全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10): 1688−1695　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A111); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项; 国家自然科学基金项目
(30700508)
作者简介: 于月华(1981−), 新疆博乐人, 主要从事分子生物学研究。
*
通讯作者(Corresponding authors): 陈明, E-mail: chenming@mail.caas.net.cn; 马有志, E-mail: mayzh@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2008-01-29; Accepted(接受日期): 2008-05-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01688
大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白 GmGβ1的筛选及鉴定
于月华 1,2 陈 明 2,* 李连城 2 徐兆师 2 刘阳娜 2 曲延英 1 曹新有 2
马有志 2,*
(1 新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830052; 2 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实
验室 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081)
摘 要: 从大豆(Glycine max)中克隆了一个与抗逆相关的 DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) 基
因 GmDREB5。功能分析证明, GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选 GmDREB5的互作蛋
白, 采用酵母双杂交系统以 GmDREB5蛋白 73~226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆 cDNA文库, 发现一个
互作蛋白含有保守的 WD40结构域, 与棉花(Gossypium hirsutum)和水稻(Oryza sativa)的 G蛋白 β亚基分别具有 61%
和 52%的同源性, 说明蛋白可能是一类新的大豆 G蛋白 β亚基, 将其定名为 GmGβ1。将 GmDREB5与 GmGβ1共转
化酵母菌株 AH109, 转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上(SD/ trp− leu− his− ade−)正常生长, 而对照不能生长; 同
时, 共转化的酵母能够激活 LacZ 报告基因的表达, 证明 GmGβ1 与 GmDREB5 之间存在相互作用。表达特性分析表
明, GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素 ABA处理的诱导而表达, 证明 GmGβ1不仅参与植物对非生物胁
迫的响应, 同时参与对 GmDREB5蛋白水平的调控。
关键词: 大豆; DREB基因; 酵母双杂交系统; 互作蛋白; G蛋白 β亚基
Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with
GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max)
YU Yue-Hua1,2, CHEN Ming2,*, LI Lian-Cheng2, XU Zhao-Shi2, LIU Yang-Na2, QU Yan-Ying1,
CAO Xin-You2, and MA You-Zhi2,*
(1 Agronomy College, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic
Improvement / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: It is well know that the DREB (dehydration responsive element binding protein) transcription factors in the AP2/ERF
family play important roles in the regulation of plant stress responses, hormone responses and so on. GmDREB5, a novel DREB
homologous gene, was isolated from soybean (Glycine max) and transferred into tobacco in our previous study. To investigate its
function, the T2 transgenic tobacco plants with GmDREB5 and the wild type plants were inoculated on MS medium with 100
mmol L−1 NaCl and 2% PEG, and their phenotypes were observed 40 days later. The results showed that the growth of the trans-
genic plants was more vigorous, and their roots were longer on the medium containing 2% PEG than those of wild type plants.
The germination rate of transgenic plants (75%) was five-fold higher than that of the wild type plants (15%) on the medium con-
taining NaCl, indicating that the over-expression of GmDREB5 improved the tolerances to both drought and salt stresses. The
interacting proteins of GmDREB5 was attained by screening the cDNA library of soybean under drought and identified by
yeast-two-hybrid system. It was found that there existed conservative domain WD40 in the interacting proteins,and which shared
61% and 52% similarity of the amino acid sequence with G protein β subunit in cotton (Gossypium hirsutum) and rice (Oryza
sativa), respectively, The interacting protein with GmDREB5, named GmGβ1, was isolated and proven to be a G protein β subunit
in soybean. The prey vector containing GmGβ1 and bait vector pGBKT7-IIR were co-transformed into yeast AH109, then incu-
bated on mediums with shortage of four components (SD/ trp− leu− his− ade−) for 3–5 days, and the results showed that the thans-
第 10期 于月华等: 大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白 GmGβ1的筛选及鉴定 1689


