全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 21792184 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)重大专项(2009AA101102), 国家自然科学基金项目(31071477), 高等学校博士学科点专项科研基金
(20090204110024), 陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项(2007ZDKG-020), 国家杨凌农业生物技术育种中心专项基金(99-1A)和西北农
林科技大学拔尖人才支持计划项目和资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张改生, E-mail: zhanggsh@public.xa.sn.cn, Tel: 029-87092152
第一作者联系方式: E-mail: fen1982@163.com ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-05-18; Accepted(接受日期): 2010-07-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02179
黏类小麦细胞质雄性不育线粒体 atp6基因转录本编辑位点
韩艳芬 张龙雨** 胡俊敏 张改生* 李亚鑫 盛 英 位 芳 牛 娜
马守才
西北农林科技大学 / 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 / 小麦育种教育部工程研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 以黏类小麦细胞质雄性不育系 ms(Kots)-90-110(A)及其近等可育基因系 BC5F2为材料, 采用克隆测序与 PCR
产物直接测序方法, 对黏类小麦线粒体 atp6 基因在花药发育各阶段的 RNA 编辑进行了分析。结果表明, 小麦 atp6
基因保守区 DNA 序列在供试材料不育系及其近等可育基因系中完全一致, 且与普通小麦和提莫菲维小麦 atp6 基因
序列同源性为 99%。两种方法测序分析 atp6基因转录本保守区 RNA编辑的结果规律相似。atp6基因共有 15个编辑
位点, 其中 13 个发生在密码子的第一和第二位点上, 这些位点的编辑都使氨基酸种类发生了变化; 有 2 个发生在密
码子的第三位点上, 不引起氨基酸种类的变化; 其中第 6和第 7位点是共转录的。随着花药发育时期的推移, 各位点
的编辑频率逐渐增高。不育系与其近等可育基因系相比, 在引入核恢复基因后, 各位点的编辑频率明显提高。编辑不
充分的转录产物可能会影响线粒体功能的正常发挥, 表明黏类小麦细胞质雄性不育与线粒体 atp6 基因转录本保守区
的编辑有一定的相关性。
关键词: 小麦; 细胞质雄性不育; atp6; RNA编辑
Editing Sites in Transcript of Mitochondrial atp6 Gene of Male Sterile Line
with Aegilops kotschyi Cytoplasm in Wheat
HAN Yan-Fen, ZHANG Long-Yu**, HU Jun-Min, ZHANG Gai-Sheng*, LI Ya-Xin, SHENG Ying, WEI Fang,
NIU Na, and MA Shou-Cai
Northwest A&F University / Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province / Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of
Education, Yangling 712100, China
Abstract: RNA editing of atp6 gene at different stages of pollen development was sequenced directly and from clones using the
cytoplasmic male-sterile line ms(Kots)-90-110 (A) and its near-isogenic line (NIL, BC5F2). The DNA sequences of ms(Kots)-90-110
(A) and the NIL had 99% identities with those of common wheat (Triticum aestivum) and T. timopheevi. There were 15 editing sites
in the conservative regions of atp6 transcripts between male sterile and fertile lines, of which 13 occurred at the first or the second
position of codons with alteration of amino acid type, and two occurred at the third position with no change of amino acid type.
Codens at the sixth and seventh sites were cotranscripted. The frequency of the editing site was increased gradually as the develop-
mental stage of anther proceeded. The restorer gene in BC5F2 obviously increased the editing frequency at each editing site. Tran-
scripts that were inadequately edited might affect the normal mitochondria function. RNA editing of atp6 is probably associated with
CMS in wheat with Aegilops kotschyi cytoplasm.
Keywords: Wheat; Cytoplasmic male sterility; atp6; RNA-editing
植物细胞质雄性不育(CMS)是杂种优势广泛利用的
基础, 线粒体基因组是细胞质育性因子的载体, 与 CMS
密切相关[1]。迄今为止, 在作物细胞质雄性不育材料中发
现了一些存在于线粒体的 CMS 基因, 它们存在相似的
orf/atp结构, 如油菜的 orf224、orf138、orf125、orf263、
orf193 和 orf222 等。这些基因通常与 atp6、atp8 和 atp9
等线粒体功能基因嵌合共转录 , 但其作用机制仍不清
楚[2]。向日葵的 orf522 与 atpA 共转录, atpA 基因的改变
2180 作 物 学 报 第 36卷

