全 文 ：收稿日期:2006-03-20
基金项目:国家基金(3040228);北京市科委合同项目(H012010240240113);北京市科委北京农业育种基础研究创新平台资助
作者简介:肖　雪(1980-),女 ,江西吉安人 ,在读硕士 ,主要从事植物抗逆分子生物学方面研究工作;黄丛林为通讯作者。
玉米蛋白激酶 ZmSPK1在转基因拟南芥中的定位
肖　雪1 , 2 ,张秀海2 ,杨　清1 ,邹华文1 , 2 ,吴忠义2 ,于　荣3 ,曹鸣庆2 ,黄丛林2
(1.南京农业大学生命科学学院 ,江苏 南京　210095;2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 ,北京　100089;
3.首都师范大学 生命科学学院 ,北京　100037)
　　摘要:为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况 ,利用绿色荧光蛋白基因 gfp 为报告基
因, 分别构建了以 35S 为启动子表达 ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP 的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和 35S∷GFP , 用花
粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥 ,筛选稳定表达株系 ,在共聚焦激光扫描显微镜下观察 ZmSPK1在植物细胞中的定
位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离 GFP相似 , 在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达 GFP
相比 ,融合蛋白 ZmSPK1-GFP在核内信号更强 , 推测 ZmSPK1 是可溶性蛋白 ,定位在核内。
关键词:ZmSPK1;绿色荧光蛋白;共聚焦激光扫描显微镜;亚细胞定位
中图分类号:S188　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2006)03-0001-04
Subcellular Localization of ZmSPK1 , A Protein Kinase from Maize ,
in Transgenic Arabidopsis
XIAO Xue1, 2 , ZHANG Xiu-hai2 , YANG Qing1 , ZOU Hua-wen1 , 2 , WU Zhong-yi2 ,
YU Rong3 , CAO Ming-qing2 , HUANG Cong-lin2
(1.College of Life Science , Nanjing Agricultural University , Nanjing　210095 , China;
2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center , Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences , Beijing　100089 , China;3.College of Life Science , Capital
Normal University , Beijing　100037 , China)
Abstract:To determine the subcellular localization of ZmSPK1 , a protein kinase from maize , using 35S promoter we
constructed two plant expression plastids:35S∷ZmSPK1-GFP and 35S∷GFP , and transformed them respectively into
Arabidopsis by floral dip.Subcellular localization was determined by Confocal laser scanning microscopy .The fused Zm-
SPK1-GFP showed a nuclear and cytosolic distribution similar to that of free GFP.Compared with 35S∷GFP , ZmSPK1-
GFP was more strongly accumulated in the nucleus , suggesting that ZmSPK1 might be soluble protein and localize in the
nucleus.
Key words:ZmSPK1;GFP;Confocal laser scanning microscope (CLSM);Subcellular localization