formants but the contorol grew normally ,and could activate the expression of the downstream reporter gene LacZ, which per-
formed interaction between GmDREB5 and GmGβ1. Further analyses showed that the expression of GmGβ1 gene in soybean was
induced by drought, high salt, cold stresses and ABA treatment. These results suggested that GmGβ1 might involve in not only
response to abiotic stress but also regulation of GmDREB5 by interacting in soybean.
Keywords: Soybean; DREB gene; Yeast two-hybrid system; Interaction protein; G protein β subunit
D R E B 转录因子通过调控启动子区域含有
DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件
的一系列下游基因表达, 在植物逆境胁迫响应中起
着重要的作用 [1]。最近, 从许多植物中相继获得了
DREB基因, 对它们的功能也做了详细的研究。例如,
从山菠菜(Atriplex hortensis) 盐胁迫响应基因中克
隆出DREB基因, AhDREB1, 在烟草中的过表达显著
提高了烟草的耐盐能力[2]。玉米的 DBF1属于 DREB
类转录因子, 研究证明该基因过表达能够显著提高
植物耐盐和抗旱能力[3]。近年, Saleh等[4]用酵母双杂
交方法筛选到 DBF1 的互作蛋白 DIP1(DBF1-inter-
actor protein 1), 含有一个保守的 R3H单链 DNA结
合位点。通过亚细胞定位证明 DBF1与 DIP1的互作对
于 DIP1的核定位是必需的, 而且 DBF1与 DIP1基因
的共转化提高了 DBF1 激活下游基因表达的能力。目
前, 由于对DREB的互作蛋白了解较少, DREB蛋白水
平的调控机制尚不清楚, 进一步发现 DREB 的互作蛋
白对于研究 DREB基因的调控机制具有重要意义。
近年来, 植物 G蛋白(包括 α, β和 γ3个亚基)介
导的信号调控途径已经成为研究细胞信号转导的热
点问题。G 蛋白作为细胞内信号转导网络中的重要
组分, 在光信号转导、调控离子通道、植物激素信
号转导和病原信号转导中起着重要的作用[5]。研究
表明, 人类基因组中存在 17个 G α基因, 编码 23个
G α亚基, 至少存在 5个 G β基因和 12个 G γ基因。
从玉米和拟南芥中克隆到的二个基因(ZGB1, AGB1)
与动物 G β 基因具有较高同源性, 并且具有 WD40
结构, 被认定是植物细胞中的 G β基因[6]。以前的研
究认为 G 蛋白 β、γ 亚基的功能主要是对 G 蛋白功
能的调节和修饰, 或把 G 蛋白锚定在细胞膜上。越
来越多的研究发现, G蛋白被受体激活后 G β/γ亚基
游离出来直接激活胞内的效应酶。1986年 Fong等[7]
在 G蛋白的 β亚基中发现 WD结构域, 随后在很多
参与各种细胞过程的蛋白中也发现了 WD 结构域。
WD-repeat 蛋白是由多个 WD 结构域组成的蛋白重
复基序, 是蛋白互作的一个位点, 是由许多结构相
关、功能不同的蛋白组成的大家族, 这些蛋白在信
号转导、细胞周期调控、RNA剪接、囊泡运输和转
录等方面具有重要的作用[8]。人类的 Lissencephaly
疾病、Cockayne 氏综合症、Allgrove 综合症等都与
WD 蛋白的突变有关[9]。植物 G 蛋白对植物的防卫
反应具有调节功能。Ortega等[10]的研究表明, G蛋白
参与柠檬苗对链格孢菌(Altemaria altemata)的超敏
反应, 早期的生化药理实验也表明植物 G 蛋白可能
参与植物真菌病原反应的调控。Perfus-Barbeoch等[11]
的研究证明, 植物 G 蛋白调控许多细胞反应过程,
如植物对激素、干旱和病原物的反应, 离子通道, 细
胞分裂, 极性生长和光反应等。目前, 对 G 蛋白调
控植物抗逆反应的机制了解较少, 特别是对 G 蛋白
参与 DREB转录因子蛋白水平调控还未见报道。
本研究利用酵母双杂交系统, 以大豆 GmDREB5
基因片段为诱饵对干旱处理的大豆 cDNA文库进行筛
选, 发现其中一个互作蛋白含有 WD40 保守域, 在
NCBI上比对发现与棉花(Gossypium hirsutum)的 G蛋
白 β 亚基(Putative G-protein beta)具有较高的同源性,
可能是大豆中发现的第一个 G 蛋白 β 亚基, 命名为
GmGβ1。研究 GmGβ1 与 DREB 的相互作用, 对于了
解植物抗逆基因信号转导网络具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 GmDREB5基因的功能验证
为了鉴定转 GmDREB5 基因烟草的耐旱性, 选
择纯合的 T2代转基因株系 D5和野生型烟草W38种
子在 MS 培养基上发芽, 在两片子叶完全展开的幼
苗期(两周后), 选取长势一致的幼苗各 10 株, 分别
转到含有 2% PEG 的 MS 培养基上, 正常光照培养
20 d, 观察在渗透胁迫下转基因株系和对照的表型
变化, 比较叶色和根长的差异; 为了鉴定转基因烟
草的耐盐性, 将 D5 转基因株系与 W38 的种子消毒
后, 各取 30粒播种在含 100 mmol L−1 NaCl的 MS
培养基上, 25℃正常光照培养 40 d, 观察种子的萌发
和生长情况。
1.2 GmDREB5蛋白的自激活验证
首先对GmDREB5转录因子可能的蛋白修饰位点
进行预测(http://scansite.mit.edu/), 将 GmDREB5 的氨
基酸序列划分为 3个区段, 分别命名为 GmDREB5IR、
1690 作 物 学 报 第 34卷

