全 文 ：第 41 卷　第 5 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.41　No.5
　2002 年 9 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Sep.2002　
文章编号:0438-0479(2002)05-0546-05
GFP-mut2植物表达载体的构建及在
甜菊愈伤组织中的表达
收稿日期:2002-05-20
作者简介:熊玲媛(1974-), 女 ,博士生.
＊通讯作者 , Corresponding author
熊玲媛 ,陈　亮 ,沈明山 ,黄胤怡 ,陈睦传＊
(厦门大学生命科学学院　细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建　厦门 361005)
摘要:构建了 GFP-mut2 的植物表达载体 , 在农杆菌的介导下使 GFP-mut2 基因整合到甜菊核基因组中并得到了
表达 , 从而建立了以绿色荧光蛋白基因为报告基因的根癌农杆菌介导的甜菊转基因系统.为今后构建 GFP 融合蛋
白及分析相关蛋白的生物学功能奠定了基础.
关键词:绿色荧光蛋白;甜菊;遗传转化;基因表达
中图分类号:Q291;Q753 文献标识码:A　　　　　　　　　　　　　　　
　　1994年 ,Chalfie等人(Chalf ie ,1994)将 GFP 基
因克隆到 mec-7启动子下 ,转化至线虫 C.elegans幼
虫中 , 利用 mec-7 启动子表达的组织特异性 , 使
GFP 在神经系统中特异性表达[ 1] ,开创了 GFP 应
用先河 ,引起学者们的广泛兴趣.随后 ,其异源表达
的范围迅速扩展到了其它生物中 ,如粘菌[ 2] 、拟南
芥 、玉米 、烟草[ 3～ 5] 、水稻[ 6]和果蝇[ 7] 、斑马鱼[ 8]等.
近年来 ,绿色荧光蛋白(GFP)作为新一代的基因转
移报告物和定位标记物 ,在生命科学中越来越受到
关注.与其它传统的报告分子如 β 半乳糖苷酶
(LacZ)、β葡糖苷酸酶(GUS)和荧光素酶(LUC)等
相比 , GFP 具有荧光强度高 、不需要底物或辅助因
子 、无种属特异性 、相对分子质量小 、易与其他蛋白
融合 、对细胞无伤害 、易于检测 、可在活细胞实时观
察等优点[ 6] ,因而有着广泛的应用前景.本实验构
建了 GFP-mut2的植物表达载体 ,在农杆菌的介导
下使 GFP-mut2基因整合到甜菊细胞核基因组中并
得到了表达.
1　材料和方法
1.1　材　料
1.1.1　植物材料
“云宾”甜菊(Stev ia rebaudiana Bertoni)种子经
75%乙醇 、0.1%升汞灭菌并用无菌水洗净 ,置于铺
有湿润滤纸的无菌培养皿中黑暗条件下萌发7 d ,将
幼苗切成小块培养(MS +1 mg/L 2 ,4-D+0.5 mg/
L 6-BA)诱导出生长疏松的愈伤组织用于转基因.
培养条件25 ～ 27 ℃,光强(1 500 ～ 2 000)LUX每日
光照 12 h.
1.1.2　菌株和质粒
大肠杆 菌(E.coli)为 JM 101 、农 杆菌为
EHA105 、含改良的 GFP 基因的质粒 pG F P-mut2 、
中间载体 pBPFΨ7(图 1)、植物双元表达载体质粒
pCAMBIA 1301(图 2 ,由澳大利亚 CAMBIA 实验室
提供).
1.1.3　试　剂
各种酶和生化试剂分别购自上海生工 、大连宝
生物 、上海华舜 、SIGMA等公司.
1.2　方　法
1.2.1　植物表达载体的构建
根据 GFPmut-2两端的序列设计引物 ,序列为
5′端引物:GGCCGGATCCCGGGGATCCTC-
TAG;
3′ 端 引 物: GCGCGAATTCTTTG-
TATAGT TCACCCATGCC
(下画线分别示引入的酶切位点 BamHI 和
EcoR Ⅰ), 以 pGFP-mut2 质粒为模板进行 PCR扩
增 ,PCR体系为 20μL :含 1x buffer ;模板 DNA;
　图 1　中间载体 pBΨG 的物理图谱
　Fig.1　Restriction map of pBΨG
　图 2　pCAMBIA1301 载体的物理图谱
　Fig.2　Restriction map of pCAMBIA1301
0.2 mmol/ L dNTP;0.1 mmol/ L primers;0.8 U
Taq酶.PCR程序为:94 ℃,变性 10 min ;94 ℃,变
性45 s;58 ～ 60 ℃,退火 45 s;72 ℃,延伸 1 min;35
个循环;72 ℃, 延伸 10 min.PCR扩增得到 GFP-
mut2基因片段 ,经琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂
盒回收 ,然后与载体 pBPFΨ7分别经限制性内切酶
EcoR Ⅰ/ BamH Ⅰ双酶切 ,琼脂糖凝胶电泳 ,胶回收
试剂盒回收.得到的片段用 T 4 DNA连接酶连接 ,转
化大肠杆菌 JM 101 ,挑选单克隆小量提质粒后进行
EcoR Ⅰ/ BamH 双酶切鉴定 ,阳性为含有 GFP 基因
片段的中间载体 pBΨG.
