全 文 ：收稿日期:2009-12-01
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2009hzs1J005);中国热带农业科学院博士启动经费
作者简介:黄贵修(1968-),男 ,研究员 , E-mai l:hgxiu@vip.163.com;＊通讯作者。
臂形草内生真菌 HND5的 GFP标记
及其抑菌作用
黄贵修＊ , 时 涛 , 刘先宝 , 戴英葵 , 蔡吉苗 , 林春花
(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室 , 儋州 571737)
摘要:臂形草 Brachiaria brizantha 内生真菌 HND5及其产生的挥发性气体对多种植物病原真菌
均有拮抗作用。本研究通过原生质体转化将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体质粒 pPKNTG 转入
HND5菌株中 ,获得了带绿色荧光且遗传稳定的转化子;PCR鉴定结果表明绿色荧光与外源质
粒的插入相关。随机选取 7个荧光转化子进行拮抗活性评价 ,发现其中 5个转化子及其产生
的挥发性气体对多主棒孢 Corynespora cassiicola 的拮抗活性与野生型菌株 HND5相当。该结果
为深入研究HND5菌株内生性及生防作用机理奠定了基础。
关　键　词:臂形草;内生真菌 HND5;绿色荧光蛋白;多主棒孢菌;拮抗作用
中图分类号:S476;Q78　文献标识码:A　文章编号:1005-9261(2010)03-0320-07
GFP-Tagging and Antagonistic Activity of the Engineered Strains
of Brachiaria brizantha Endophytic Fungus HND5
HUANG Gui-xiu＊ , SHI Tao , LIU Xian-bao , DAI Ying-kui , CAI Ji-miao , LIN Chun-hua
(Environment and Plant Protection Institute , CATAS/ Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical
Agricultural and Forest Invasive Alien Pests , Ministry of Agriculture , Danzhou 71737 , China)
Abstract:Endophytic fungus HND5 from Brachiaria brizantha and its volatile gas was antagonistic a-
gainst various pathogenic fungi.In this study , the expression vector of green fluorescent protein was
transferred into the strain HND5 by protoplast transformation and transformants with green fluorescence
with stable heredity were obtained.PCR identification showed the green fluorescence was related with the
foreign gfp.Seven transformants were randomly selected and their antagonistic activity on Corynespora
cassiicola was evaluated.The antagonistic activity of five transformants and their volatile gas were equal to
those of the wild type strain HND5.The results have established foundation for further study on the endo-
genesis and biocontrol mechanism of strain HND5.
Key words:Brachiaria brizantha;endophytic fungus HND5;green fluorescent protein;Corynespora
cassiicola;antagonism
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26(3)320-326　　　　　　中国生物防治　Chinese Journal of Biological Control　　　　　　　 2010年 8 月