GmDREB5IIR、GmDREB5IIIR。为了将 GmDREB5基
因各片段插入载体 pGBKT7, 合成扩增 GmDREB5 各
片段的引物序列并分别在引物序列两端加上EcoR I和
Pst I酶切位点。
I区(1~72位氨基酸)——GmDREB5 IR5′: 5′>CGg
aattcATGCAATTCCCTCACCAATTTGG<3′; GmDREB5
IR3: 5′>GCCctgcagtTCACTGAAGAAGTTGCTGCT<3′。
II区(73~226位氨基酸)——GmDREB5 IIR5′: 5′>C
GgaattcTATTGGAGTGACGCGTTGAATCT<3′; Gm-
DREB5 IIR3′: 5′>GCCctgcagtCTAAACCTGGTCAT
CGCTCA<3′。
III区(227~309位氨基酸) ——GmDREB5 IIIR5′:
5′>CGgaattcCATGCTACTACTGAGAGTTCCG<3′;
GmDREB5 IIIR3: 5′>GCCctgcagaTCAATCCTGATC
CTTCCACA<3′。
全长(1~309位氨基酸)——GmDREB5 IR5′: 5′>CG
gaattcATGCAATTCCCTCACCAATTTGG<3′; GmDREB5
IIIR3′: 5′>GCCctgcagaTCAATCCTGATCCTTCCAC
A<3′。
引物由英骏生物技术有限公司合成。PCR 扩增
GmDREB5IR、GmDREB5IIR、GmDREB5IIIR 片段
以及全长序列后, 经 EcoR I/Pst I酶切插入诱饵载体
pGBKT7的 EcoR I/Pst I位点。将含有 GmDREB5的
3 个片段和全长序列的重组质粒 pGBKT7-IR、
pGBKT7-IIR、pGBKT7-IIIR、pGBKT7-D5 与对照
pGBKT7分别与 pGADT7按照一定比例混合转入酵
母菌株 AH109 中, 分别铺于 SD/trp− leu− 双营养缺
陷型培养基和 SD/ trp− leu− his− ade−四营养缺陷型培
养基上, 30℃培养 2~5 d, 观察转化各诱饵载体的酵
母在营养缺陷型培养基上的生长情况。
1.3 大豆 cDNA文库的构建及筛选
大豆品种铁丰 8 号由中国农业科学院作物科学
研究所大豆种质资源研究室提供。取萌发后两周左
右的大豆幼苗, 根据 GmDREB5 基因前期表达分析
的结果, 对大豆幼苗干旱处理 5 h, 根据试剂盒说明
(购自尚能生物科技有限公司)提取高纯度和高完整
度的 RNA, 参照 BD Matchmaker Library Construc-
tion & Screening Kits User Manual合成总 cDNA, 然
后进行第一链和第二链的合成, 用 1.2﹪琼脂糖凝胶
电泳检测合成的 cDNA。参照酵母双杂交试剂盒说
明书构建 cDNA文库及对文库进行筛选。
1.4 GmDREB5IIR与 GmGβ1的互作验证
将GmGβ1与诱饵载体 pGBKT7-IIR重新共转化
酵母, 在 SD/ trp− leu− his− ade− 培养基上添加了 15
mmol L−1的组氨酸(his−)竞争性抑制剂 3-AT(3-氨基
-1,2,4-三唑, 3-Amino-1,2,4-triazole)。将阳性菌株用
YPD液体培养基培养 3~4 d, 用 ddH2O稀释, 均一化
菌液浓度为 OD600=0.05, 取 5 μL点在相应的平板上
(SD/trp− leu−和 SD/ trp− leu− his− ade− +3-AT), 30 ℃培
养 3~5 d, 记录生长情况, 同时共转化的酵母用同样
的方法稀释后点在 SD/ trp− leu− his− ade− +X-Gal的
平板上进行 X-Gal 显色反应, 通过加大选择压及鉴
定下游报告基因 LacZ 基因的活性 , 进一步确定
GmDREB5IIR与 GmGβ1的互作关系。
1.5 GmGβ1基因表达特征分析
对萌发后正常生长两周的大豆铁丰 8号幼苗进行
4 种逆境胁迫处理, 分析 GmGβ1 基因在逆境下的诱
导表达趋势。逆境处理分别为干旱(放在吸水纸上)、
高盐(200 mmol L−1 NaCl)、低温(4℃培养)和 ABA处
理(200 μmol L−1 ABA喷洒), 按照不同的时间段(0、
1、2、5、10 和 24 h)取样, 使用 Trizol 法提取大豆
整株的总 RNA, 然后用 DNAase 进行纯化处理, 反
转录后以大豆组成型表达基因 Tubulin为内标, 对不
同时间段的模板均一化。GmGβ1 片段大小为 1 022
bp, 设计引物扩增片段大小为 658 bp, 引物序列为
GmGβ1 S: 5′-CAGATGCTGGGTTAAGTGACG-3′;
GmGβ1 A: 5′-CAATCCAAACACACTCATAAT-3′。扩
增体系为 25 μL, 程序为 94 ℃预变性 10 min; 94 ℃
30 s, 58 45 s, 72 45 s, 30℃ 循环; 72 , 1 min℃ 。
2 结果与分析
2.1 GmDREB5转录因子的功能
在模拟干旱条件下, 转 GmDREB5 基因烟草株
系 D5(图表中均标记为 D5)的根长、株高以及叶色
与野生型(图表中均标记为 CK)相比都有明显的差别
(图 1-A), D5的叶色为深绿色, 生长情况正常, 而 CK
的叶片已经萎蔫变黄, 表现出严重缺水症状; 在根
长对比后发现, D5平均根长达到 4.7 cm, 而野生型
的根长只有 1.0 cm, 差异极显著(P<0.01)。在高盐浓
度的培养基上D5株系萌发率平均达到 75%, 幼苗叶
片完全舒展, 呈现深绿色, 而野生型 W38 的萌发率
仅仅只有 15%, 且幼苗的叶片较小 , 出现畸形叶片 ,
萌发率差异极显著 (P<0.01) (图 1-B)。说明 GmDREB5
基因能够显著提高植物的抗旱和耐盐能力。
2.2 GmDREB5转录因子可能的修饰位点分析
在数据库中 (http: / /scansite .mit .edu/)对大豆
GmDREB5 转录因子进行了中等严谨度的作用位点
预测。结果如图 2所示, GmDREB5蛋白的 108~172
个氨基酸残基之间是转录因子的保守域 AP2区。其
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图 1 GmDREB5转基因烟草抗旱性和耐盐性鉴定
Fig. 1 The drought and high salt tolerance of GmDREB5 transgenic tobacco
A: 转 GmDREB5基因株系 D5和野生型烟草 CK在含有 2% PEG的 MS培养基上生长情况及根长统计结果; B: 转 GmDREB5基因株系
D5和野生型烟草 CK在含有 100 mmol L−1 NaCl的 MS培养基上的萌发率。
A: comparison analysis of root growth and root length of transgenic line D5 and wild type tobacco CK on MS medium with 2% PEG;
B: germination rates of transgenic line D5 and wild type tobacco CK seeds on MS medium with 100 mmol L−1 NaCl.