　　SnRKs(Sucrose Nonfermenting1-related protein ki-
nases)存在于所有的真核生物中 ,属于 Ser/Thr 类蛋
白激酶 ,由 N端保守的催化域和 C 端可变的调控域
组成 ,其保守域部分可分成 11个亚结构域 ,它区别
于其他蛋白激酶类的一个主要特征是第 8个亚结构
域内有一个 Thr 活性环[ 1] , 根据其 C-末端的不同
SnRKs可划分为 3类:SnRK1s ,SnRK2s和 SnRK3s ,后
两者为植物所特有[ 2] 。SnRK1s是酵母 SNF1的同源
物 ,在动物细胞内以 AMPK形式存在 ,这类激酶受
AMP激活 ,参与糖代谢 ,调节 AMP/ATP 比率 ,维持
体内能量平衡 ,调控碳水化合物转运蛋白及相关代
谢基因的转录 ,解除营养及环境胁迫[ 3 ～ 5] 。SnRK2s
比SnRK1s少 140 ～ 160个氨基酸残基 ,平均分子量
为40 kd ,这类激酶的一个典型特征是C-末端有一段
华北农学报·2006 , 21(3):1-4
酸性氨基酸序列 ,已有的研究表明 ,这类激酶参与渗
透胁迫的信号传导过程 ,少数还参与 ABA信号传导
过程[ 6 ,7] 。SnRK3s参与钙离子通道 、盐胁迫 、糖原及
ABA诱导的信号传导过程[ 8～ 15] 。到目前为止 ,研究
得比较深入的是 SnRK1s ,它的结构及生化特征与
SNF1/AMPK类似[ 3] ,而对 SnRK2s和 SnRK3s的生化
特性和调控机制还不清楚 。
实验室从玉米中克隆了一段全长 cDNA 序列 ,
命名为 ZmSPK1 ,Genebank 序列号为 AY722708。经
序列比对和进化树分析发现 ,ZmSPK1与 SnRK2b亚
家族的一些成员 ,如水稻 SAPK6和 SAPK7的同源性
很高 , 分别达 90%和 89%, 因此推测它可能是
SnRK2b亚家族的一个成员 。前期研究表明 ,该基因
受ABA ,NaCl和甘露醇诱导表达上调[ 16] ,为了进一
步研究 ZmSPK1在体内的生化特性和调控机制 ,首
先需对其细胞分布进行了解。为此 ,我们利用绿色
荧光蛋白(GFP)基因为报告基因 ,构建了以 35S 为
启动子表达 ZmSPK1-GFP 融合蛋白(35S∷ZmSPK1-
GFP)的植物表达载体 ,转化拟南芥 ,获得转基因植
株 ,利用共聚焦激光扫描显微镜初步研究了 ZmSPK1
在转基因拟南芥亚细胞水平上的分布 ,旨在为进一
步了解它的功能奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
拟南芥生态型———Columbia ,玉米品种———京玉
7号 。T4 DNA 连接酶为 TakaRa 公司产品;DNA快
速回收试剂盒为 QIAGEN 公司产品 。大肠杆菌
DH5α、农杆菌 GV3101 、中间载体 pBlueZmSPK1-dHA
(含目的基因 ZmSPK1)、克隆载体 pPUC18-GFP(含
GFP)、植物表达载体 pGreen0029-dHA等均为实验室
保存 。
1.2　方法
1.2.1　基因 ZmSPK1 与绿色荧光蛋白融合表达载
体的构建　BamH Ⅰ/Stu Ⅰ双酶切含目的基因 Zm-
SPK1 的中间载体 pBlueZmSPK1-dHA与含 GFP 的克
隆载体 pPUC18-GFP ,分别回收含目的基因 ZmSPK1
的小片段和含 GFP 的载体大片段 ,体外重组得到目
的基因与 GFP 融合的中间载体 pPUCZmSPK1-GFP ,
然后用 Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切重组的中间载体
pPUCZmSPK1-GFP 与植物表达载体 pGreen0029-dHA ,
分别回收含融合基因的小片段与表达载体大片段 ,
连接 、转化并筛选抗卡那霉素的阳性克隆 ,提取质粒
进行多酶切鉴定。同时酶切验证正确后的阳性克隆
进行测序确定 。质粒DNA提取 、酶切 、连接 、转化以
及感受态大肠杆菌的制备等参照《分子克隆》介绍的
常规方法进行 。
1.2.2　转化农杆菌及拟南芥　载体构建完成后转
化农杆菌 GV3101 ,验证正确转化后 ,参照 Steven 介
绍的方法转化拟南芥[ 17] ,收集转化当代的种子 ,在
含 50 mg/L卡那霉素的 MS培养基上筛选存活的植
株 ,通过 PCR鉴定的阳性植株经进一步筛选获得 T2
纯合株系 。
1.2.3　荧光显微观察　在 Leica 体式显微镜下筛选
表达量高的纯合株系 ,将高表达的株系种子消毒后
放在含MS培养基的培养皿中竖直培养 ,10 d后 ,剪
取拟南芥幼苗的根部 ,在共聚焦激光扫描显微镜 40
×, zoom 放大 2倍下扫描成像 ,采集图片后用 Photo-
shop软件进行图像处理 。
2　结果与分析
2.1　植物表达载体的构建和鉴定
经过分析各片段酶切图谱 ,首先构建 ZmSPK1
与gfp 基因融合的中间载体 pPUCZmSPK1-GFP ,然后
用 Xba Ⅰ/ EcoR Ⅰ双酶切重组的中间载体 ,回收融合
片段 ,与用相同酶酶切的植物表达载体 pGreen0029-