　　内生真菌是指生活史的部分阶段或者整个生活史均生活在宿主植物体内 ,且没有引起明
显发病症状的真菌[ 1] ,与宿主之间为共生关系 。拮抗性内生真菌能够产生抗菌活性物质 ,提高
宿主植物的抗病性;而宿主植物能为内生真菌提供生存空间 、水分和养分 ,保护其不受外界环
境的影响 ,使其能够在宿主体内长期存活 。目前内生拮抗真菌因其独有的优势而成为生物防
治研究的一个热点。
多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的棒孢霉落叶病是我国橡胶树新发病害[ 2] ,病菌常年
均能为害叶片使其脱落 ,严重影响橡胶树的长势和产胶 ,整个生长季节均需防治 ,利用内生真
菌进行生物防治是近年来该病防治研究的重点。中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
橡胶树病害课题组从健康的珊状臂形草(Brachiaria brizantha)叶片中分离到 1 株枝顶孢属
(Acremonium)内生真菌菌株HND5[ 3] 。该菌株对橡胶树多主棒孢病菌等多种热带地区常见病
原真菌有较强的拮抗作用 ,同时还能产生有较强抑菌作用的挥发性气体[ 4] ,是一个值得深入研
究并有一定商业开发价值的菌株。为了开展该菌株内生性 、生防作用机制等方面的研究 ,笔者
利用一个绿色荧光蛋白基因(gfp)表达盒 ,通过聚乙二醇(polyethylene glycol , PEG)介导的原生
质体转化 ,获得了该菌株带绿色荧光的转化子 ,并从中筛选到与原始菌株拮抗活性相当的转化
子。主要结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　供试菌株 、质粒 、试剂和培养基
拮抗性内生真菌 HND5和橡胶树多主棒孢病菌 ,均由中国热带农业科学院环境与植物保
护研究所橡胶树病害课题组提供。
绿色荧光蛋白(GFP)表达载体 pPKNTG由中国农业大学农学与生物技术学院彭友良教授
惠赠。该载体带有新霉素抗性基因表达盒(Neo)和绿色荧光蛋白基因表达盒(由组成性启动
子 PtrpC驱动表达 ,终止子为 TtrpC)。
分子生物学相关试剂:dNTP 、克隆载体 pMD18-T 和 PCR片段回收试剂盒购买自宝生物工
程(大连)有限公司;Taq酶和大肠杆菌菌株 top10感受态购买自天根生化科技(北京)有限公
司;根据 gfp 基因编码区序列设计引物:引物 1(5 -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 )和引物 2
(5 -TCAAAGATCTACCATGTACAGC-3 ),由上海英骏生物技术有限公司合成 。生化试剂:新霉
素(G418)购买自美国 Amersco公司;崩溃酶(drislease)、山梨醇(D-sorbol)、聚乙二醇(PEG3350)
购买自美国 Sigma-aldrich 公司;其它生化试剂均为国产分析纯。原生质体转化相关试剂:
0.7mol/L NaC1;PTC(PEG3350 600g ,Tris碱 1.21g ,氯化钙 5.5g ,水 1000ml ,pH7.5);STC(山梨醇
218.6g ,Tris碱1.21g ,氯化钙 5.5g ,水 1000ml ,pH7.5)。
菌株培养用 PDA或CM培养基 ,配方参照文献[ 5]的方法 。再生培养基:SR培养基(酵母
浸膏 1g ,酶水解干酪素 1g ,蔗糖 342g ,琼脂 16g ,水 1000ml)。
1.2　原生质体的制备与 pPKNTG的转化
崩溃酶的配制:取崩溃酶干粉0.5g ,用 25ml预冷的 0.7mol/L NaCl融解 ,过滤除菌备用 。
新霉素的配制:称取新霉素干粉 ,用无菌水配制成 80mg/ml的溶液 ,过滤除菌备用。
HND5对新霉素的耐受能力评价:制备新霉素含量为 40 、60 、80 、100 、120μg/ml的 CM 平
板 ,以不加新霉素为对照 ,确定 HND5对新霉素的耐性。重复 3次。
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HND5菌株接种于液体CM培养基中 ,28℃、110r/min振荡培养 36h;收集菌丝 ,用 100ml预
冷的 0.7 mol/L NaC1 冲洗后 ,按比例(1ml/g 菌丝)加入崩溃酶溶液 , 90r/min 恒温振荡温育
3.5h;用预冷的 0.7 mol/L NaC1洗涤并收集酶解产物 ,再用 5ml STC溶液洗涤 2次 ,最后将原
生质体调整至 1×108个/ml ,每管 0.15ml分装 。取 4管原生质体 ,分别加入等体积(总含量为
2μg)Not I线性化的 pPKNTG 的 DNA ,轻轻混匀 ,冰上 20min;加入 2ml PTC ,冰上 20min;再用
25ml冰预冷的 STC 洗涤 1次;用 3ml液体 SR培养基重悬沉淀 , 28℃静置培养 12h;然后用
