的琼脂培养基上, 萌发两
周后 , 统计绿苗和黄苗的分离比例(T2 代分离比 ),
将绿苗移栽到土壤中, 隔离单株收取种子。每株收
取的种子(T3)分别继续播种于含 25 μg mL1潮霉素
的琼脂培养基上, 在平板上生长全部为绿苗的是含
至少一个插入位点的纯合转基因植株。
1.4.2 转基因植株的 PCR 检测 提取拟南芥基
因组 DNA, 用 AhNCED1基因特异性引物 ORF-F及
ORF-R 进行 PCR 扩增, 检测呈阳性的为转基因植株,
再参阅Wan和 Li[23]的方法利用 duplex RT-PCR检测
转基因植株中 AhNCED1基因的转录水平。
1.5 野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南
芥对外源 ABA的敏感性分析
将野生型、129B08/nced3 突变体及 35S::ORF-
WT和A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子消毒后播种
于附加 1 μmol L–1 ABA的 MS固体培养基上, 4℃均
一化处理 3 d后, 按 1.4.1的光照及温度条件培养 3 d,
观察并拍照记录种子萌发情况。
1.6 野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南
芥对山梨醇的敏感性分析
将消毒后的野生型、129B08/nced3 突变体及
35S::ORF-WT 和 A3p::ORF-B08 转基因拟南芥种子
播种于含不同浓度(0、200、300、400和 500 mmol L–1)
山梨醇的MS固体培养基上, 15 d后统计种子的相对
萌发率 (相对萌发率=处理萌发率 /对照萌发率×
100%), 以不含山梨醇的MS固体培养基上培养的种
子为对照(CK), 并观察、拍照记录山梨醇对 WT、
129B08/nced3突变体及 35S::ORF-WT和 A3p::ORF-
B08 转基因拟南芥幼苗生长发育的影响。采用 SAS
软件对数据进行统计分析。
1444 作 物 学 报 第 36卷

2 结果与分析
2.1 p35S::ORF及 pAtNCED3p::ORF双元表达
载体的构建
按图 1 和图 2 的流程构建植物双元表达载体。
对构建的 p35S::ORF 载体进行 PCR 和双酶切检测,
结果以 ORF-F 和 ORF-R 为引物可特异地扩增出
1 822 bp的 AhNCED1基因片段, Bgl II和 BstE II双
酶切 p35S::ORF 载体可切下相应大小的 DNA 片段
(图 3-A), 说明构建的 CaMV 35S 启动子驱动花生
AhNCED1基因的植物双元表达载体成功。对构建的
pAtNCED3p::ORF 载体进行 PCR 和双酶切检测, 结
果以 A3p-F和 A3p-R为引物可特异地扩增出 1 452
bp的 AtNCED3基因启动子片段(AtNCED3p), Sac I
和 Bgl II双酶切 pAtNCED3p::ORF载体可切下相应
大小的启动子片段(图 3-B), 说明已成功地构建了拟
南芥 AtNCED3基因启动子驱动花生 AhNCED1基因
的植物双元表达载体。


图 3 双元表达载体的 PCR 及酶切检测
Fig. 3 PCR and double digestion detection of binary vectors p35S::ORF and pAtNCED3p::ORF
M: DNA marker (DL2000, TaKaRa)。A: p35S::ORF表达载体的检测; 1: PCR负对照; 2: PCR检测; 3: Bgl II和 BstE II双酶切检测;
4: p35S::ORF质粒(酶切负对照)。B: pAtNCED3p::ORF表达载体的检测; 1: PCR负对照; 2: PCR检测; 3: Sac I和 Bgl II双酶切检测;
4: pAtNCED3p::ORF质粒(酶切负对照)。
M: DNA marker (DL2000, TaKaRa). A: detection of p35S::ORF vector; 1: negative control of PCR system; 2: PCR detection; 3: double di-
gestion by Bgl II and BstE II; 4: p35S::ORF plasmid as a negative control of double digestion; B: detection of pAtNCED3p::ORF vector;
1: negative control of PCR system; 2: PCR detection; 3: double digestion by Sac I and Bgl II; 4: pAtNCED3p::ORF plasmid as a negative
control of double digestion.