与向日葵 CMS 形成有直接关系[3]。水稻的 orf79 与 atp6
基因同时转录, 编码一个细胞毒素肽, 且转 orf79 的植株
能产生败育的花粉, 与水稻的 CMS直接相关[4]。Rathburn
等[5]发现在 T 型小麦不育系、可育系和相应的恢复系中,
线粒体 coxI 基因的上游存在一个嵌合基因 orf256, 编码
一种 7 kD的蛋白, 仅在 T型 CMS系中表达[6]。目前, 还
缺乏 orf256/coxI与小麦雄性不育相关的直接证据。
近年研究表明, CMS与高等植物线粒体基因的 RNA
编辑有重要关系[7-8]。在 RNA编辑中由于碱基的插入、缺
失或替代 , 改变了初始模板的编码特性 , 导致转录产物
的核苷酸序列不能忠实地反应模板 DNA 的一级结构, 它
是线粒体基因组产生功能蛋白必不可少的步骤。线粒体基
因发生 RNA 编辑后, 这些非正确或不充分编辑的产物可
能会导致线粒体功能不能正常发挥而形成 CMS[9]。目前,
在 CMS 作物中 atp6 基因编辑最为关注。在高粱花药中,
不育系线粒体 atp6 基因的编辑频率明显降低[10], 除了恢复
基因, 任何核背景都不能恢复 atp6 转录本的编辑频率[11]。
汪静等[12]发现玉米线粒体功能基因 atp6 和 cox2 的 RNA
编辑在可育胞质中编辑频率高于在不育胞质中。豌豆的
atp6基因 RNA编辑也与其 CMS相关[13]。有研究认为 atp6
和 atp9基因位点及它们上、下游 DNA序列的变化与 CMS
关系密切[14-15]。赵婷等[16]通过分析烟草 atp6基因的 SNP,
认为第 59 位点与烟草 CMS 特性有显著相关性。本试验
试图通过对 atp6 基因编辑的研究来探索其与黏类小麦
CMS的相关性, 为进一步揭示其 CMS机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
将本实验室创制的黏类小麦细胞质雄性不育系
ms(Kots)-90-110(A)及其近等基因系[17]按正常秋播种植在
西北农林科技大学试验田。近等基因系在 BC5F1代的基础
上又自交一代以使基因进一步纯合。两者除了在育性上有
差别外, 其他质核遗传背景相当一致。
1.2 近等基因系遗传背景检测
采用醇溶蛋白酸性聚丙烯酰氨凝胶电泳 (A-PAGE)
技术对不育系的近等基因系遗传背景一致性进行检测。按
照 1986年 ISTA颁布的 A-PAGE(pH 3.2)标准程序[18]并作
适当修改进行醇溶蛋白电泳。按有或无记录每个样品的电
泳条带, 有带存在时赋值 1, 无带时赋值 0。品种间的遗
传相似系数 GS = 2Nij /( Ni + Nj ) [19], 其中 Ni为品种 i出现
的谱带数, Nj为品种 j出现的谱带数, Nij为品种 i和 j共有
的谱带数。利用 NT-SYS2.1e软件, 按 UPGMA法进行遗
传相似性聚类分析。
1.3 小麦花药样品采集
取材前利用醋酸洋红染色压片, 镜检小麦花药发育
时期。分别选取处于单核期, 二核期和三核期的花药, 在
4℃下剥取穗中部花药, 液氮迅速冷冻后存于80℃冰箱
中备用。由于小麦不育系花药在二核后期到三核期开始败
育 , 不能形成正常三核花粉粒 [20], 所以不育系的取材与
