全 文 :新 疆 农 业 大 学 学 报 2013,36(5):377~382
Journal of Xinjiang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2013)05-0377-06
用SRAP分子标记分析新疆梨栽培品种遗传多样性
玉苏甫·阿不力提甫1,阿依古丽·铁木儿1,罗淑萍2,李 疆1
(1.新疆农业大学 园艺学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学 农学院,乌鲁木齐 830052)
摘 要: 利用序列相关扩增多态性分子标记SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)技术对新疆梨
40个栽培品种进行遗传多态性的研究。由http//genome.cs.mtu.edu/sas.html查得上游引物12条、下游引物14
条,进行组合扩增筛选。对其中特异性强、稳定性好的10对引物(me2+em1、me3+em2、me5+em14、me6+em2、
me7+em3、me7+em14、me10+em1、me11+em1、me11+em3、me11+em10)进行SRAP分析。10对引物共可扩增
出131个条带,其中127条为多态性位点,平均每组引物扩增出13.1条多态性带。在物种水平上,平均多态性条带
比率为96.95%。通过SRAP遗传关系聚类图聚类分析表明,在遗传相似系数0.625为标准40个梨种质分为3大
类群:第一大类群中包括2份种质(砀山梨、奎克阿木特2号);第二大类群中包括6份种质(黄金、京白×砀山、白
皮砀山、麻梨、新梨7号、句句梨);第三类群中包括其余32份种质。
关键词: 梨;SRAP;聚类分析;遗传多态性
中图分类号:S661.2 文献标识码:A
Analysis on Genetic Diversity of Xinjiang Pears
Based on the SRAP Marker
Yusufu Abulitifu1,Ayiguli Tiemuer1,LUO Shu-ping2,LI Jiang1
(1.Colege of Forestry and Horticulture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,Chi-
na;2.Colege of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)
Abstract: This study was carried out to reveal the genetic diversity of 40cultivars of Xinjiang pears by
use of molecular marker technique SRAP(sequence-related amplified polymorphism).The forward primers
and revorse primers were composed and amplified to be screened,among which 10pairs of primers with
strong specificity and stability were analyzed by SRAP.Altogether 131bands were amplified from the 10
pairs of primers,among which there were 127bands with polymorphic loci.The total of 13.1bands with
polymorphism were amplified from each group of primers.At species level,the average percentage of poly-
morphic bands in al primers was 96.95%.SRAP genetic relationship dendrogram Cluster analysis showed
that 40pear germplasm based on the 0.625genetic similarity coefficient is divided into three categories:
first category group included 2germplasm;the second category included 6germplasm;the third category
included 32germplasm.
Key words: pear;SRAP;cluster analysis;genetic diversity
梨是蔷薇科(Rosaceae)、梨亚科(Pomaceae)、梨
属(Pyrus L.)植物,分布于欧、亚及北美洲,约有60
余种[1-3]。新疆梨树种类较多,为中国果树栽培提
供了丰富的种质资源[4]。近年来,分子标记技术和
DNA指纹分析技术已广泛应用于农作物的种质鉴
定。RAPD、ISSR、AFLP技术已被大量的运用在梨
品种的遗传研究上[5,6]。序列相关扩增多态性(se-
quence related complified polymorphism,SRAP)标
记具有操作简单、多态性高、重复性好等特点,其目
标是检测基因组中的可阅读框(ORF)的多态性,是
收稿日期:2013-04-09
基金项目:新疆农业大学校前期资助课题(XJAU201022);新疆维吾尔自治区果树学重点学科基金资助
通讯作者:李 疆,E-mail:lijiangxj@163.com
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一种无需任何序列信息即可直接PCR扩增的新型
分子标记技术[7,8],该标记已经成功应用于多种植
物中[9-14]。
本研究收集新疆农业科学院轮台国家果树资源
圃40份梨种质资源材料以SRAP分子标记分析其