Hind Ⅲ单酶切 pBΨG 与 pCAMBIA1301 ,分别
回收小片断和大片段 ,其中 pCAMBIA1301 的大片
段经小牛碱性磷酸酶 CIAP 去磷酸化.将 pBΨG 的
酶切回收小片断与去磷酸化的 pCAMBIA1301酶切
回收大片断用 T 4 DNA 连接酶在 16 ℃连接过夜 ,转
化大肠杆菌 JM101 ,挑单克隆 , 小量提取质粒 , 经
PCR 、酶切鉴定后测序得到植物表达载体 1301
pBΨG阳性克隆.质粒用直接法转化农杆菌.
1.2.2　根瘤农杆菌介导的转化
将含有表达载体的农杆菌接种到含有 250 mg/
L Kan的 LB 培养基 , 28 ℃培养至 OD 0.8 ～ 1.0 ,
4 000 r/min离心 10 min ,用 1/2 MS 液体培养基重
悬菌体并稀释至原体积的 2倍 ,加入乙酰丁香酮 ,使
其浓度达到 100μmol/ L.将甜菊愈伤组织置于上述
菌液中室温 ,100 r/min 振荡 20 ～ 30 min或抽真空
处理 3次 ,每次 1 min ,压力 0.5 Pa.倒出菌液 ,愈伤
组织用无菌滤纸吸干 ,移入共培养培养基中弱光照
共培养 2 ～ 3 d ,转接到恢复培养基(MS +2 , 4-D 2
mg/L+0.5 mg/L 6-BA+Cef 300 mg/L)恢复培养5
d ,再转移到筛选培养基(MS+2 ,4-D 2 mg/L +0.5
mg/L 6-BA +Cef 300 mg/L +Hyg 35 mg/ L)上进
行筛选培养 ,每隔 10 d用相同培养基继代.
1.2.3　转基因抗性愈伤组织的的鉴定
1)转基因抗性愈伤组织的 GUS 基因的组织化
学染色检测
取转化体用 X-gluc染液 37 ℃温浴过夜后 , 无
水乙醇脱色 ,肉眼或解剖镜下观察染色情况 ,呈蓝色
的为 GUS 阳性.
2)转基因抗性愈伤组织的 PCR检测
用快速提取方法提取对照及抗性愈伤组织的
DNA:将干净愈伤组织在液氮中磨成细粉 ,直接加
入 TE-buffer 溶解 ,离心 ,吸取上清稀释后作为反应
模板 ,反应体系及程序同 1.2.1.
3)转基因抗性愈伤组织 PCR产物的 Southern
杂交
以 GFP 全基因制备探针(探针标记和检测采
用 Bio-rad 公司产的 DIG High Prime Labling and
Detection Starter Kit I 试剂盒),与转基因抗性愈伤
组织及未转基因愈伤组织的 PCR产物进行杂交检
测.
4)转基因抗性愈伤组织的激光扫描共聚焦显
微镜(LSCM)的观察
用激光扫描共聚焦显微镜观察抗性愈伤组织细
胞团中的 GFP 绿色荧光 ,仪器为 Bio-rad MRC 1024
激光扫描共聚焦显微镜 ,观察时物镜放大倍数为 20
倍 ,激发光波长为 488 nm ,发射光波长为 526 nm.
·547·第 5 期　　　　　　　　　熊玲媛等:GFP-mut2 植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达
　图 3　GFP-mut2 的 PCR扩增产物的电泳图
A.GFP-mut2 的 PCR 产物;B.阴性对照;C.DNA
marker DL2 000+15 000
　Fig.3　Agarose gel electropho resis of GFP mut2 PCR prod-
uct
　图 4　中间载体 pBΨG 的酶切鉴定电泳图
D.GFP-mut2 的 PCR 产物;E.pBPF/(EcoR Ⅰ
+BamHI);F.pBΨG/(EcoR Ⅰ +BamHI);G.