2.2 潮霉素筛选及 PCR检测转基因拟南芥
采用花苞浸泡法(floral dipping)[27]进行拟南芥
转基因, 将转化后植株收取的种子播种在含 25 μg
mL1潮霉素的 MS 固体培养基上, 筛选转基因植株
(图 4), 获得 35S::ORF-WT 转基因拟南芥 2 个株系
(图 4-A)及 A3p::ORF-B08转基因突变体拟南芥 1个
株系(图 4-B)。分别对 T1代植株进行单株收种得到
T2代种子, 对 T2代种子同样用含有 25 μg mL1潮霉
素的 MS 固体培养基筛选, 不含有外源基因的植株
逐渐黄化死亡, 而含有外源基因的植株的纯合子和


图 4 在含有 25 µg mL–1 潮霉素的 MS 固体培养基上筛选转基因拟南芥
Fig. 4 Screening of transgenic Arabidopsis plants on MS solid media containing 25 µg mL1 hygromycin
A: 筛选 T1代 35S::ORF-WT转基因植株; B: 筛选 T1代 A3p::ORF-B08转基因植株。
A: screening of T1 generation of 35S::ORF-WT transgenic plants; B: screening of T1 generation of A3p::ORF-B08 transgenic plants.

第 9期 万小荣等: 含异位表达花生 AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1445


杂合子均能够正常生长, 将绿苗移栽, 继续单株收种,
得到 T3代种子, 将 T3代种子继续在含有 25 μg mL1
潮霉素的 MS 培养基上筛选, 不分离的为纯合株系。
提取拟南芥基因组 DNA, 以花生 AhNCED1基因的特
异引物(ORF-F和 ORF-R)进行 PCR扩增, 结果阳性转
化植株均扩增出 1 822 bp的目的片段, 而野生型植株
则无 PCR 扩增产物(图 5-A~B), 说明花生 AhNCED1
基因已整合到拟南芥基因组中。Duplex RT-PCR结果
显示 AhNCED1 基因在 35S::ORF-WT 和 A3p::ORF-
B08转基因拟南芥中均正常表达(图 5-C)。


图 5 转基因植株(T2 代)的 DNA-PCR(A 和 B)和 RT-PCR(C)检测
Fig. 5 Detection of T2 transgenic Arabidopsis plants by DNA-PCR (A and B) and duplex RT-PCR (C)
M: DNA marker (DL2000, TaKaRa)。A: DNA-PCR扩增目的基因 AhNCED1检测 35S::ORF-WT转基因拟南芥; 1: 以水为模板; 2: 以花
生基因组 DNA为模板; 3: 以野生型拟南芥基因组 DNA为模板; 4~5: 以转基因拟南芥基因组 DNA为模板。B: DNA-PCR扩增目的基
因 AhNCED1检测 A3p::ORF-B08转基因拟南芥; 1: 以水为模板; 2: 以花生基因组 DNA为模板; 3: 以野生型拟南芥基因组 DNA为模
板; 4: 以转基因拟南芥基因组 DNA为模板。C: RT-PCR检测野生型(1)、35S::ORF-WT(2)、129B08/nced3突变体(3)和 A3p::ORF-B08(4)
植株中 AhNCED1基因表达(以拟南芥 18S rRNA基因[28]为内标)。
M: DNA marker (DL2000, TaKaRa). A: PCR amplification of AhNCED1 gene with water (1), peanut genomic DNA (2), wild type Arabidop-
sis genomic DNA (3), and 35S::ORF-WT transgenic Arabidopsis genomic DNA (4 and 5) as templates, respectively. B: PCR amplification of
AhNCED1 gene with water (1), peanut genomic DNA (2), wild type Arabidopsis genomic DNA (3), and A3p::ORF-B08 transgenic Arabidop-
sis genomic DNA (4) as templates, respectively. C: gene expression analysis of AhNCED1 in wild type (1), 35S::ORF-WT (2), 129B08/nced3
mutant (3), and A3p::ORF-B08 (4) Arabidopsis plants through duplex RT-PCR with Arabidopsis 18S rRNA gene as a loading control.