可育植株外部形态指标一致。
1.4 小麦叶片线粒体 DNA和花药总 RNA的提取
采用差速离心法提取小麦叶片线粒体 DNA, 经过核
酸酶和蛋白酶处理以及酚/氯仿抽提等操作步骤获得较纯
的线粒体 DNA[21-22]。采用 BIOZOL试剂(杭州博日科技有
限公司), 按说明书步骤提取不同发育时期的花药总 RNA,
经 DNaseI(TaKaRa, 大连)纯化处理, 用琼脂糖凝胶电泳
和紫外分光光度计检测总 RNA质量。
1.5 一链 cDNA合成与 atp6基因扩增
使用 PrimScript RT reagent Kit (TaKaRa, 大连), 按
说明书步骤合成一链 cDNA。根据已知的小麦 atp6 基因
序列设计一对引物扩增 atp6 基因保守区域。引物序列为
atp6-F: 5-TATGCTGCTCACTGTCGT-3; atp6-R: 5-TAGA
ATCTTCGGCTCCTC-3。扩增程序为 94℃ 3 min; 94℃
30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 50 s, 35个循环; 72℃ 7 min; 4℃保
存。
1.6 atp6基因测序分析与编辑频率计算
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGeL Midi Purifi-
cation Kit, 北京 )回收目的片段 , 与 pMD19-T 载体
(TaKaRa, 大连)连接, 进行克隆转化的操作。选取 6个重
复的菌液和 PCR 产物 3 个重复送北京三博远志生物技术
有限责任公司测序。
采用序列图上同一位点的 T与 T+C碱基的峰值比计算
各位点的编辑频率, 编辑频率= hT/(hC+h T)×100%[9,12]。最终
结果分别是 6次重复(克隆测序)的平均值和 3次重复(直接
测序)的平均值。
1.7 转录发生率的计算
不完全编辑转录发生率用 100%减去最低编辑频率计
算[12]。未编辑转录发生率等于 100%减去最高编辑频率,
而用 100%减去能引起氨基酸变化的位点的最低编辑频率
作为非正常编辑转录发生率。
2 结果与分析
2.1 近等基因系醇溶蛋白标记的遗传相似性
供试的不育系(S)、近等基因系(B)和亲本(C)分别为 5
个重复, 对照中国春(CS1、CS2)为 2个重复, 共 17个材料
分离出 24 条相对迁移率不同的谱带, 每个材料可分离出
16~18 条谱带, 其中 9 条(50%)为所有供试材料的共同带,
9条带(50%)具有多态性。依据供试的 17份材料的谱带差
异, 共有 5种带型, 其中不育系的 5个重复和近等可育基
因系的 5 个重复有 2 种带型(图 1)。以中国春为对照, 根
据醇溶蛋白标记谱带计算近等基因系(BC5F2)与轮回亲本
(S)及其父本间的遗传相似系数。结果近等基因系(BC5F2)
与轮回亲本(S)的平均遗传相似系数高达 0.967, 选系间
(BC5F2)的遗传相似系数达 0.947。说明通过 5代回交和一
次自交, 引入恢复基因的近等基因系与轮回亲本(不育系)
间已达到很高的一致性。
第 12期 韩艳芬等: 黏类小麦细胞质雄性不育线粒体 atp6基因转录本编辑位点 2181