15ml融化(50℃左右)的 SR培养基与培养液混匀后铺板 ,凝固后在平板表面覆盖 10ml融化
(50℃左右)的水琼脂(0.7%,含适量新霉素),28℃培养 6d。
将长出的小菌落接种到 CM 平板(含新霉素)上复筛 ,以 HND5为对照 ,进行转化子抗性验
证 ,对能够正常生长的转化子进行单孢分离纯化并保存 。
1.3　转化子生长状况及其荧光产生情况观察
将各转化子与HND5接种于 PDA平板中央 ,28℃培养 7d观察菌落生长状况。
挑取抗新霉素转化子以及 HND5的少许菌丝 ,放置在载玻片上 ,加一滴无菌水 ,盖上盖玻
片 ,在 Nikon Eclipse 80i显微镜(Tokyo , Japan)下观察其菌丝 、产孢器 、分生孢子和菌环等结构 。
在明视场下找到菌丝后 ,关掉光源 ,用波长为 450 ～ 490nm 的激发光照射菌丝 ,观察菌丝产生荧
光情况。用显微镜附带的 ACT-1软件和 DXM1200F 相机进行拍照记录 。
1.4　荧光转化子的 PCR鉴定
采用 CTAB法[ 6]提取荧光转化子菌丝的 DNA作为模板 ,利用引物 1和引物 2进行 PCR验
证。PCR扩增采用 25μl反应体系 ,其中含10×PCR缓冲液 2.5μl ,dNTP(10mmol/L)0.5μl ,引物
溶液(10μmol/L)各 0.5μl ,模板 DNA 20 ～ 100ng , Taq 酶0.5μl(2.5U/μl),加去离子水至 25μl。扩
增条件为:94℃预变性 3min;94℃30s ,55℃30s ,72℃1min ,35个循环;72℃延伸 10min。PCR
扩增产物经 1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离 ,参照试剂盒说明书进行回收 、克隆和转化 。所获
阳性转化子由北京三博远志生物技术公司测序 ,测序结果和 gfp 基因编码区序列在 http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上进行比对。
1.5　荧光转化子的遗传稳定性评价
将转化子接种在不含新霉素的 PDA平板中央 , 28℃培养 15d ,在菌落边缘挑取新鲜菌丝 ,
重复转接 10次后再接种到含新霉素的 PDA平板上 ,观察其生长情况;同时挑取少量菌丝 ,观
察其荧光产生情况。
1.6　荧光转化子的拮抗活性评价
采用平板对峙法和双皿对峙法进行 。将 HND5 、荧光转化子和多主棒孢菌株在 PDA平板
上28℃培养 7d ,用灭菌打孔器在菌落边缘打取直径 4mm的菌饼备用。
平板对峙法:制备直径为 9cm 的PDA培养基平板 ,在中央接种各病原真菌菌饼 ,在距离中
心3cm处分别接种HND5和转化子的菌饼 ,以不接HND5处理为对照。每处理重复3次。28℃
培养 7d ,观察并测量菌落直径 ,计算抑制率。
双皿对峙法:制备直径为9cm 的PDA培养基平板 ,HND5和转化子 28℃培养 15d后 ,轻轻
将皿盖移去。在新制备的 PDA平板中央接种各病原菌菌饼 ,将其分别倒扣上述带有 HND5和
转化子的皿底上 ,用 parafilm膜封口。以同时接种的病原菌为对照 ,每处理重复 3次 。28℃共
培养 7d ,观察并测量菌落直径 ,计算抑菌率。抑菌率=[(对照菌落直径-各处理菌落直径)/
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 生 物 防 治　　　　　　　　　　　　　　　第 26 卷
(对照菌落直径-原菌饼直径)] ×100%。
1.7　数据处理
数据采用 SAS9.0软件进行分析[ 7] 。
2　结果与分析
2.1　原生质体制备与 pPKNTG的转化
用含不同浓度新霉素的 CM平板培养HND5菌株 ,结果表明 ,当新霉素浓度为 100μg/ml时
菌株即停止生长 ,因此用含 100μg/ml新霉素的培养基平板进行转化子的抗性筛选。
按照 1.2中的方法 ,HND5菌丝用崩溃酶溶液温育 3.5h后 ,镜检可见大量圆球形原生质体
和少许菌丝。经测量 ,直径在 3.89 ～ 10.52μm之间 ,平均大小为 8.28μm 。用 4份原生质体进行
pPKNTG质粒转化试验 ,最终挑取 52个菌落 ,复筛后获得 46个转化子 ,单孢纯化后保存 。
2.2　转化子生长状况及其荧光产生情况观察
培养结果发现各转化子的菌落形态 、生长速度等均与原始菌株 HND5一致;显微观察结
果也表明其菌丝 、产孢器 、分生孢子和菌环等结构也与 HND5菌株一致 。表明所获转化子中外
源质粒的插入对其生长和生物学特性没有影响。
挑取HND5和各转化子菌丝 ,镜检。图 1的荧光显微观察结果表明 ,在激发光的照射下 ,
HND5菌丝不能产生任何荧光 ,而 46个抗性转化子中有 42个能够产生绿色荧光 ,分别命名为
HNDG1 ～ HNDG42。各转化子在白光下的菌丝与对应的绿色荧光能够完全叠加在一起 ,表明这
些绿色荧光确实由相应的菌丝产生 。