2.3 异位表达(ectopic expression)花生 AhNCE-
D1提高转基因拟南芥对外源 ABA的敏感性
分析野生型、129B08/nced3突变体及 35S::ORF-
WT 和 A3p::ORF-B08 转基因拟南芥种子对外源
ABA的敏感性表明(图 6), 在添加 1 μmol L–1 ABA
的培养基上, 野生型与 35S::ORF-WT转基因拟南芥
种子的萌发均几乎被完全抑制 , 无明显差异 ,
129B08/nced3 突变体种子仍有较高的萌发率, 说明
129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性降低, 而
A3p::ORF-B08 转基因突变体种子的萌发亦几乎被
完全抑制, 亦即异位表达花生 AhNCED1 提高了转
基因拟南芥对外源 ABA的敏感性(图 6)。
2.4 异位表达花生 AhNCED1提高转基因拟南芥
耐渗透胁迫能力
图 7 表明, 在含不同浓度山梨醇的培养基上,
129B08/nced3 突变体种子的相对萌发率均明显下降,
当山梨醇浓度为 500 mmol L–1时, 其绝对萌发率几
乎降为 0; 而野生型和 35S::ORF-WT 转基因拟南芥
种子的相对萌发率分别在山梨醇浓度升高至 300
mmol L–1 和 400 mmol L–1 时, 才明显下降; A3p::
ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型
的相当, 显著高于 129B08/nced3 突变体种子的。说
1446 作 物 学 报 第 36卷


图 6 异位表达花生 AhNCED1 提高转基因拟南芥对外源 ABA(1 μmol L1)的敏感性
Fig. 6 Sensitivity increased by ectopic expression of peanut AhNCED1 to exogenous 1 μmol L1 ABA in Arabidopsis plants

明拟南芥 129B08/nced3 突变体对山梨醇有超敏性
(hypersensitivity), 而 AhNCED1 基因的转入提高了
转基因拟南芥(A3p::ORF-B08和 35S::ORF-WT)的耐
渗透胁迫能力。随着山梨醇浓度的升高, 所有基因
型植株幼苗均逐渐变黄, 图 8 显示各基因型植株在
含 300 mmol L–1山梨醇的 MS固体培养基上幼苗生
长情况, 在 300 mmol L–1山梨醇渗透胁迫下, 129B08/
nced3 突变体幼苗叶片高度黄化, 根的形成和幼苗
生长受到严重抑制, 而 A3p::ORF-B08 转基因突变

图 7 山梨醇胁迫下各基因型拟南芥种子的相对萌发率
Fig. 7 Relative germination rate of various genotypes of
Arabidopsis under different sorbitol concentrations
标以不同小写字母者在 P < 0.05水平上差异显著。
Bars superscribed by different letters are significantly different at
the 0.05 probability level.

体与野生型相似, 叶片仅轻度黄化, 大多数幼苗生
长势良好; 35S::ORF-WT 转基因植株幼苗生长未受
明显影响。表明拟南芥 129B08/nced3突变体对山梨
醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性, 异位表达花生
AhNCED1 基因能恢复(revert)该突变体对山梨醇的
超敏性, 提高转基因拟南芥的耐渗透胁迫能力。
3 讨论
NCED是高等植物 ABA生物合成途径的限速酶,
笔者克隆了花生 AhNCED1 基因, 脱水胁迫明显增强
花生叶片中 AhNCED1 基因表达[1], 与在玉米[8]、番
茄 [9]、菜豆 [10]、豇豆 [11]、鳄梨 [12]、拟南芥 [13]、柑
橘[15]、柱花草[17]、玫红岩蔷薇[21]等植物中观察的结
果一致。AtNCED3是调控水分胁迫下拟南芥中 ABA
生物合成的关键基因[13,24], atnced3 突变体[13,23,25,29]
在水分胁迫时, 植株不能累积 ABA, 对水分胁迫超
敏感。本研究显示, 拟南芥 129B08/nced3 突变体对
外源 ABA 的敏感性下降 , 而异位表达花生
AhNCED1 提高了转基因拟南芥对外源 ABA 的敏感
性(图 6)。
第 9期 万小荣等: 含异位表达花生 AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1447