图 1 黏型小麦不育系的近等基因系醇溶蛋白电泳图谱
Fig. 1 Gliadin electrophoretic patterns of NIL from male sterile line with Aegilops kotschyi cytoplasm in wheat
CS1, CS2: 中国春的 2个重复; S1~S5: 不育系的 5个重复; B1~B5: 近等基因系的 5个重复; C1~C5: 父本 5451的 5个重复。
CS1 and CS2: two repeats of Chinese Spring; S1–S5: five repeats of male sterile line; B1–B5: five repeats of NILs; C1–C5: five repeats of male parent
5451.

2.2 小麦花药发育时期鉴定
镜检结果显示小麦花药发育的时期特征明显, 分别
为单核花粉粒、二核花粉粒(包含 1个营养核和 1个精核)
和三核花粉粒(包含 2 个细长的精核和一个圆形的营养
核)(图 2)。

图 2 醋酸洋红液染色的花药
Fig. 2 Pollen stained by acetocarmine
1: 单核期; 2: 二核期; 3: 三核期。
1: uninucleate stage; 2: binucleate stage; 3: trinucleate stage.

2.3 atp6基因的扩增与序列分析
atp6基因转录本保守区DNA和 cDNA片段大小一致,
均在 720 bp左右, 含有编码序列 669 bp, DNA序列在不育
系(S)和近等可育基因系(B)材料中完全一致, 与普通小麦
和提莫菲维小麦 atp6 基因保守区序列相比有个别碱基的
变化(图 3中位点 I至 V), 但同源性均为 99%。
2.4 atp6基因的编辑位点分析
atp6 基因编辑位点在不育系与其近等可育基因系 2
种材料中没有差别(图 3)。克隆测序和 PCR产物直接测序
两种结果显示, atp6基因转录本保守区的编辑位点数目和
位置均相同, 只是在各编辑位点的编辑频率有所差别。在
单核期、二核期和三核期, 不育系和近等可育基因系的
atp6转录本保守区共存在 15个编辑位点, 都为 C-U的变
化。发生在密码子第一位点的有 5个, 第二位点的有 8个,
第三位点的有 2个, 其中第 6和第 7位点是共转录的。发

图 3 atp6基因的 RNA编辑位点和 DNA序列
Fig. 3 RNA editing sites and DNA sequence of atp6 gene
起始和终止密码子用方框标出, 推定终止密码子用灰色背景标出,
各编辑位点下用短线标出。
Initiation and stop codons are boxed. Putative stop codon is in gray
background. Editing sites are underlined.
2182 作 物 学 报 第 36卷

生在第一、第二位点的编辑都引起了氨基酸种类的变化。
这些变化多提高了编码蛋白的疏水性, 增加了编码蛋白
在氨基酸序列上的保守性。如非极性氨基酸 Ser代替极性
氨基酸 Leu 等。第 8 编辑位点发生在不育系单核期、二
核期和三核期密码子的第三位点上, 编辑频率为 100%,
而在近等可育基因系中几乎不编辑。第 15 个位点的编辑
引入了 1个终止密码子, 在距其下游的第 7个密码子是根
据 DNA序列推定的终止密码子。
2.5 atp6基因的编辑频率分析
克隆测序和 PCR 产物直接测序显示, 各位点编辑频
率的变化趋势相似(表 1和表 2)。近等可育基因系(B)的编
辑频率均比不育系(S)相应位点的编辑频率高。即引入恢
复基因后, atp6基因转录本保守区编辑位点的编辑频率明
显提高。将各编辑位点按花药发育不同时期进行比较, 三
核期编辑频率最高 , 二核期 (B2S2)其次 , 单核期最低
(B1S1)。即随着花药发育时期的推移, 各位点的编辑频率
也逐渐增高。PCR 产物直接测序的各位点的编辑频率整
体上比克隆测序相应位点的编辑频率偏低, 但前者更为
精确。
2.6 atp6基因转录发生率的分析
克隆测序和 PCR 产物直接测序的结果规律相似(表
3)。在 2 种材料的 atp6 转录本保守区都未发现未编辑的