DNA marker DL2 000+15 000
　Fig.4　Agarose gel electrophoresis of pBΨG
2　结果和分析
2.1　GFP-mut2的 PCR扩增
根据 GFP 两端序列设计引物 ,以 pGFP-mut2
质粒为模板进行 PCR扩增 ,取 3 μL 电泳 ,结果如图
3.可见 PCR产物有一条特异条带 ,分子量大小在约
750 bp左右.
2.2　中间载体 pBΨG 的构建
PCR产物经 BamHI 和 EcoR Ⅰ双酶切后 ,用胶
回收试剂盒回收 ,与经同样处理的 pBPFΨ7 连接过
夜后 ,转化大肠杆菌 JM101 ,从涂有 AMP 的抗性平
板上挑选单克隆 ,摇菌过夜后提质粒进行双酶切鉴
定 ,结果见图 4 ,筛选到插入片段为 750 bp左右的单
菌落 ,载体命名为 pBΨG.
2.3　植物表达载体 1301 pBΨG 的构建
用 Hind Ⅲ单酶切 ,从中间载体 pBΨG 切下包
含一个植物 35s启动子 ,一个 Ψ增强子 , GFP-mut2
插入序列及 nos终止子的片段 ,与用相同酶单酶切
并去磷酸化处理的载体 pCAMBIA1301连接 ,转化
大肠杆菌 JM 101 ,提质粒用 BamHI/ EcoR Ⅰ双酶切
鉴定 ,结果见图 5 ,可见双酶切后质粒被切下 750 bp
和 340 bp的两个小片段.
选择该阳性克隆测序 ,结果表明目的片段已成
功插入到载体中 ,将该质粒直接转化农杆菌 EHA
105后用来转染植物.
2.4　外源基因整合及表达检测结果
2.4.1　目的基因 PCR检测结果
为证明目的基因已整合到甜菊基因组中 , 以
GUS阳性的抗性愈伤组织的总DNA为模板 , 用
　图 5　1301pBΨG 的酶切鉴定电泳图
A.DNA marker DL 2 000+15 000;
B.1301pBΨG/(EcoR Ⅰ +BamHI);
C.GFP-mut2 的 PCR产物
　Fig.5　Agarose gel electrophoresis of 1301pBΨG
GFPcDNA5 和 3 端两个引物进行 PCR扩增 ,电泳
检测结果如图 6 ,转化的愈伤组织基因组 DNA 扩增
出的基因片段与目的片段大小(758 bp)一致 ,而未
转化的愈伤组织基因组 DNA 未扩增出任何条带.
说明 GFP 基因已经整合到甜菊的基因组中.
2.4.2　转化体基因组 DNA的 PCR-Southern杂交
检测结果
为避免 PCR扩增出现假阳性结果 ,进一步确认
外源基因是否整合到转化体基因组中 ,对转化体总
基因组 DNA 的 PCR扩增产物进行 Southern 转膜
杂交.结果转化体呈现阳性(图 7),确证转化体总基
·548· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002 年
　图 6　转 GFP 基因甜菊愈伤组织的 PCR分析
A.DNA marker DL2 000+15 000 , B.转基因甜菊愈
伤组织的 PCR产物 , C.1301pBΨG 的 PCR 产物 ,
D.非转基因甜菊愈伤组织的 PCR产物
　Fig.6　PCR analysis of the transfo rmed Rebaudiana callus
　图 7 　转 GFP 基因甜菊愈伤组织的 PCR-Southern
blotting分析
A.转基因甜菊愈伤组织的 PCR 产物 , B.
1301pBΨG的 PCR 产物 , C.非转基因甜菊愈
伤组织的 PCR产物
　Fig.7 　PCR-Southern blo tting analysis of the trans-
formed Rebaudiana callus
因组 DNA 的PCR扩增出条带是 GFP 目的片段 ,从
而进一步确定了目的基因已经整合到甜菊基因组
中.
2.4.3　转基因抗性愈伤组织的 GFP 荧光观察
选择在汞灯的广谱光源照射下有较强荧光反应
的甜菊愈伤组织 ,破碎成小的细胞团 ,用 LSCM 观
察 ,可见转基因材料大部分细胞团发出较强的绿色
荧光(图 8).