图 8 异位表达花生 AhNCED1 提高转基因拟南芥耐渗透胁迫能力
Fig. 8 Ectopic expression of peanut AhNCED1 confers improved osmotic stress tolerance of transgenic Arabidopsis plants induced by
300 mmol L1 sorbitol

烟草和番茄中异位表达番茄LeNCED1基因, 均提
高了转基因植物的内源 ABA水平[30]。拟南芥中异位表
达水稻 OsNCED3 基因[25]、拟南芥中过表达(over-ex-
pression) AtNCED3 基因 [31]、烟草中过表达菜豆
PvNCED1 基因[31]、烟草中过表达柱花草 SgNCED1 基
因[32-33], 均提高了转基因植物的内源 ABA 水平和水分
胁迫抗性。本研究表明, 在山梨醇胁迫下, 129B08/
nced3 突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,
而 A3p::ORF-B08 转基因拟南芥种子的相对萌发率
与野生型的相当, 显著高于 129B08/nced3突变体的,
且 300 mmol L–1山梨醇渗透胁迫下 35S::ORF-WT转
基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的
(图 7)。在 300 mmol L–1山梨醇胁迫下, 129B08/nced3
突变体幼苗叶片高度黄化, 根的形成和幼苗生长受
到严重抑制, 而 A3p::ORF-B08 转基因突变体与野
生型相似, 叶片仅轻度黄化, 幼苗生长势良好(图 8);
35S::ORF-WT 转基因植株幼苗生长未受明显影响,
在 400 mmol L–1山梨醇渗透胁迫下, 其萌发(图 7)生
长开始受明显抑制 , 幼苗叶片明显黄化(资料未给
出)。这些结果说明, 拟南芥 129B08/nced3突变体对
山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性 , 花生
AhNCED1 基因转入能恢复该突变体对山梨醇的超
敏性 , 提高转基因拟南芥的耐渗透胁迫能力 , 与
Iuchi等[13]和 Ruggiero等[29]研究过表达 AtNCED3基
因互补(complement)拟南芥 atnced3突变体对脱水胁
迫的超敏性、Hwang 等[25]研究异位表达 OsNCED3
基因互补 129B08/nced3突变体对干旱胁迫的超敏性
等实验结果相一致。这些研究对于了解农作物响应
干旱胁迫的分子机制、通过植物基因工程提高农作
物抗旱性及农作物抗旱育种具有重要的理论意义和
深远的应用前景。
4 结论
成功构建了 CaMV 35S启动子和拟南芥 AtNCE-
D3 基因启动子(AtNCED3p)驱动花生 AhNCED1 基
因的两个植物双元表达载体 p35S::ORF和 pAtNCE-
D3p::ORF, 分别转化野生型和 129B08/nced3突变体
拟南芥, 获得 35S::ORF-WT 和 A3p::ORF-B08 转基
因植株。转基因拟南芥对外源 ABA的敏感性提高。
拟南芥 129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子
渗透胁迫有超敏性, 转基因能恢复该突变体对山梨
醇的超敏性, 提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。
References
[1] Wan X R, Li L. Molecular cloning and characterization of a de-
hydration-inducible cDNA encoding a putative 9-cis-epoxy-
carotenoid dioxygenase in Arachis hypogaea L. DNA Seq, 2005,
16: 217223
[2] Yan M-L(严美玲), Li X-D(李向东), Jiao Y-L(矫岩林), Wang
L-L(王丽丽). Identification of drought resistance in different
peanut varieties. J Peanut Sci (花生学报), 2004, 33(1): 812 (in
Chinese with English abstract)
[3] Zeevaart J A D. Abscisic acid metabolism and its regulation. In:
Hooykaas P J J, Hall M A, Libbenga K R, eds. Biochemistry and
Molecular Biology of Plant Hormones. Amsterdam: Elsevier
Science, 1999. pp 189207
[4] Nambara E, Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and
catabolism. Annu Rev Plant Biol, 2005, 56: 165185
[5] Taylor I B, Sonneveld T, Bugg T D H, Thompson A J. Regulation
and manipulation of the biosynthesis of abscisic acid, including
the supply of xanthophyll precursors. J Plant Growth Regul,
2005, 24: 253273
[6] Kende H, Zeevaart J A D. The five classical plant hormones.
Plant Cell, 1997, 9: 11971210
1448 作 物 学 报 第 36卷