中第 13 位的丝氨酸是脯氨酸依赖性丝氨酸/苏氨酸
激酶家族结合位点; 第 89和第 168位亮氨基酸为激
酶家族结合位点; 第 237位的丝氨酸是 DNA损伤性
激酶结合位点; 第 101 位苏氨酸是磷酸化丝氨酸/苏
氨酸家族结合位点。根据网站预测结果, 与蛋白活
性调控有关的位点集中在 73~226氨基酸位点之间。
而转录因子的转录激活区可能存在于 5′或 3′末端。
因此, 将GmDREB5蛋白分为 3段, 将编码这些氨基
酸区段的 DNA序列扩增出来插入载体 pGBKT7, 检
测这些区段的自激活活性, 确定没有自激活活性的
氨基酸区段作为诱饵蛋白。
2.3 诱饵蛋白的自激活鉴定
pGBKT7、pGBKT7-IR、pGBKT7-IIR在 SD/ trp−
leu− 平板上都能正常生长出菌落, 但是在 SD/ trp− leu−
his− ade− 平板却没有长出菌落, 而 pGBKT7-IIIR 和
pGBKT7-D5在SD/ trp− leu− his− ade− 平板上能够正常
生长, 说明 pGBKT7、pGBKT7-IR、pGBKT7-IIR都没
有自激活活性(图 3)。根据对 GmDREB5蛋白结构域的
预测, 蛋白修饰位点大都集中在 II 区, 因此, 本实验
选用 pGBKT7-IIR作为诱饵蛋白筛选 cDNA文库。
2.4 候选克隆 GmGβ1的鉴定
通过筛选 cDNA 文库, 获得一些候选克隆, 对
候选克隆 GmGβ1进一步鉴定。将含有 GmGβ1基因
质粒和诱饵载体 pGBKT7-IIR 重新共转化酵母, 在