表 1 以克隆测序法分析 atp6基因转录本保守区编辑位点的编辑频率
Table 1 Frequency of editing sites of atp6 gene transcripts conservative area among six clones samples by clone sequencing (%)
编辑位点 Editing site 花药发育期
Developmental stage of pollen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
S1 (uninucleate stage) 83.3 83.3 83.3 83.3 66.7 83.3 16.7 100.0 100.0 83.3 66.7 66.7 83.3 83.3 83.3
B1 (uninucleate stage) 83.3 100.0 66.7 83.3 66.7 83.3 16.7 0 100.0 83.3 66.7 66.7 66.7 83.3 66.7
S2 (binucleate stage) 83.3 83.3 83.3 83.3 66.7 83.3 50.0 100.0 100.0 83.3 66.7 66.7 83.3 83.3 66.7
B2 (binucleate stage) 83.3 100.0 83.3 100.0 100.0 83.3 83.3 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 83.3 83.3
S3 (trinucleate stage) 100.0 83.3 83.3 100.0 100.0 100.0 50.0 100.0 100.0 100.0 83.3 100.0 100.0 83.3 83.3
B3 (trinucleate stage) 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 83.3 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
各编辑频率均在 6个克隆内计算得出。Each editing frequency is figured out in six clones.

表 2 以 PCR产物直接测序法分析 atp6基因转录本保守区编辑位点的编辑频率
Table 2 Editing frequency of editing sites of atp6 gene transcripts conservative area among the three experimental samples by direct se-
quencing (%)
编辑位点 Editing site 花药发育期
Developmental stage of pollen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
S1 (uninucleate stage) 86.3 85.3 81.0 82.1 74.0 76.0 35.3 100.0 100.0 78.1 70.4 66.2 77.4 70.2 65.2
B1 (uninucleate stage) 86.4 84.7 82.8 83.0 77.2 77.2 43.6 0 100.0 80.8 74.0 75.1 78.8 75.4 74.8
S2 (binucleate stage) 88.4 87.8 86.0 87.2 80.5 76.0 37.9 100.0 100.0 84.8 79.4 79.6 78.6 77.9 79.5
B2 (binucleate stage) 88.8 88.0 86.0 87.5 84.7 79.7 50.0 0 100.0 85.5 80.7 80.4 80.2 78.8 82.7
S3 (trinucleate stage) 92.8 88.2 86.9 89.2 84.5 77.5 45.3 100.0 100.0 86.3 81.7 81.2 82.7 80.4 79.5
B3 (trinucleate stage) 94.6 93.6 93.1 94.4 91.5 82.0 64.1 0 100.0 95.1 94.1 91.4 90.7 91.1 91.4
各编辑频率均在 3个重复内计算得出。Each editing frequency is figured out in three replicates.

表 3 atp6基因转录本保守区编辑位点的转录发生率
Table 3 Transcript occurrence rates of atp6 gene transcripts conservative area among experimental samples (%)
花药发育期
Developmental stage of pollen
不完全编辑
Incompletely edited transcript
未编辑
Unedited transcript
非正常编辑
Abnormally edited transcript
克隆测序 Clone sequencing
S1 (Uninucleate stage) 83.3 0 33.3
B1 (Uninucleate stage) 83.3 0 33.3
S2 (Binucleate stage) 50.0 0 33.3
B2 (Binucleate stage) 16.7 0 16.7
S3 (Trinucleate stage) 50.0 0 16.7
B3 (Trinucleate stage) 16.7 0 0
PCR产物直接测序 Direct sequencing
S1 (Uninucleate stage) 64.8 0 34.8
B1 (Uninucleate stage) 56.4 0 26.0
S2 (Binucleate stage) 62.1 0 24.0
B2 (Binucleate stage) 50.0 0 21.2
S3 (Trinucleate stage) 54.7 0 20.5
B3 (Trinucleate stage) 35.9 0 18.0
第 12期 韩艳芬等: 黏类小麦细胞质雄性不育线粒体 atp6基因转录本编辑位点 2183