[7] Koornneef M, Leon-Kloosterziel K M, Schwartz S H, Zeevaart J
A D. The genetic and molecular dissection of abscisic acid
biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis. Plant
Physiol Biochem, 1998, 36: 8389
[8] Tan B C, Schwartz S H, Zeevaart J A D, McCarty D R. Genetic
control of abscisic acid biosynthesis in maize. Proc Natl Acad Sci
USA, 1997, 94: 1223512240
[9] Burbidge A, Grieve T, Jackson A, Thompson A, Taylor I B.
Structure and expression of a cDNA encoding a putative ne-
oxanthin cleavage enzyme (NCE), isolated from a wilt-related
tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) library. J Exp Bot, 1997,
47: 21112112
[10] Qin X, Zeevaart J A D. The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reac-
tion is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in
water-stressed bean. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96:
1535415361
[11] Iuchi S, Kobayashi M, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. A
stress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase in-
volved in abscisic acid biosynthesis under water stress in
drought-tolerant cowpea. Plant Physiol, 2000, 123: 553562
[12] Chernys J T, Zeevaart J A D. Characterization of the 9-cis ep-
oxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of
abscisic acid biosynthesis in avocado. Plant Physiol, 2000, 124:
343353
[13] Iuchi S, Kobayashi M, Taji T, Naramoto M, Seki M, Kato T, Ta-
bata S, Kakubari Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.
Regulation of drought tolerance by gene manipulation of
9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, a key enzyme in abscisic
acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant J, 2001, 27: 325333
[14] Soar C J, Speirs J, Maffei S M, Loveys B R. Gradients in
stomatal conductance, xylem sap ABA and bulk leaf ABA along
canes of Vitis vinifera cv Shiraz: biochemical and molecular bio-
logical evidence indicating their source. Funct Plant Biol, 2004,
31: 659669
[15] Rodrigo M J, Alquezar B, Zacarias L. Cloning and characteriza-
tion of two 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase genes, differen-
tially regulated during fruit maturation and under stress condi-
tions, from orange (Citrus sinensis L. Osbeck). J Exp Bot, 2006,
57: 633643
[16] Destefano-Beltran L, Knauber D, Huckle L, Suttle J C. Effects of
postharvest storage and dormancy status on ABA content, me-
tabolism, and expression of genes involved in ABA biosynthesis
and metabolism in potato tuber tissues. Plant Mol Biol, 2006, 61:
687697
[17] Yang J, Guo Z. Cloning of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase
gene (SgNCED1) from Stylosanthes guianensis and its expression
in response to abiotic stresses. Plant Cell Rep, 2007, 26:
13831390
[18] Zhu C, Kauder F, Romer S, Sandmann G. Cloning of two indi-
vidual cDNAs encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase from
Gentiana lutea, their tissue-specific expression and physiological
effect in transgenic tobacco. J Plant Physiol, 2007, 164: 195204
[19] Kraft M, Kuglitsch R, Kwiatkowski J, Frank M, Grossmann K.
Indole-3-acetic acid and auxin herbicides up-regulate 9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase gene expression and abscisic acid
accumulation in cleavers (Galium aparine): interaction with eth-
ylene. J Exp Bot, 2007, 58: 14971503
[20] Qin X, Yang S H, Kepsel A C, Schwartz S H, Zeevaart J A D.
Evidence for abscisic acid biosynthesis in Cuscuta reflexa, a
parasitic plant lacking neoxanthin. Plant Physiol, 2008, 147:
816822
[21] Munné-Bosch S, Falara V, Pateraki I, López-Carbonell M, Cela J,
Kanellis A K. Physiological and molecular responses of the iso-
prenoid biosynthetic pathway in a drought-resistant Mediterra-
nean shrub, Cistus creticus exposed to water deficit. J Plant
Physiol, 2009, 166: 136145
[22] Leng P(冷平), Zhang G-L(张光连), Li X-X(李祥欣), Wang
L-H(王良合), Zheng Z-M(郑仲明). Cloning of 9-cis-epoxy-
carotenoid dioxygenase (NCED) gene encoding a key enzyme
during abscisic acid (ABA) biosynthesis and ethylene production
regulated by ABA in detached young persimmon calyx. Chin Sci
Bull (科学通报), 2009, 54(14): 20822088 (in Chinese)
[23] Wan X R, Li L. Regulation of ABA level and water-stress toler-
ance of Arabidopsis by ectopic expression of a peanut 9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase gene. Biochem Biophys Res Com-
mun, 2006, 347: 10301038
[24] Tan B C, Joseph L M, Deng W T, Liu L, Li Q B, Cline K,
McCarty D R. Molecular characterization of the Arabidopsis
9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene family. Plant J, 2003,
35: 4456
[25] Hwang S G, Chen H C, Huang W Y, Chu Y C, Shii C T, Cheng W
H. Ectopic expression of rice OsNCED3 in Arabidopsis increases
ABA level and alters leaf morphology. Plant Sci, 2010, 178:
1222
[26] Rosso M G, Li Y, Strizhov N, Reiss B, Dekker K, Weisshaar B.
An Arabidopsis thaliana T-DNA mutagenized population (GA-
BIKat) for flanking sequence tag-based reverse genetics. Plant
Mol Biol, 2003, 53: 247259
[27] Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agro-
bacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16: 735743
[28] Unfried I, Stocker U, Gruendler P. Nucleotide sequence of the
第 9期 万小荣等: 含异位表达花生 AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1449