图 2 GmDREB5蛋白可能修饰位点的预测
Fig. 2 The potential modified sites of GmDREB5 protein
A: GmDREB5的氨基酸序列, 箭头标注处为分段位点, 加粗标记的
氨基酸为可能的修饰位点; B: GmDREB5的结构和自激活验证的区
段划分示意图第 108~172位氨基酸为转录因子的保守域 AP2区。
A: amino acid sequence of GmDREB5, arrows show the 5′ and 3′
end of three regions, and the amino acid sites of potential modified
sites were overstriked; B: The structure of the GmDREB5 and three
regions divided for auto-activation analysis were showed. The re-
gion from amino acid 108 to 172 belongs to AP2 domain.
1692 作 物 学 报 第 34卷


图 3 GmDREB5蛋白各区段自激活验证
Fig. 3 The auto-activation analysis of three regions of GmDREB5
pGBKT7+pGADT7为阴性对照; pGBKT7-IR、pGBKT7-IIR、
pGBKT7-IIIR、pGBKT7-D5为包含 GmDREB5各区段的质粒。
以上 4种质粒分别与 pGADT7共同转入酵母菌株 AH109, 在双
营养缺陷型培养基(SD/trp-leu-)和四营养缺陷型培养基
(SD/trp−leu−his−ade−)平板上 30℃培养 3~5 d后的生长情况。
pGBKT7-pGADT7: negative control. Plasmids of pGBKT7-IR,
pGBKT7-IIR, pGBKT7-IIIR, and pGBKT7-D5 contained I, II, III
regions, and full-length of GmDREB5. These plasmids were
co-transferred into yeast strain AH109 with pGADT7 and then
incubated on two types medium (SD/trp− leu− and
SD/trp− leu− his− ade−) for 3−5 days, respectively.

SD/ trp− leu− his− ade−选择培养基上, 30 ℃培养 5 d后
共转化的酵母能够正常生长, 而对照不能生长, 说
明 GmGβ1 与 GmDREB5IIR 可互作, 并激活酵母体
内的下游报告基因表达(图 4)。当加大选择压, 在 SD/
trp− leu− his− ade−选择培养基上添加浓度为 15 mmol
L−1 的 3-AT, 结果显示共转化酵母仍然能够正常生
长(图 5), 说明 GmDREB5 与 GmGβ1 有很强的相互
作用。同时, 在 SD/ trp− leu− his− ade−/X-Gal 培养基上
进行 β-半乳糖苷酶活性分析, 结果显示(图 5), GmGβ1
和 GmDREB5 的互作能够激活 LacZ 报告基因的表
达。

