全 文 ：第 34 卷 第 3 期 浙 江 林 业 科 技 Vol. 34 No.3
2 0 1 4 年 5 月 JOUR. OF ZHEJIANG FOR. SCI. & TECH. May, 2 0 1 4
文章编号：1001-3776（2014）03-0023-05

普陀樟 SRAP-PCR 反应体系的建立

吕昕谣1，赵 颖2，赵国淼1，曾燕如1*，宋绪忠3，杨 华3
（1. 浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300；
2. 浙江省舟山市林业科学研究院，浙江 舟山 316000；3. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

摘要：以舟山群岛的普陀樟（Cinnamomum japonicum var. chenii）新鲜叶片为实验材料，采用L16（45）正交试验
设计，对影响普陀樟SRAP-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量 5 因素组合进
行了筛选。结果表明：适于普陀樟的SRAP-PCR反应体系（20 μL）为 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U
Taq DNA聚合酶、0.4μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，该体系位点清晰，扩增稳定；利用该反
应体系从 100 对SRAP引物组合中筛选出多态性好的引物 24 对。
关键词：普陀樟；SRAP；体系建立；引物筛选
中图分类号：S718.46 文献标识码：A

Establishment of SRAP-PCR Reaction System in
Cinnamomum japonicum var. chenii

LU Xin-yao1，ZHAO Ying2，ZHAO Guo-miao1，ZENG Yan-ru1*，SONG Xu-zhong3，YANG Hua3
（1. Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Zhoushan
Forestry Institute of Zhejiang, Zhoushan 316000, China; 3. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

Abstract: With fresh leaves, orthogonal test of L16（45）was conducted on fresh leaves of Cinnamomum japonicum var. chenii to establish SRAP-PCR
reaction system with five factors ( Mg2+, dNTPs, Taq DNA polymerase, primer and DNA template ). The result demonstrated that 20 μL SRAP-PCR
reaction system including 2.5 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTPs, 1.5 U Taq DNA polymerase, 0.4 μmol/L primer, 10 ng template DNA and 2 μL
10×PCR buffer was established, with advantages of clear loci and stable amplification. With the established system, 24 pairs of primers with
polymorphic loci were screened from 100 pairs of SRAP primers.
Key words: Cinnamomum japonicum var. chenii; SRAP; system optimization; screening primers

普陀樟（Cinnamomum japonicum var. chenii）系樟科樟属常绿乔木，为舟山海岛特有濒危植物。集中分布在
舟山市普陀区的普陀山、朱家尖及其毗邻的悬水小岛上，除此之外的其他区域均未见有该树种的天然分布[1]。
普陀樟木材坚实致密，纹理通直，耐腐，耐水湿，是优良的用材树种；且根系发达，抗风性强，且兼具耐盐碱、
耐干旱瘠薄等特性，适应性广，非常适宜沿海地区栽种。而目前却缺乏对野生普陀樟致濒原因等各方面的足够
了解，难以实施有效的遗传保育。
相关序列扩增多态性（Sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP）是Li和Quiros[2]开发的分子标记技
术，该技术通过独特的引物设计对开放阅读框（Open reading frames, ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种
收稿日期：2014-01-10；修回日期：2014-04-21
基金项目：浙江省科技厅项目（2011C22040）
作者简介：吕昕谣（1990－），女，河北廊坊人，硕士生，从事森林培育研究。*通信作者。


