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中国科学 C 辑:生命科学 2008 年 第 38 卷 第 5 期: 446 ~ 457
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446
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
钙传感蛋白互作激酶 CIPK14参与拟南芥盐和
ABA胁迫应答调节
秦玉芝①②, 李旭①, 郭明①, 邓克勤①, 林建中①, 唐冬英①, 郭新红①, 刘选明①*
① 湖南大学生命科学与技术研究院生物能源与材料研究中心, 长沙 410082;
② 吉首大学资源与环境科学学院, 吉首 416000
* 联系人, E-mail: sw_xml@hnu.cn
收稿日期: 2008-01-07; 接受日期: 2008-01-24
985 工程创新平台、湖南省自然科学基金(批准号: 05JJ30038)和国家自然科学基金(批准号: 30600368)资助项目

摘要 钙和蛋白激酶在植物胁迫应答过程中起重要作用. 本研究以拟南芥蛋白激
酶 CIPK14的 T-DNA插入突变体为材料, 系统研究了 CIPK14基因在不同组织与生
长发育期的表达情况, 和 CIPK14 基因的钙调节属性及其在胁迫应答过程中的作用.
研究发现 CIPK14基因在拟南芥根、茎、叶、花各组织器官中都有所表达, 其中花器
官和根部表达量较为显著; 不同阶段比较发现 CIPK14 在幼苗期具有较高的转录水
平. 研究同时发现, ABA和盐胁迫能激活CIPK14基因的转录; CIPK14 T-DNA插入突
变体中一系列胁迫应答基因的转录水平全都不同程度地降低或表达滞后, 说明
CIPK14基因在胁迫应答中起作用. 另外, CIPK14突变体的种子萌发和根伸长对各种
渗透胁迫敏感, 并且ABA合成抑制剂哒草伏(Norflurazon)能部分恢复突变体对ABA,
盐等的敏感表型. 进一步证明 CIPK14是胁迫应答相关基因. 研究还发现, CIPK14的
转录受到极端浓度下外源钙离子的激活, 另外在一定胁迫条件下, 突变体中 RD29A
基因的表达对外源钙离子浓度变化不敏感, 说明CIPK14基因功能缺失降低了受钙调
节的胁迫相关基因对外源钙的敏感性. 相应的表型分析发现, 突变体种子萌发和根
伸长与野生型相比对外源钙敏感性下降, 进一步证明 CIPK14 基因接受钙信号调节,
并作用于拟南芥 ABA和盐胁迫应答信号途径, 激活胁迫相关转录因子.
关键词
钙
CIPK14
ABA
盐
胁迫应答
种子萌发


植物在生长过程中 , 往往通过调节一系列胁
迫相关基因在不同时间和空间的表达, 来实现其对
盐、干旱、洪涝、温度和氧化应激等不同环境胁迫的
应答. CIPK 类激酶因与 CBL 蛋白相互作用而得名[1~3].
CIPK 属于一类新的植物特异性丝氨酸苏氨酸蛋白激
酶家族, 结构与酵母菌的 SNF1 激酶和动物的 AMPK
激酶极其相似[4,5]. 由于这种结构的相似性, CIPKs 也
被纳入植物 SNF 激酶家族的 SnRK3 亚族[6]. 拟南芥
基因组中包含 25 个 CIPK 基因. CIPKs 之间不仅蛋白
序列存在差异, 它们的功能部位和作用底物也不尽
相同. 但是在CIPKs蛋白的C末端与 CBL 互作的结
构域却相当保守. CIPKs 的这种底物特异性和附因子
结合特异性预示着 CBL-CIPK 结合水平上的可调节
性. 许多钙依赖性信号途径的进程都取决于功能性
CBL-CIPK 复合体的形成[7~9]. 研究发现, CBL1 和
CIPK1 的相互作用依赖于微量 Ca2+的存在 . 这种