图 4 GmGβ1与 GmDREB5相互作用的验证 I
Fig. 4 Interaction identificationIof GmGβ1 and GmDREB5
pGBKT7-IIR+pGADT7作阴性对照; 诱饵载体(pGBKT7-IIR)分
别和 pGADT7, pGADT7-GmGβ1载体共转化酵母 AH109, 30 ℃
培养 5 d后的生长情况。
pGBKT7-IIR+pGADT7 as negative control. The bait vector
pGBKT7-IIR was co-transferred to yeast cells with the prey vector
pGADT7-GmGβ1 and control vector pGADT7 respectively, and inocu-
lated on media(SD/LT-: SD/trp− leu−; SD/LATH-) for 5 days in 30 .℃

图 5 GmGβ1与 GmDREB5相互作用的验证 II
Fig. 5 Interaction identificationIIof GmGβ1 and GmDREB5
a: pGBKT7-IIR+pGADT7-GmGβ1; b: pGBKT7-IIR+pGADT7。将
含有以上质粒的酵母重悬液分别在各种营养缺陷型培养基
(SD/LT-: SD/trp− leu−; SD/LATH-+3-AT: SD/trp− leu− his− ade− +3-AT;
SD/LATH-+X-G: SD/trp− leu− his− ade− +X-Gal)上 30℃培养 3~5 d后的
生长情况。
a: pGBKT7-IIR + pGADT7-GmGβ1; b: pGBKT7-IIR + pGADT7. a
and b were inoculated on media(SD/LT-: SD/trp-leu-; SD/LATH-+3-AT:
SD/trp− leu− his− ade− +3-AT; SD/LATH-+X-G: SD/trp− leu− his− ade− +
X-Gal) for 3−5 days in 30 .℃

2.5 GmGβ1的同源性
采用酵母双杂交系统, 以GmDREB5蛋白 73~226
位氨基酸区段为诱饵, 从干旱处理的整株大豆, 筛选
cDNA文库, 经测序, 在NCBI上比对发现一个互作蛋
白含有保守的 WD40 结构域, 与棉花(Gossypium hir-
sutum)的 G蛋白 β亚基在氨基酸水平上具有 65%的一
致性, 与水稻(Oryza sativa)的 G蛋白 β亚基有 60%的
一致性, 且在 GenBank中尚未发现大豆的 G蛋白 β亚
基, 该结构域认为可能是大豆中发现的第一个 G 蛋白
β亚基, 将其定名为 GmGβ1。GmGβ1基因全长 1 022
bp, 编码 340个氨基酸。将 GmGβ1与来自其他植物如
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棉花、水稻等的 G 蛋白 β 亚基(GenBank 登录号:
AAT64014、AAT64027、BAD72990)在 DNAMAN 中
进行全长氨基酸序列同源性分析, 结果显示, 棉花中
的两个 G 蛋白 β 亚基(AAT64014、AAT64027)同源性
达到97%, 而GmGβ1与这两个基因的同源性达到61%,
与水稻中的G蛋白β亚基(BAD72990)同源性达到52%,
因此推断 GmGβ1可能是一类编码大豆 G蛋白 β亚基
的新基因(图 6)。


图 6 GmGβ1氨基酸序列及与其他 G蛋白 β亚基同源性分析
Fig. 6 Amino acid sequence and homology analysis of GmGβ1
A: GmGβ1氨基酸序列; B: GmGβ1与其他植物(棉花: AAT64014、AAT64027, 水稻: BAD72990)中 G蛋白 β亚基同源性比对结果。
A: amino acid sequence of GmGβ1; B: homology analysis result of GmGβ1 with other G protein β subunits(AAT64014, AAT64027, G. hir-
sutum; BAD72990, O. sativa).
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2.6 GmGβ1基因在植物中表达的特异性
在干旱处理时, GmGβ1在 1 h开始受诱导表达,
5 h达到最高; 在高盐胁迫下, 1 h开始表达, 5 h表达
量最高, 10 h和 24 h稍有降低, 与受干旱胁迫时的表
达趋势基本一致。ABA处理后, GmGβ1从 2 h开始
表达量逐渐升高。在低温条件下 GmGβ1的相应速度
较其他 3种处理略慢, 在 5 h开始受诱导(图 7)。而
本实验室前期的实验证明, GmDREB5受干旱和高盐
胁迫的诱导表达, 都是在 6 h开始, 但是不受低温和
ABA处理的影响。