遗传多样。以期为品种鉴定、保护及高效率地开展
杂交育种提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
40份梨种质资源材料于2012年4月21日采
自新疆农业科学院轮台国家果树资源圃(表1)。
1.2 方 法
1.2.1 DNA的提取
采用改良的CTAB法[15]分别提取供试的40份
新疆梨栽培品种材料嫩叶中的基因组DNA,用1%
琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,紫外分光光度计
测定浓度及纯度,置于-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 引物筛选
由http//genome.cs.mtu.edu/sas.html查得
的上游引物12条、下游引物14条。自由组合成
168对引物组合进行筛选。引物由上海生工生物工
程股份有限公司合成。扩增得到重复性好、扩增条
带清晰且多态性丰富的引物组合10对(表2)。
1.2.3 SRAP-PCR反应体系的建立
PCR采用25μL反应体系:每25μL的PCR反
应体系中包括ddH2O 19.6μL,10×Taq buffer
2.5μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,上游引物和下
游引物各0.5μL,0.4μL Taq聚合酶(2.5U/μL),
1μLDNA模板。
PCR扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变
性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,共5个
循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸
1min,共35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
扩增产物检测参照Bassam等的方法[16],用6%聚
丙烯酰胺凝胶,200V电压条件下,在1×TBE缓冲
液中电泳1h,银染检测,数码相机拍照记录。
1.3 数据统计分析
DNA条带及指纹图谱记录[17]:PCR扩增产物
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同分子量大小的
DNA片段分布于聚丙烯酰胺泳道不同的位置,根据
同一水平线上不同材料相同DNA片段标记的有无
来显示多态性的变化,人工读带时只记录易于辨认
的条带,排除模糊不清的条带。在相应位置,以“1”
和“0”分别代表某个等位基因扩增出DNA条带的
出现和缺失,将这些图谱转换为由“1”和“0”组成的
表1 分子标记供试梨品种资源
Table 1 The varieties resources for molecular marker tested
pear
序号 品种名称 原始引种地 材料收集渠道
1 砀山梨 安徽砀山 引进品种
2 黄金 韩国 引进品种
3 库尔勒黄酸梨 新疆库尔勒 地方品种
4 京白×砀山 新疆库车县 地方品种
5 奎克阿木特2号 新疆库车县 地方品种
6 矮梨 辽宁兴城 引进品种
7 红香梨 新疆和田 地方品种
8 也历克阿木特 新疆叶城县 地方品种
9 棋盘梨 新疆叶城县 地方品种
10 白皮砀山 安徽砀山 引进品种
11 早金酥 辽宁 引进品种
12 霍城冬黄梨 新疆霍城县 地方品种
13 黄金梨 日本 引进品种
14 麻梨 新疆库车县 地方品种
15 新梨7号 塔里木大学选育 选育品种
16 八月红 新疆库尔勒 地方品种
17 库车阿木特 新疆库车县 地方品种
18 沙01 新疆库尔勒 地方品种
19 句句梨 新疆库尔勒 地方品种
20 绿宝石 安徽砀山 选育品种
21 夏脆梨 新疆伊犁 地方品种
22 雪花
中国农科院果树研
究所
选育品种
23 红香酥
中国农科院郑州果
树研究所
选育品种
24 褐色句句梨 新疆库车县 地方品种
25 黄句句梨 新疆库车县 地方品种
26 香梨 新疆库尔勒市 地方品种
27 二秋子黄梨 新疆霍城县 地方品种
28 宝岛新世纪 日本 选育品种
29 霍城句句梨 新疆霍城县 地方品种
30 塔西阿木特 新疆喀什 地方品种
31 阿克苏句句梨 新疆阿克苏 地方品种
32 沙02 新疆库尔勒 地方品种
33 轮台句句梨 新疆轮台县 地方品种
34 沙03 新疆库尔勒 地方品种
35 伊犁红句句梨 新疆伊犁 地方品种
36 喜水 日本 选育品种
37 莎车耐西普特 新疆莎车县 地方品种
38 八月梨 新疆霍城县 地方品种
39 大果奎克阿木特 新疆喀什 地方品种
40 奎克阿木特1号 新疆库车县 地方品种
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第5期 玉苏甫·阿不力提甫,等:用SRAP分子标记分析新疆梨栽培品种遗传多样性
字串,即构成数字指纹,用于区别各个品种。应用
NTSYS-pc(Version 2.1)软件处理并采用非加权平
均法(UPG-MA)进行聚类分析,得到遗传相似系
数,根据遗传相似系数建立聚类图。
表2 梨SRAP标记引物序列
Table 2 The primer sequence for SRAP markers
序号 引物组合 序 列 序号 引物组合 序 列
1 me2+em1
TGAGTCCAAACCGGTAA
GACTGCGTACGAATTGAC
6 me7+em14
TGAGTCCAAACCGGAAT
GACTGCGTACGAATTCCA
2 me3+em2
TGAGTCCAAACCGGTCC
GACTGCGTACGAATTTGA
7 me10+em1
TGAGTCCAAACCGGTGC
GACTGCGTACGAATTGAC
3 me5+em14
TGAGTCCAAACCGGAGC
GACTGCGTACGAATTCCA
8 me11+em1
TGAGTCCAAACCGGAGA
GACTGCGTACGAATTGAC
4 me6+em2