24 浙 江 林 业 科 技 34 卷
的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性[3]。Ferriol等[4]在观赏南瓜（Cucurbita moschata）中利用SRAP
和AFLP两种分子标记进行遗传多样性实验，结果与AFLP标记相比，SRAP标记结果更接近其性状变异。Budak[5]
等对野牛草（Buchloe dactyloides）进行ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和SRAP等 4 种分子标记的遗传多样性研究，结果SRAP表现出更
丰富的遗传多样性，是区分能力最强的标记。与其他分子标记相比，SRAP标记技术具有重复性好、多态性高、
操作简便、共显性、易测序、引物具有通用性等优越性，已逐渐成为种质资源研究的有效技术，近年来多应用
于遗传多样性分析[5]、遗传图谱构建[6]以及重要性状标记[7]等诸多领域。
目前，有关普陀樟分子标记方面的研究尚未见报道。本研究建立了普陀樟的 SRAP-PCR 反应体系，可为进
一步开展普陀樟的遗传多样性及相关遗传研究提供技术支撑，也可为普陀樟基因组分析、分子标记辅助育种等
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜健康的普陀樟叶片样品 7 份采
自舟山群岛不同岛屿，带回实验室后清
水洗净，放置－40℃冰箱保存待用。
表 1 SRAP 引物序列
Table 1 Sequences of SRAP primers
正向引物 引物序列 反向引物 引物序列
F1 TGAGTCCAAACCGGATA R1 GACTGCGTACGAATTAAT
F2 TGAGTCCAAACCGGAGC R2 GACTGCGTACGAATTTGC
F3 TGAGTCCAAACCGGAAT R3 GACTGCGTACGAATTGAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R4 GACTGCGTACGAATTTGA
F5 TGAGTCCAAACCGGAAG R5 GACTGCGTACGAATTAAC
F6 TGAGTCCAAACCGGTAA R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F7 TGAGTCCAAACCGGTCC R7 GACTGCGTACGAATTCAA
F8 TGAGTCCAAACCGGTGC R8 GACTGCGTACGAATTCTG
F9 TGAGTCCAAACCGGTGT R9 GACTGCGTACGAATTCGA
F10 TGAGTCCAAACCGGTTG R10 GACTGCGTACGAATTCCA
Taq DNA 聚合酶（5U/μL）购自上
海申能博彩生物科技有限公司；dNTP、
DNA Marker（Fermentas）、SRAP 引物
（表 1）等均购自生工生物工程（上海）
有限公司。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测 采用改良CTAB方法结合TNE的方法[8]提取普陀樟基因组DNA。提取的DNA用
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用紫外分光光度计（NanoDrop 1000 Spectrophotometer，美国）测定
A260、A280，并计算两者的比值，以检验DNA的质量，并根据测定的浓度将DNA稀释到 10 ng/μL，－20℃保存备
用。
1.2.2 SRAP-PCR反应体系的建立 基于刘浩凯等优化的适用于榧树的SRAP分析方法（含PCR产物电泳）[9]采
用L16（45）正交试验设计，对可能影响普陀樟SRAP-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物（F2/R4）
和模板DNA用量进行 5 因素 4 水平正交试验（表 2）。反应总体积为 20 μL，实验重复 4 次，以确定最佳体系组
合。
表 2 SRAP-PCR正交设计试验L16（45）
Table 2 L16（45）orthogonal design for SRAP-PCR reaction
因素和水平 因素和水平 编号
Mg2+
/mmol·L－
1
dNTPS
/mmol·L－
1
Taq 酶
/U
引物
/μmol·L－1
模板 DNA
/ng
编号
Mg2+
/mmol·L－
1
dNTPS
/mmol·L－
1
Taq 酶
/U
引物
/μmol·L－1
模板 DNA
/ng
1 1.5 0.1 0.5 0.1 10 9 2.5 0.1 2.0 0.3 20
2 1.5 0.2 1.0 0.2 20 10 2.5 0.2 1.5 0.4 10
3 1.5 0.3 1.5 0.3 30 11 2.5 0.3 1.0 0.1 40
4 1.5 0.4 2.0 0.4 40 12 2.5 0.4 0.5 0.2 30
5 2.0 0.1 1.5 0.2 40 13 3.0 0.1 1.0 0.4 30
6 2.0 0.2 2.0 0.1 30 14 3.0 0.2 0.5 0.3 40
7 2.0 0.3 0.5 0.4 20 15 3.0 0.3 2.0 0.2 10
8 2.0 0.4 1.0 0.3 10 16 3.0 0.4 1.5 0.1 20
反应程序为 94℃预变性 5 min；共 5 个循环，每个循环 94℃变性 45s，35℃退火 45s，72℃延伸 1 min；随
后 35 个循环，每个循环 94℃变性 45 s，50℃退火 45s，72℃延伸 1 min；最后 72℃延伸 5 min，4℃保存。扩增


3 期 吕昕谣，等：普陀樟 SRAP-PCR 反应体系的建立 25
产物加入 3 μL Loading dye 混合均匀，以 3 000 bp DNA Ladder 为参照标准，采用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进
行电泳，160V 电泳 85 min。电泳结束后采用银染法进行染色，显色后将凝胶置于可见光灯箱上观察电泳结果，
并拍照保存。
随机选取 F6/R7 和 F6/R8 两个引物组合，利用筛选出的普陀樟最优体系，对 30 份普陀樟 DNA 材料进行 PCR
扩增，检测反应体系的稳定性。
利用优化设计确定的 SRAP-PCR 的最佳反应体系，用表 1 所示的 10 个正向引物和 10 个反向引物组合的 100
对引物，对 4 个不同普陀樟样品进行引物组合筛选。
2 结果与分析
2.1 普陀樟基因组 DNA 的提取
经紫外分光光度计测定，8 份普陀樟DNA样品OD260/OD280值均在 1.8 ~ 2.0；1%琼脂糖电泳检测结果（图 1）
显示，DNA条带完整清晰，无拖尾现象，符合分子标记扩增对DNA的要求。