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CBLs 和 CIPKs Ca2+依赖性相互作用与动物中普遍存
在的钙受体与特异目的蛋白互作模式相似[1]. 据此推
断 Ca2+离子在植物胁迫应答过程中起作用. 盐胁迫
和冷胁迫都能导致细胞内Ca2+的积累, 进而激活Ca2+
传感器 SOS3, SOS3 可与 SOS2/CIPK24 互作[6,10,11].
CIPK3 是 CIPK15 的类似物, 它通过 NAF 结构域与
CBL 钙受体蛋白结合, 并抑制受 ABA 诱导的基因表
达[12]. 由于 CBL/CIPK 互作和酶活性对钙的依赖性
各不相同, 因此植物体内 CIPK 激酶活性的钙依赖性
研究得还不够详尽.
本研究以拟南芥蛋白激酶 CIPK14 的 T-DNA 插
入突变体为材料, 系统研究了CIPK14在盐和ABA胁
迫应答中的调节作用, 及其在盐和 ABA(abscisic acid)
胁迫条件下 CIPK14 的钙调节属性. 同时, 为了解
CIPKs 根据环境变化和生长发育需要进行表达的特
异性, 对 CIPK14 基因的表达模式进行了系统分析研
究.
1 材料与方法
1.1 材料、胁迫处理和种子萌发
拟南芥种子用 70%的乙醇表面灭菌 1 min, 30%
次氯酸钠灭菌 10 min, 然后用无菌水冲洗 5 次, 每次
处理后播种约 100 粒种子.
盐、ABA 胁迫处理: 光照培养 3 周后的野生型幼
苗浸泡于浓度 300 mmol/L 的 NaCl 或 100 μmol/L 的
ABA 中, 分别于 0, 1, 2, 4, 6 h 收取材料, 材料随后液
氮速冻, 保存于−80℃冰箱中备用. 不同胁迫下的种子
萌发率检测: 将经过灭菌的种子播种于含不同浓度试
剂的 MS 培养基[13]中, 4℃春化 4 天后于 23℃全日照培
养, 统计萌发率, 连续进行 6 天. 哒草伏(Norflurazon)
恢复表型实验: 在加MS培养基之前, 先将100 μmol/L
哒草伏和一定浓度的渗透剂(0.35 μmol/L ABA, 150
mmol/L NaCl, 6%葡萄糖和 0.25 mol/L 甘露醇)加入培
养皿中, 然后倒入预冷的培养基摇匀 , 同时设置对
照. 4℃处理 4 天后转入连续光照下培养, 连续统计
6 天. 结果取 3 次独立实验的平均值 ± 标准误差.
1.2 CIPK14和胁迫相关基因的 RT-PCR分析
采用安比奥公司生产的 RNA 提取试剂盒, 提取
总 RNA; RNase free 的离心管中加约 2 μg 的总 RNA
和 0.5 μg Olig(dT)15, 混匀, 4℃短暂离心, 65℃水浴 7
min 后, 立即冰浴冷却. 离心后, 依次加入 10×Buffer
2.5 μL, 10 mmol/L dNTPs 1.25 μL, RNaseA 抑制剂
25 U, M-MLV 逆转录酶 200 U, 加 RNase free 的水至
25 μL, 42℃反应 60 min 后, 70℃水浴 10 min 使酶失
活, 即得 cDNA第一链. 之后分别进行PCR退火温度、
引物浓度、镁离子浓度和模板浓度优化实验. 根据优
化的条件, 进行 95℃预变性 5 min; 95℃变性 30 s, 55~
60 (℃ 因目的基因而异)退火 30 s, 72℃延伸 30 s; 循环
数为 20~27个(因目的基因而异), 最后 72℃延伸 5 min,
CIPK14 (F:576~599 bp, R:1038~1017 bp)和胁迫相关基
因引物见表 1. 反应结束后, 取 16 μL PCR 反应液, 在
1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳. 每个实验的 RT-PCR
反应至少重复 3次, 以持家基因Actin(ACT2)的 PCR产
物作为分子内标, 用定量软件 Image J (http: //rsb.info.
nih.gov/ij/)计算所检测基因的相对水平.
1.3 CIPK14 T-DNA插入突变体的筛选和 PCR分
析
本研究从美国 Salk 研究院遗传分析实验室(Salk
Institute Genomic Analysis Labratory)购买了 2 组
CIPK14 T-DNA 插入突变体 SALK_009699 和 SALK_
147899. 根据 ATIDB(The Arabidopsis thaliana Inte-
grated Database)提供的信息, 分别确定了每个突变系
T-DNA 插入的具体位置. 并根据插入位点分别设计
引物 R, F (表 2), 结合 ATIDB 提供的 T-DNA 左边界
筛选引物 R0 进行纯合子的筛选. 筛选得到的各突变
株系纯合子继续做表型分析及 RNA 表达分析.
1.4 下胚轴和根伸长分析
拟南芥种子用 70%的乙醇表面灭菌 1 min, 30%
次氯酸钠灭菌 10 min, 然后用无菌水冲洗 5 次, 播种
于含 0.8%琼脂的 MS 培养基中, 4℃春化 4 天后置于
23℃全日照培养. 培养 6 天后统计幼苗的下胚轴和根
的长度. ABA 胁迫下根伸长的分析: 将 3 天苗龄的突
变体和野生型幼苗分别移栽到含 0, 20, 30, 40 μmol/L
ABA 的 MS 培养基上培养 12 天, 然后比较两者的根
长. 结果取 3 次独立实验的平均值 ± 标准误差.
1.5 外源钙处理
光照培养3周后的野生型(col-4)和CIPK14突变体
(cipk14)植株, 分别浸泡于含 0.25 μmol/L ABA 或 125
mmol/L NaCl 的不同浓度 ( 0, 0.1, 1, 10, 100 mmol/L)