图 7 GmGβ1基因在大豆中的表达特征
Fig. 7 Expression pattern of GmGβ1 gene in soybean
GmGβ1基因受干旱、高盐、低温和 ABA胁迫处理的诱导表达。
The expression of GmGβ1 was induced by drought, high salt, cold
stresses, and ABA treatment in soybean.

3 讨论
G 蛋白偶联信号传导系统是十分重要的细胞跨
膜信号传导途径之一。其传导途径为: 细胞外的信
号分子(如气味分子、味觉刺激物、激素等)与跨膜的
G 蛋白偶联受体结合, 激活 G 蛋白, 使其解离为 α
亚基和 βγ二亚基复合体, 并作为传导物活化相应酶
和离子通道, 产生重要的第二信使, 从而引起胞内
相应的生物反应[12]。己知 G蛋白参与种子萌发[13]、
光控发育[14]以及包括生长素、赤霉素和脱落酸在内
的多种植物激素对植物生长发育的调控[15]。李旌军
等[16] 研究表明, G 蛋白 β/γ 亚基与效应物腺苷酸环
化酶 C 末端相互作用, 腺苷酸环化酶是一种分子量
很大的膜结合蛋白。大量的药理学及分子细胞生物
学证据表明, 植物异三聚体 G 蛋白参与了诸多发育
过程, 如气孔开关、细胞周期调节、根系发育等, 并
在植物感知环境信号反应中起着重要的作用[17]。最
近的文献报道通过拟南芥突变体的分析证明 G蛋白
各个亚基参与了 ABA[18]、生长素[19]等激素相关的信
号转导途径, 但尚未发现 G 蛋白与转录因子相互作
用的直接证据。本研究通过互作蛋白的筛选和验证
首次发现大豆 G蛋白 β亚基与 DREB转录因子存在
互作关系, 但这对 DREB 转录因子的活性起什么作
用有待进一步研究。在 DNAMAN中对 GmGβ1同源
性比对分析发现, GmGβ1可能是一类新的大豆 G蛋
白 β 亚基。GmGβ1 可能位于 GmDREB5 的上游,
GmGβ1参与了 GmDREB5调控下游基因表达, 从而
达到抵御逆境的目的。进一步研究 GmGβ1的功能及
调控 DREB 转录因子活性的机制是今后研究中的重
点, 这对于解析 GmDREB5 蛋白水平的调控机制进
而深入研究植物抗逆反应的调控网络具有重要的理
论意义。
本研究自激活实验结果显示 I 区和 II 区都没有
自激活活性, 而大多数蛋白修饰位点都集中在 II区,
因此, 选择 II 区为诱饵。通过分段验证诱饵蛋白的
自激活活性可以降低文库筛选中的假阳性比率。同
时, 为进一步验证阳性克隆与诱饵蛋白的相互作用,
在筛选培养基上增加一定浓度的 3-AT, 加大选择压
力, 对筛选到的克隆进一步验证也是非常重要的。
4 结论
筛选了 GmDREB5 的互作蛋白, 获得了候选克
隆 GmGβ1基因, 发现其与已知蛋白的 G蛋白 β亚基
(G-protein beta)具有一定同源性 , 并含有保守的
WD40 结构域, 是在大豆中发现的第一个 G 蛋白 β
亚基。GmDREB5与 GmGβ1存在相互作用。GmGβ1
基因的表达受干旱、低温、高盐等胁迫和激素 ABA
的诱导, 在干旱和高盐的胁迫下, GmDREB5在处理
6h 开始诱导表达。GmGβ1 可能位于 GmDREB5 的
上游, GmGβ1 参与 GmDREB5 调控下游基因表达,
从而达到抵御逆境的目的。GmGβ1参与植物对非生
物胁迫的响应, 及参与了对 GmDREB5 蛋白水平的
调控。

致谢: 感谢中国农业科学院作物科学研究所叶兴国
研究员在文章修改过程中给予的帮助。
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