图 1 普陀樟 DNA 的琼脂糖电泳检测图
Figure 1 Argarose electrophoretogram of genomic DNAs extracted in C. japonicum var. chenii
2.2 SRAP-PCR 反应体系的优化
从正交实验结果可以看出，不同的PCR组份组合扩增效果具有明显的差异，其中 1 ~ 4、7、8 号扩增效果不
好，11、12、15、16 号位点较清楚，但位点数少，均予以淘汰（图 2）。仔细观察发现，9、10 号比 13、14 号
扩增的位点数多，而且更加清晰。直观分析 10 号组合为佳，9 号组合次之，二者间无明显差异。虑到 9 号组合
中 Taq 酶的用量为 2 U，因此本着经济有效的原则，最终确定 10 号组合为最理想的SRAP-PCR反应体系，即
20 μL PCR体系包括 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、10 ng模板
DNA、2 μL 10×PCR buffer。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M: marker；1 ~ 16：正交试验的 16 个组合；引物对：F2/R4
图 2 正交实验产物电泳图
Figure 2 Electrophoretogram of PCR products based on the orthogonal design
2.3 SRAP-PCR 体系的稳定性检测及引物筛选
SRAP-PCR 体系的稳定性检测表明，扩增谱带清晰而稳定，位点数多，且多态性丰富（图 3），说明建立
的反应体系具有良好的稳定性，适合于普陀樟的 SRAP-PCR 分析。利用该反应体系，从 100 对引物组合（表 1）
中筛选出 20 对扩增产物清晰、多态性较好的引物（F2R7、F3R7、F4R7、F5R7、F6R7、F8R7、F9R7、F5R1、
F5R8、F6R8、F9R6、F2R1、F4R2、F5R1、F5R2、F3R3、F4R3、F6R4、F10R4、F5R5），用于普陀樟后续遗
传多样性分析。




26 浙 江 林 业 科 技 34 卷

500bp

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图 3 SRAP 反应体系稳定性检测（引物对：上：F6R7；下：F6R8）
Figure 3 Testing of the SRAP reaction (Primer pairs: F6R7 (up) and F6R8(down))
3 结论与讨论
SRAP 分子标记是基于 PCR 反应的一种标记技术，它的结果受到体系中各个因素的影响，且各因素之间还
存在相互作用，因此各因素之间的配比只有达到最佳状态时，才能得到稳定、可重复的扩增结果。不同植物适
合的 SRAP 反应体系不同，所以需要根据物种的不同对反应体系进行优化。
本实验采用了一次性正交实验设计筛选反应体系，并对该体系稳定性进行了检测及初步应用，结果显示扩
增位点清晰稳定，多态性好，重复性强，说明本研究建立的普陀樟 SRAP-PCR 体系稳定可靠、扩增效率高，为
日后普陀樟基因组分析、分子标记辅助育种、遗传多样性研究等奠定了基础。

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信息
浙江省林业厅、浙江省林学会分别荣获
中国林学会“先进挂靠单位”、“先进学会”

中国林学会第十一次全国会员代表大会暨第三届中国林业学术大会于 2014 年 1 月 16－17 日在北京召开，
会议颁发了第五届梁希林业科学技术奖、第四届梁希科普奖、第十二届林业青年科技奖，表彰了优秀学会干部、
先进学会、先进挂靠单位。浙江省林业厅、浙江省林学会分获中国林学会“先进挂靠单位”、“先进学会”表
彰。
10 年来，浙江省林学会在浙江省林业厅的正确领导和大力支持下，坚持“三服务一加强”的工作定位，积
极发挥学会科技知识集聚优势，充分调动各市林学会和各专业委员会的积极性，在学术交流、科学普及、科技
奖励、期刊编辑、组织建设等方面取得新进展：连续承办了 10 届林业科技周活动，累计召开学术报告会、研讨
会 80 余次，组织送科技下乡 2 700 场次，发放资料 20 万份，培训林农 8 万人次，参加活动总人数达 21 万人次；
承担政府职能转移，连续开展了十三届“科技兴林奖”评选，奖励科技成果 654 项，鉴定科技成果 40 项；核发
绿化造林设计、施工、监理资质总计 538 家，提高造林绿化质量；编辑出版学会会刊《浙江林业科技》，全年
发行量达 7 200 册；加强学会组织建设，至今已成立专业委员会 11 个，发展个人会员 1 544 名、团体会员 43 家，
已成为林业科技工作者之家。
浙江省林业厅科技处、浙江省省林学会