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表 1 RT-PCR 中的引物
基因 引物序列 a)
Actin F: 5′-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3′ R: 5′-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3′
CIPK14 F: 5′-CAAAGTCTCCAAGGGCAGGTTCT-3′ R: 5′-CGTCTGCGGATTCGTGTCTAAAA-3′
RD29A F: 5′-GCGGGAACTGTTGATGAG-3′ R: 5′-ACCAAACCAGCCAGATGA -3′
RD29B F: 5′-AAGGAGACGCAACAAGGG-3′ R: 5′-ACGGTGGTGCCAAGTGAT-3′
RD22 F: 5′-TTCGGAAAAGCGGAGAT-3′ R: 5′-CTTTGAAGGCCAAGTGGT-3′
RAB18 F: 5′-GAATGCTTCACCGCTCCG-3′ R: 5′-ACGACCGAATGCGACTGC-3′
KIN1 F: 5′-CGCTGGCAAAGCTGAGGA-3′ R: 5′-TTCGGATCGACTTATGTATCGT-3′
KIN2 F: 5′-CTGGCAAAGCTGAGGAGA-3′ R: 5′-CGTAGTACATCTAAAGGGAG-3′
DREB1A F: 5′-GGCGGGTCGTAAGAAGTT-3′ R: 5′-GATCCGTCGTCGCATCAC-3′
DREB2A F: 5′-CTGTTGAGACTCCTGGTT-3′ R: 5′-GAGGTATTCCGTAGTTGA -3′
SOS2 F: 5′-CTACAAAAGCAGTGCAGTGT-3′ R: 5′-CTACCTTTTGTGAAGTCCTCC-3′
a) F(Forward primer):正向引物; R (Reverse primer):反向引物

表 2 CIPK14 T-DNA 插入突变体筛选中的引物
基因 引物序列 a) 位点
R0 5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3′
SALK_009699 F: 5′-CAAAGTCTCCAAGGGCAGGTTCT-3′ R: 5′-GTCTGCGGATTCGTGTCTAAAA-3′
176~198 bp
390~370 bp
SALK_147899 F: 5′-AGGTCCTCGCCACCAAATCCAA-3′ R: 5′-CCGGCGTACCACAGAGTGTGTG-3′
509~531 bp
805~784 bp
a) F(Forward primer):正向引物; R (Reverse primer):反向引物