a.转化子 HNDG1的菌丝在激发光下产生的绿色荧光;c.白光下HNDG1的菌丝;b.图 a和图 c 的叠加;
d.激发光下的原始菌株 HND5;f.白光下 HND5的菌丝;e.为图 d和图 f的叠加
a.Green fluorescence of HNDG1 under the exciting light;c.Hyphae of HNDG1 under the whi te light;b.Merge of a and c;
d.HND5 under the exciting light;f.Hyphae of HND5 under the white light;e.Merge of d and f
图 1　转化子 HNDG1菌丝的荧光显微观察
Fig.1　Microscopic observation of the green fluorescence in the hyphae of the transformant HNDG1
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2.3　荧光转化子的 PCR鉴定
随机选取 HNDG1 ～ HNDG7等 7个荧光转化子 ,参照 1.4的方法提取 7个转化子和 HND5
的基因组 DNA 。以基因组 DNA为模板 ,用引物 1和引物 2进行 PCR扩增 ,结果 7个转化子均
扩增出大小约0.7 kb的条带 ,而HND5没有任何扩增产物(图 2)。PCR扩增结果表明转化子绿
色荧光的产生与外源质粒的插入密切相关。选取转化子HNDG1 、HNDG2 、HNDG3的扩增产物
进行克隆 ,测序结果表明它们与 gfp基因编码区序列完全一致 ,进一步证明外源 gfp 基因已整
合到基因组DNA中。
M.DL 2000;1～ 7.分别为荧光转化子 HNDG1～ 7;8.原始菌株 HND5
M.Marker of DL 2000;1～ 7.Transformants HNDG1-7;8.Wild type strain HND5
图 2　荧光转化子的 PCR鉴定结果
Fig.2　Identification of the transformants HNDG1～ 7 by PCR amplification
2.4　荧光转化子的遗传稳定性评价
参照 1.5的方法 ,将荧光转化子HNDG1 ～ HNDG7分别在不含新霉素的 PDA平板上连续转
接10次 ,最后接种到含新霉素的 PDA平板上 。结果发现各荧光转化子仍能正常生长;显微观
察结果表明各转化子仍然能够产生绿色荧光 。表明 gfp基因和新霉素抗性基因能在转化子中
稳定遗传和表达 。
2.5　荧光转化子对橡胶树多主棒孢的拮抗活性
采用平板对峙法和双皿对峙法进行荧光转化子 HNDG1 ～ HNDG7对橡胶树多主棒孢的拮
抗活性检测。平板对峙试验结果均表明 ,转化子 HNDG4和 HNDG5 的拮抗活性比原始菌株
HND5稍强;HNDG3和HNDG6的拮抗活性与HND5没有差异;HNDG1比 HND5稍弱;但是这
5个转化子的抑菌活性与原始菌株 HND5基本相当 ,抑菌率均在 50%以上。双皿对峙试验结
果均表明 ,这 5个转化子产生活性气体的抑菌作用也与 HND5基本相当 ,抑菌率均在 60%以
上;其中 HNDG1 、HNDG4 和HNDG5这3个转化子产生活性气体对橡胶树多主棒孢的拮抗活
性较原始菌株 HND5显著增强。转化子HNDG2和HNDG7的拮抗作用和活性气体的抑菌作用
较原始菌株HND5均显著降低(表 、图 3)。
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表　7个荧光转化子及其产生气体对橡胶树多主棒孢的抑菌作用
Table　Inhibition activity of 7 transformants and their volatile gas against C.cassiicola
菌株 抑菌率(%)Inhibition rate
Strains 平板对峙 One plate conf rontation 双皿对峙 Two plates confrontation
HND5 54.61±1.12 b 66.61±2.16 a
HNDG1 52.54±0.58 c 67.38±0.95 a
HNDG2 32.85±1.57 d 35.40±1.06 c
HNDG3 53.64±0.27 bc 62.51±0.83 b
HNDG4 59.49±3.50 a 68.38±1.85 a
HNDG5 58.16±2.41 a 67.04±0.57 a
HNDG6 54.69±1.37 b 63.89±1.13 b
HNDG7 5.29±0.35 e 14.05±0.82 d
　　注:同列数据后的不同小写字母表示 0.05水平上差异显著。
Note:Values with different small letters in the same column differ significantly at 0.05 level.