3　结　论
利用 Ti质粒载体系统将外源基因转化到植物
染色体中是迄今为止最为有效的获得遗传性稳定基
因工程植物的方法.通过 PCR扩增将改良的绿色荧
光蛋白基因 GFP-mut2连入到中间载体 pBPFΨ7 ,
使之带上真核表达启动子 CaMV 35s和 nos终止子
及一个 65 bp的增强子 Ψ后 ,将其插入到植物双元
表达载体 pCAMBIA1301 中 ,构建了带有绿色荧光
蛋白的植物双元表达载体 1301pBΨG.直接将其转
入农杆菌 EHA105 中 ,用于转化甜菊愈伤组织 ,卡
那霉素筛选的抗性愈伤经 X-g luc液染色显示双元
载体上 GUS 基因已得到瞬时表达 , PCR 和 South-
ern blo tting检测表明外源 GFP 基因已整合到甜菊
愈伤组织的基因组中 ,愈伤组织块在荧光显微镜和
激光共聚焦显微镜下可观察到较强烈的绿色荧光 ,
　图 8　GFP 在甜菊愈伤组织中的表达
　Fig.8 　Expression of GFP in the transgenic callus o f
Rebaudiana
表明绿色荧光蛋白基因在转基因甜菊愈伤组织中已
获得了表达.从而建立了以绿色荧光蛋白基因为报
告基因的 、根癌农杆菌介导的甜菊转基因系统.
由于 GFP 作为基因转移报告物和定位标记物
有着无与伦比的优越性 ,因而近年来在细胞分子生
物学中得到了广泛的应用.随着研究的不断深入 ,
GFP在植物分子生物学中的应用空间也已大大拓
展 ,现已广泛地应用于蛋白质定位 、细胞器间信息 、
物质交换 ,病原微生物的分布和与植物的相互作用
的观察以及转基因植物的动态监测.本系统的构建
·549·第 5 期　　　　　　　　　熊玲媛等:GFP-mut2 植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达
为今后进一步构建 GFP 融合蛋白表达载体 , 及分
析相关蛋白在甜菊细胞中的定位和生物学功能奠定
了基础.
参考文献:
[ 1] 　Chalfie M , Tu Y , Euskirchen G , et al.Green fluo res-
cent protein as amarker for gene expression[ J] .Science ,
1994 , 263:802-805.
[ 2] 　Atkins D , Izant J G.Expression and analysis of the green
fluo rescent protein gene in the fission yeast Schizosaccha-
romyces pombe[ J] .Curr.Genet , 1995 , 28:585-588.
[ 3] 　Chiu W , Niw a Y , Zeng W , et al.Engineered GFP as a
vital reporter in plants[ J] .Cur rent Biology , 1996 , 6
(3):325-330.
[ 4] 　Fey P , Compton K , Cox C E.Green fluorescent pro tein
production in the cellular slime molds Polysphondy lium
pallidum and Dictyostelium discoideum [ J] .Gene ,
1995 , 165:127-130.
[ 5] 　Sheen J , Hwang S , Niw a Y , et al.GFP in plants[ J] .
T rends Genet., 1995 , 11:328-329.
[ 6] 　王泽宙 ,邱全胜.绿色荧光蛋白基因 mGFP4 水稻愈伤
组织中的瞬时表达[ J] .北京师范大学学报(自然科学
版), 2000 , 36(3):385-389.
[ 7] 　Wang S , Hazelrigg T.Implication for bcd mRNA local-
ization from spatial distribution of exu protein in
Drosophila oogenesis [ J] .Nature, 1994 , 369:400 -
403.
[ 8] 　Amsterdam A , Lin s , Moss L G , et al.Requirements fo r
g reen fluorescent protein detection in transgenic zebrafish
embryos[ J] .Gene , 1996 , 173:99-103.
Const ruction of the Recombinant Plasmid 1301pBΨG and Expression
of GFP-mut2 in Rebaudiana Callus
XIONG Ling-yuan , CHEN Liang , SHEN Ming-shan , HUANG Yin-yi , CHEN Mu-zhuan
(The School of Life Sciences ,Xiamen Univ.;Education Ministry Key Lab.fo r Cell Biol.and
Tumor Cell Eng.in Xiamen University , Xiamen　361005 , China)
Abstract:A plant expression vecto r 1301pBΨG containing a modified green fluorescent protein(GFP-mut2)
was constructed.GFP-mut2 w as integ rated into the genome of Rebaudiana callus via Agrobacterium tumefa-
ciens EHA 105 mediation.The results showed that an eff icient transgenic sy stem of Rebaudiana via agrobac-
terium tumefaciens-mediated t ransfo rmation had been estabished using GFP gene as the report gene , which will
be valuable to our future research in const ructing vectors of proteins fused to GFP and analyzing their funct ion in
Rebaudiana cells.
Key words:Green fluorescent protein;Rebaudiana;t ransfo rmation;gene expression
·550· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002 年