TGAGTCCAAACCGGACC
GACTGCGTACGAATTTGA
9 me11+em3
TGAGTCCAAACCGGAGA
GACTGCGTACGAATTGAT
5 me7+em3
TGAGTCCAAACCGGAAT
GACTGCGTACGAATTGAT
10 me11+em10
TGAGTCCAAACCGGAGA
GACTGCGTACGAATTAAC
2 结果与分析
2.1 DNA的提取结果
采用改良CTAB法提取DNA,电泳图谱清晰,
DNA主带完整、纯度高,能够满足后续分子生物学
试验要求(图1)。
图1 改良CTAB法提取的部分梨品种DNA电泳结果
Fig.1 Part of pear cataphoresis results of DNA by improved
CTAB method
2.2 引物的筛选
用40个梨品种对168个SRAP引物组合进行
了筛选,共得到30对表现良好的SRAP引物组合,
30对引物组合中挑选出扩增稳定、重复性好、扩增
条带清晰且多态性丰富的10对引物组合。这10个
引物组合共产生131条清晰条带,平均每个引物组
合产生13.1条,其中127条表现多态性,平均每对
引物组合产生12.7条多态性条带,梨栽培品种间多
态性条带最多的引物组合是 me3+em2、me5+
em14、me6+em2、me7+em3、me7+em14、me10+
em1、me11+em1。引物组合所产生的多态性条带
在10~15条,多态性比率含量变幅为84.61%~
100%,平均多态性百分率为96.95%(表3)。通过
10对引物组合进行PCR扩增、电泳获得10个电泳
图谱。图2和图3为40个梨品种经引物 me2+
em1和 me11+em3扩增在6%的聚丙烯酰胺凝胶
电泳所得图谱。
表3 SRAP分析的扩增结果
Table 3 The amplified results of SRAP analysis
引物组合
扩增条
带数
多态性
条带数
多态性
比例(%)
me2+em1 14 13 92.85
me3+em2 15 15 100
me5+em14 13 13 100
me6+em2 13 13 100
me7+em3 10 10 100
me7+em14 10 10 100
me10+em1 14 14 100
me11+em1 14 14 100
me11+em3 13 11 84.61
me11+em10 15 14 93.33
合 计 131 127 96.95
2.3 遗传相似性与聚类分析
根据凝胶电泳图谱中条带的出现与否进行对应
的“1”和“0”记录,利用NTSYS2-pc 2.10软件进行
计算分析,按照 UPGMA方法聚类,构建不同品种
(系)间的亲缘关系树状图。供试40份材料的遗传
相似系数在0.59~0.81(图4)。总体上看,梨品种
之间的亲缘关系相对较接近;其中,遗传相似系数在
0.80水平上莎车耐西普特与八月梨亲缘关系最近;
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0.773水平上雪花与红香酥亲缘关系较近。在遗传
相似系数0.625为标准,可将40份试材分为3大类
群(图4)。
第1个类群包括2份种质:砀山梨和奎克阿木
特2号。
序号对应梨种质材料见表1
图2 引物me2+em1对40个梨品种的扩增结果
Fig.2 Amplification results of primers me2+em1 on 40 pear varieties
序号对应梨种质材料见表1
图3 引物me11+em3对40个梨品种的扩增结果
Fig.3 Amplification results of primers me11+em3 on 40 pear varieties
第2大类群包括6份种质:黄金、京白×砀山、
白皮砀山、新梨7号、麻梨、句句梨。第2大类群又
可以细分为两个亚类。第1亚类包括:黄金、京白×
砀山。第2亚类包括:白皮砀山、新梨7号、麻梨、句
句梨。
第3大类群包括32份种质:库尔勒黄酸梨、早
金酥、棋盘梨、也历克阿木特、八月红、褐色句句梨、
香梨、莎车耐西普特、八月梨、矮梨、黄金梨、红香梨,
大果奎克阿木特、霍城冬黄梨、雪花、红香酥、库车阿
木特、二秋子黄梨、喜水、伊犁红句句梨、沙01、霍城
句句梨、塔西阿木特、奎克阿木特1号、绿宝石、沙
03、夏脆梨、阿克苏句句梨、沙02、宝岛新世纪、轮台
句句梨、红香梨、黄句句梨。第3大类群又可以细分
为两个亚类。第1亚类包括:库尔勒黄酸梨、早金、
棋盘梨、也历克阿木特、八月红、褐色句句梨、香梨、
莎车耐西普特、八月梨、矮梨、黄金梨、红香梨、大果
奎克阿木特、霍城冬黄梨、雪花、红香酥、库车阿木
特、二秋子黄梨、喜水、伊犁红句句梨、沙01、霍城句
句梨、塔西阿木特、奎克阿木特1号、绿宝石、沙03、
夏脆梨、阿克苏句句梨、沙02、宝岛新世纪、轮台句
句梨、红香梨,第2亚类仅有黄句句梨一个品种。
3 结论与讨论
本研究利用10对SRAP引物对40个梨品种进
行了遗传多样性分析,共扩增出131条带,其中多态
性条带127条,多态性比率达到96.95%。对全部
多态性位点进行聚类分析,遗传相似系数在0.59~
0.81。其中,遗传相似系数在0.80水平上莎车耐西
083
第5期 玉苏甫·阿不力提甫,等:用SRAP分子标记分析新疆梨栽培品种遗传多样性
图4 40个梨品种的SRAP遗传关系聚类图
Fig.4 SRAP genetic relationship dendrogram of 40 pear varieties
普特与八月梨亲缘关系最近;0.773水平上雪花与
红香酥两个选育品种的亲缘关系较近。遗传相似系
数在0.625水平上,可将40份供试材料按照亲缘关
系的远近清晰的分为3大类群。
根据分析结果,新疆梨地方品种之间亲缘关系
较近,基本属于第3大类群;同时少部分地方品种与
引种和选育品种间亲缘关系也较近,如地方品种轮
台句句梨和选育品种宝岛新世纪亲缘关系较近;引
进品种黄金和地方品种京白×砀山亲缘关系也
较近。
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