CaCl2 溶液中, 30 h 后收材料, 并立即进行液氮速冻,
保存于−80℃冰箱备用. 将约 100 粒野生型和突变体
种子分区播入含 0.45 μmol/L ABA 或 150 mmol/L
NaCl 并同时含不同浓度(0, 0.1, 1, 10, 50 mmol/L)钙
离子的 MS 培养皿中, 设置对照. 4℃春化 4 天后置于
23℃长日照培养, 光照培养 6 天统计萌发率. 胁迫条
件下根伸长实验: 种子消毒后播种在 MS 培养基上,
4℃春化 4天后光照培养, 2天后移栽到含 0.15 μmol/L
ABA 的 MS培养基上, 相同条件下培养 1 周后测量根
的长度并照相.
2 结果
2.1 拟南芥 CIPK14基因的时空表达特异性分析
表达的组织特异性和时间性可以为研究基因的
功能提供很好的线索. 本实验首先对 CIPK14 在拟南
芥不同部位和不同生长发育期的表达情况进行研究.
通过收集拟南芥的种子、胚胎期、子叶期、2 片真叶
期、抽薹初期及开花期植株的材料和成熟植株各部位
包括: 根、茎、莲座叶、茎生叶、花和幼果荚提取总
RNA 进行 RT-PCR 分析. 结果表明: 拟南芥花器官中
的 CIPK14 表达量最高, 约为莲座叶的 3 倍左右, 其
次是根部 ; 而果荚、茎和营养叶中表达量较低(图
1(a)). 另外子叶期、2 片真叶期直到抽薹初期一直是
CIPK14表达的高峰时期, 即CIPK14主要在拟南芥幼
苗生长期表达(图 1(a)).
研究同时发现, 高浓度的盐和 ABA 能够诱导
CIPK14 基因的强烈表达, 并且表达量随着处理时间
的增加而显著提高(图 1(b)).
2.2 拟南芥 CIPK14 T-DNA插入突变体分子鉴定
与纯合子筛选
CIPK14 基因(TAIR: At5g01820, GI: 831765)全长
1.8 kb, 仅由 1 个外显子构成 . 为了进一步研究
CIPK14 基因的功能, 本研究从美国 Salk 研究院遗传




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分析实验室购 2 组 CIPK14 T-DNA 插入突变体
—SALK_ 009699 和 SALK_147899. 根据 ATIDB (The
Arabidopsis thaliana Integrated Database)提供的信息,
分别确定了每个突变系 T-DNA 插入的具体位置(图
2(a)). 并根据插入位点分别设计引物 R, F, 结合
ATIDB提供的T-DNA左边界筛选引物R0进行纯合子
的筛选.
购买来的种子经消毒后播种于含卡那霉素 40
μg/mL MS 固体培养基上, 待成活的幼苗长出 4~6 片
真叶时, 提取 DNA 进行 T-DNA 插入位置的 PCR 鉴
定. 筛选出 SALK_009699 的 6 个纯合子 1 个杂合子,
SALK_147899 的 3 个杂合子(图 2(b)). 接着提取经过
鉴定的株系的总 RNA 进行 RT-PCR 分析, 结果表明
突变体中 CIPK14 基因的表达受到抑制(图 2(c)). 最

图 1 CIPK14 基因的表达模式
(a) 收集拟南芥的种子、胚胎期、子叶期、2 片真叶期、抽薹初期及开花期植株的材料, 以及成熟植株各部位(根、茎、莲座叶、茎生叶、
花和幼果荚)提取总 RNA 进行 RT-PCR 分析. RT-PCR 分别使用 CIPK14 和 Actin 特异引物, 电泳图的上方是相应的柱状图, RNA 的表达量
为 CIPK14/Actin 的相对强度. R 示根; ST 示茎; RL 示莲座叶; CL 示茎生叶; F 示花; SI 示果; S 示种子; E 示胚胎期; C 示子叶期; TL 示两片
真叶期; BF 示花前期; FS 示开花期. (b) 将 3 周苗龄的野生型植株分别用 100 μmol/L ABA 和 300 mmol/L NaCl 处理, 按处理时间的长短不同收
取材料, 提取总 RNA, RT-PCR 分析植株 CIPK14 基因的表达情况. 图中数字表示处理时间, 电泳图的下方是相应的曲线图, RNA 的表达量为
CIPK14/Actin 的相对强度