a.HNDG1对多主棒孢的抑制作用;b.HNDG1产生的挥发气体对多主棒孢的的抑菌作用;两图中左为抑菌处理 ,右为对照
a.Antagonistic result of HNDG1 to C.cassiicola;b.Antagonistic result of volatile gas produced by HNDG1 to C.cassiicola;
The left was the antagonist ic effect and the right was control in pictures a and b
图 3　转化子 HNDG1及其产生气体对多主棒孢的抑菌作用
Fig.3　Antagonistic activity of the transformant HNDG1 and its volatile gas against C.cassiicola
3　讨论
通过 PEG介导的原生质体转化方法 ,本研究获得了臂形草内生真菌 HND5带绿色荧光的
转化子 ,PCR鉴定结果表明这些转化子的绿色荧光是由外源 gfp 基因的插入引起;连续转接
试验表明插入染色体的 gfp 基因和新霉素抗性基因能够在转化子中稳定遗传和表达 。PEG是
一种水溶性的化学渗透剂 ,可使细胞膜之间或外源 DNA与膜之间形成分子桥 ,促使相互间的
接触和粘连 ,并可引起细胞膜透性的改变 ,从而诱导原生质体摄取外源基因 DNA;外源 DNA
进入原生质体后 ,随机插入并整合到染色体上 ,从而完成转化过程。本研究随机选取的 7个转
化子中有 5个对橡胶树多主棒孢的拮抗活性与原始菌株 HND5相当 ,而另外 2个转化子拮抗
活性显著降低 ,这可能是由于外源基因的随机插入影响了某些基因的表达 ,从而造成转化子拮
抗活性的变化。
　　内生真菌是生防研究的热点 ,科研工作者已从很多宿主植物中分离到大量的内生真菌 ,并
筛选到很多对植物病原菌有拮抗作用的菌株 。进行内生菌的内生性测定时 ,接种菌株通常要
另外添加一个遗传标记以便与原菌株进行区分 。Ramos等[ 8]将固氮螺菌(Azospirillum)添加绿
色荧光标记后接种小麦 ,通过观察小麦组织中的荧光表达情况 ,不但证明了该菌株的内生性 ,
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还研究了它与小麦之间的互作机理。本研究所获内生菌 HND5的荧光转化子 ,为研究该菌在
橡胶 、香蕉和木瓜等植物的内共生性奠定了基础 ,同时通过绿色荧光的观察 ,可以探寻内生菌
在宿主组织内的分布动态及作用机制。
枝顶孢属很多种都是常见的内生真菌 ,能与木本的沙棘[ 9] 、麻疯树[ 10] 、见血封喉[ 11]等植
物共生。橡胶树是高大的木本植物 ,对于棒孢霉落叶病等叶部病害 ,化学防治和常规生防都存
在药液(或菌剂)难以达到靶标以及防效持久性不强等问题 ,利用拮抗内生真菌进行生物防治
是一条新途径 。前期研究表明 ,HND5回接臂形草 3个月后仍能检测到菌株的存在[ 3] 。在本
研究所获拮抗活性较强荧光转化子基础上 ,本课题组计划将其接种橡胶叶片 , 3 ～ 6个月后分
离鉴定存活情况;同时接种病原菌观察橡胶树-HND5荧光转化子“共生体”的抗病能力 ,评价
内生菌的生防效果;另外还将以红色荧光标记橡胶树多主棒孢菌 ,和 HND5绿色荧光转化子
共同接种橡胶树 ,通过对橡胶树组织内两种荧光的观察 ,研究HND5的生防作用机制 。
参 考 文 献
[ 1] 　Herd S , Christensen M J , Saunders K , et a1.Quantitative assessment of in planta distribution of metabolic activity and gene expres-
sion of an endophytic fungus[ J] .Microbiology , 1997, 143:267-275.
[ 2] 　Pu J J , Zhang X , Qi Y X , et al.First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China[ J] .Australasian Plant
Disease Notes , 2007 , 2(1):35-36.
[ 3] 　郭志凯 , 王蓉 , 蔡吉苗 , 等.臂形草内生真菌菌株HND5的分离 、抗性评价及其初步鉴定[ J] .热带作物学报 , 2007 , 28
(2):92-96.
[ 4] 　黄贵修 , 郭志凯 , 蔡吉苗 , 等.一株植物内生真菌及其应用[ P] .中国发明专利 , 200810101272.5.2008.
[ 5] 　方中达.植病研究方法(第 3版)[M] .北京:农业出版社 , 1998.46-50.
[ 6] 　易润华 , 朱西儒 , 周而勋 , 等.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌 DNA[ J] .湛江海洋大学学报 , 2003, 23(6):72-
73.
[ 7] 　唐燕琼.SAS统计分析教程[ M] .北京:中国农业出版社 , 2006.90-92.
[ 8] 　Ramos H J O , Roncato-Maccari L D B , Souza E M , et al.Monitoring Azospirillum-wheat interactions using the gfp and gusA genes
constitutively expressed f rom a new broad-host range vector[ J] .Journal of Biotechnology , 2002 , 97(3):243-252.
[ 9] 　李琦 , 孙广宇.沙棘中内生菌的疏散与判定[ J] .中国农学通报 , 2006 , 22(10):300.
[ 10] 　袁理春, 赵琪 , 张克华 , 等.麻疯树根部内生真菌分离及鉴定[ J] .西南农业学报 , 2009 , 22(1):95-98.
[ 11] 　阙东枚 , 戴好富 , 曾艳波 , 等.见血封喉内生真菌 Acremonium sp.J1化学成分研究[ J] .中国药物化学杂志 , 2009 , 19
(3):200-205.
326
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