dHA 连接 ,得到重组的植物表达载体 pGZmSPK1-
GFP(图 1)。对构建好的植物表达载体 pGZmSPK1-
GFP 进行多酶切鉴定 ,得到与预期相同的片段(图
2),同时进行测序确定 ,结果证明插入序列完全正
确 ,表明重组质粒为正确的质粒。
图 1　植物表达载体 pGZmSPK1-GFP质粒图谱
Fig.1　Plasmid map of the plant expressing
vector pGZmSPK1-GFP
2.2　转基因植株的检测
载体构建完成后转化农杆菌 GV3101 , 经过酶
切鉴定正确后转化拟南芥 , 收集转化当代的种子 ,在
2　 华　北　农　学　报 21卷
M.Marker DL2000+DL15000;1.Pst Ⅰ ;
2.XbaⅠ + EcoR Ⅰ ;3.BamHⅠ +StuⅠ ;4.Bgl Ⅱ
图 2　植物表达载体酶切鉴定
Fig.2　Restriction analysis of recombinant plasmid
MS抗性筛选培养基上筛选得到 38 棵绿苗 ,对目的
基因 ZmSPK1 进行 PCR检测筛选得到 18个转基因
株系 。PCR检测结果如图 3所示 ,扩增得到预期片
段大小 1 092 bp。PCR阳性株系分别单株收种子 ,
在抗性培养基上筛选得到T2稳定纯合株系 。
2.3　荧光显微检测
2.3.1　高表达株系的筛选　用 Leica 体式荧光显微
镜筛选荧光表达强的纯合株系 ,共筛选得到 4个表
达稍强的株系 。图 4 显示 ZmSPK1-GFP 在花 、根 、
茎 、叶中的表达情况 ,红色为叶绿素自发荧光 ,绿色
为GFP 荧光 ,红色与绿色叠加后形成黄色荧光 ,结
果显示 ZmSPK1-GFP 在幼嫩组织内积累量高 ,如幼
根(图 4-B)、幼嫩的茎尖(图 4-C)。
M.DL2000+DL15000;1.pGZmSPK1-GFP ,2.WT , 3～ 22.Transgenic lines
图 3　转基因植株的 PCR检测
Fig.3　PCR identification of transgenic lines
A.Flower;B.Roots;C.Stems and leaves
图 4　体式荧光显微镜下转 ZmSPK1-GFP 融合蛋白株系的荧光分布情况
Fig.4　Fluorescence localization in transgenic lines expressing ZmSPK1-GFP fusion protein under a stereomicroscope
A.35S∷GFP;B.35S∷ZmSPK1-GFP
图 5　共聚焦激光扫描显微镜下 ZmSPK1在拟南芥根尖的
亚细胞定位情况
Fig.5　Confocal images of Arabidopsis roots where
35S::GFP (A)or 35S∶ZmSPK1-GFP(B)was expressed
2.3.2　ZmSPK1的亚细胞定位　荧光显微镜可清晰
地检测到游离GFP的荧光信号 ,由于融合蛋白的影
响 ,标记荧光的细胞信号微弱 ,不能清晰成像 ,而共
聚焦激光扫描显微镜通过共聚焦成像 ,能有效地消
除同一焦平面上非检测点的杂散荧光和非焦平面荧
光的干扰 ,使分辨率提高 ,从而获得清晰的图像 。由
激光共聚焦结果(图 5)可以看出 ,在转 35S∷GFP 质
粒的细胞中 ,GFP 绿色荧光均匀分布在液泡以外的
整个细胞中 ,而在转融合蛋白 ZmSPK1-GFP 的细胞
中 ,荧光信号在核内较强 ,胞浆内荧光分布不均匀 ,
这可能在某些细胞器中不表达 ,推测该激酶蛋白为
可溶性蛋白 ,定位在核内。拟南芥中的两个钙依赖
蛋白激酶(CDPKs)同源物 AtCPK3和 AtCPK4也有相
似的定位情况 ,推测为核内定位 ,并非蛋白酶降解释
3期 肖　雪等:玉米蛋白激酶 ZmSPK1在转基因拟南芥中的定位 3　
放的游离GFP造成的假象[ 18] 。
3　讨论
目前的文献报道中 , SnRKs家族的亚细胞定位
方面信息较少 ,本试验通过融合报告基因GFP ,初步
定位了 SnRK2b亚家族中玉米蛋白激酶 ZmSPK1在
转基因拟南芥细胞中的分布 ,为该基因家族的蛋白
定位信息提供初步试验依据。
已有很多试验表明蛋白质的N-豆蔻酰化能促
进蛋白间的相互作用 , 并且为细胞膜定位所必
需[ 19 ～ 21] 。然而 ,具有N-豆蔻酰化位点的激酶并不
一定定位在细胞膜上[ 22] ,准确的膜定位还需要有带
正电的多碱性氨基酸簇或者其他的脂酰化位
点[ 23 ,24] 。我们通过 Plants P 数据库分析推测 Zm-
SPK1含有N-豆蔻酰化位点 ,但是本研究的激光共
聚焦结果显示融合蛋白并未定位在细胞膜上 ,而在
细胞质及核内均有表达 ,并且核内荧光信号较强 ,推
测该激酶蛋白为可溶性蛋白 ,定位在核内 ,可能在蛋
白质间的相互作用方面起重要作用[ 18 ,25] 。至于其
准确的作用机制及其在细胞信号传导中的作用还有
待于进一步的研究。
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