18S rRNA gene from Arabidopsis thaliana (Co1-0). Nucl Acids
Res, 1989, 17: 7513
[29] Ruggiero B, Koiwa H, Manabe Y, Quist T M, Inan G, Saccardo F,
Joly R J, Hasegawa P M, Bressan R A, Maggio A. Uncoupling
the effects of abscisic acid on plant growth and water relations.
Analysis of sto1/nced3, an abscisic acid-deficient but salt
stress-tolerant mutant in Arabidopsis. Plant Physiol, 2004, 136:
31343147
[30] Thompson A J, Jackson A C, Parker R A, Morpeth D R, Burbidge
A, Taylor I B. Ectopic expression of a tomato 9-cis-epoxycaro-
tenoid dioxygenase gene causes over-production of abscisic acid.
Plant J, 2000, 23: 363374
[31] Qin X, Zeevaart J A D. Overexpression of a 9-cis-epoxy- carote-
noid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increases
abscisic acid and phaseic acid levels and enhances drought toler-
ance. Plant Physiol, 2002, 128: 544551
[32] Zhang Y, Yang J, Lu S, Cai J, Guo Z. Overexpressing SgNCED1
in tobacco increases ABA level, antioxidant enzyme activities,
and stress tolerance. J Plant Growth Regul, 2008, 27: 151158
[33] Zhang Y, Tan J, Guo Z, Lu S, He S, Shu W, Zhou B. Increased
abscisic acid levels in transgenic tobacco over-expressing 9
cis-epoxycarotenoid dioxygenase influence H2O2 and NO pro-
duction and antioxidant defences. Plant Cell Environ, 2009, 32:
509519








信息索引
1475 新书推介——《2009中国生物技术发展报告》
1497 欢迎订阅 2011年《中国农业生态学报》
1511 欢迎订阅 2011年《农产品质量与安全》
1518 欢迎订阅 2011年《大豆科学》
1528 欢迎订阅 2011年《农业科技通讯》
1537 欢迎订阅 2011年《花生学报》
1558 欢迎订阅 2011年《植物营养与肥料学报》
1584 欢迎订阅 2011年《中国农业科学》中、英文版
1595 欢迎订阅 2011年《中国水稻科学》、《水稻科学（英文版）》
1604 新书推介——《表皮细胞实验指南》

ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