转录发生, 即均为完全编辑。不完全编辑转录发生率和非
正常编辑转录发生率在近等可育基因系中比不育系中低。
而且随着花药发育时期的推移, 不完全编辑转录发生率
和非正常编辑转录发生率都逐渐降低。与表 1和表 2的编
辑频率变化趋势分析结果吻合。并且在近等可育基因系中,
克隆测序的非正常转录发生率在三核期(B3)为 0, 直接测
序的非正常转录发生率也仅为 18.0%。说明引入恢复基因
后, atp6基因的 RNA编辑逐步趋于正常。
3 讨论
前人对 RNA 编辑位点的研究大都以不育系和保持
系的黄化苗为材料, 且只对苗期做研究[9,23], 直接与育性
相关的成株期研究证据欠缺。而本研究以与育性直接相关
的花药为材料 , 而且所用试材因为细胞质来源相同 , 排
除了前人研究中由于细胞质种性差异而对基因编辑位点
的影响。此外, 研究中所用的克隆测序和 PCR 产物直接
测序两种方法各有优缺点 , 二者互补 , 使研究结果更精
确。前者能鉴定出各材料中编辑频率较低的位点, 而后者
要求编辑位点是完全编辑或编辑频率达到一定的值, 因
此可能丢失一些低频率的编辑位点。对于编辑频率来说,
直接测序反映的是扩增体系所有分子的编辑信息, 所以
更为精确。在本研究中, 根据克隆测序结果, 一些编辑位
点是完全编辑, 而在直接测序结果中却是部分编辑。所以
为使结果分析更精确, 克隆测序要求克隆重复数较多。而
直接测序要求 DNA/cDNA 体系纯度较高, 否则可能引起
其他错误的峰值出现。
本研究结果显示, 近等可育基因系比不育系相应位
点的编辑频率偏高。并且, 随着花药发育时期的推移, 各
位点的编辑频率也逐渐增高, 三核期达到最高。证明其
RNA 编辑逐步趋于正常。这种变化趋势与孔进等[24]发现
的水稻 atp6基因 RNA编辑位点规律相似。发生在密码子
的第三位点的第 8个编辑位点, 在不育系中的编辑频率为
100%, 而在近等可育基因系中几乎不编辑, 但由于密码
子简并性的特点而未引起编码氨基酸的种类变化。在不育
系和其近等可育基因系中, 第 15 个位点的编辑均引入了
一个终止密码子 , 在距其下游的第 7 个密码子是根据
DNA序列推定的终止密码子。Mower等[25]对甜菜的 RNA
编辑研究也发现, RNA编辑使 atp6、nad1 和 nad4L 基因
形成了新的起始密码子, 同时也使 atp6 和 atp9 基因形成
了新的终止密码子。在本研究中由于该终止密码子在两种
胞质中都存在, 可能是产生功能蛋白必需的步骤。通过与
其他作物 atp6 基因转录本相应区域编辑位点的比较, 发
现非极性氨基酸取代极性氨基酸, 如 Phe、Leu 代替 Ser,
提高了编码蛋白质的疏水性 , 增强了物种间的保守性 ,
这些研究结果与已有报道基本吻合[9,12,26-27]。L’Homme和
Brown[28]认为, atp6基因是 CMS的敏感部位, atp6基因序
列的异常可能会引起其编码的氨基酸异常, 妨碍 ATP 合
成酶的功能正常发挥 , 最终导致细胞内能量缺乏 , 难以
维持细胞的正常生理功能而导致植物雄性不育。Hosseini
等[29]应用 Southern 杂交技术对野败型水稻研究发现, 不
育系与其相应保持系 atp6 基因的杂交片段和类型都不相
同, 从而认为 atp6 与野败型水稻雄性不育密切相关。易
平等[9]对红莲型水稻 atp6基因的 RNA编辑研究显示, 保
持系比不育系相应位点的编辑频率偏高。Wang 等[4]发现
Boro II型水稻的 CMS恢复基因 RF1A除了具有降解功能
外, 还可以促进 atp6 mRNA 的编辑。本研究的结果也显
示出不育系引入恢复基因后 atp6 基因编辑的情况发生了
明显的变化, 但是在黏类小麦中 atp6 编辑的改变是引起
CMS 的原因还是伴随 CMS 的一种结果还有待进一步深
入研究。
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