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图 2 CIPK14 插入突变体的分离与鉴定
(a) 拟南芥 CIPK14 基因的示意图. 黑色方框表示外显子. 三角形指示 T-DNA 插入位点, 数字表示核苷酸数. LB: 左边界; RB: 右边界; (b)
cipk14 突变体纯合子鉴定, 提取基因组 DNA, 用位于插入位点两侧的引物(RF, 每组左侧加样孔样品)和 ATIDB 提供的 T-DNA 左边界筛选引
物(FR0 , 每组右侧加样孔样品)进行 PCR, 其中 SALK_009699 的 1, 4, 5, 6, 7, 8 号鉴定为纯合子, 2 号鉴定为杂合子, 3 号鉴定为野生型;
SALK_147899 的 2, 3, 4 号鉴定为杂合子, 1 号鉴定为野生型. (c) 提取总 RNA, 用 CIPK14(上)和 Actin2(下)特异的引物进行 RT-PCR 鉴定
cipk14 突变体纯合子. (d) 正常白光下生长 15 天苗期长势. (e) 50 μmol·m−2·s−1连续白光下培养 6 天的拟南芥野生型和 cipk14 突变体下胚轴长
度和根长度的比较

后收集各突变株系纯合子种子用于做表型分析及后
续研究. 研究中 2 组突变体都用于每种处理的预实验,
详尽的研究和最终数据采用 SALK_009699(在下文统
一命名为 cipk14 突变体)株系得到. 在本研究中, 正
常栽培条件下 cipk14 突变体苗期的长势稍差于野生
型(图 2(d)), 主要表现为下胚轴和根的长度比野生型
短(图 2(e)), 这一结果刚好与 CIPK14 主要在苗期表
达的特征相符合. 成熟期CIPK14的T-DNA插入突变
体在外部表型上与野生型没有明显的差别.
2.3 CIPK14调节拟南芥胁迫应答基因的表达
由于正常条件下 cipk14突变体除了苗期的长势稍
差于野生型外(图 2(d)), 成熟期在外部形态上与野生
型没有明显的差别. 而前面的实验证实了 CIPK14 能
被 ABA 和盐胁迫强烈诱导, 预示着 CIPK14 可能在拟
南芥 ABA 和胁迫应答中起作用. 为了从分子水平上研
究CIPK14突变是否引起拟南芥特定胁迫应答信号途径
的变化, 本实验运用 RT-PCR 的方法比较了胁迫条件下
野生型和 cipk14 突变体中一系列受到盐、ABA、冷和
干旱强烈诱导的胁迫应答基因, 包括: RD29A, RD29B,
KIN1/2, AB18 和DREB 等表达的变化情况. 和之前的报
道一样[14~17], 野生型内所有被检测的标记基因都显著
地受 ABA, NaCl 诱导表达, 并且野生型 col-4 和 cipk14
突变体之间存在明显差异(图 3). ABA 处理后，野生型
和 cipk14 突变体中的 RD29B 在诱导的前 4 h 都处于较
低的转录水平, 在处理的第 6 h 升高到最大值, 此时野
生型中 RD29B 表达量的增加幅度显著高于突变体.
ABA 作用 6 h 后野生型中RAB18 表达量是 cipk14 突变




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体中的 2倍. 与野生型相比, 相同条件下KIN 在 cipk14
突变体中的转录水平下降了 40%(图 3(b)).
RD29B 在盐胁迫下的表达趋势与 ABA 胁迫下基
本相同, 只是盐胁迫下的第 6 h 野生型与突变体中
RD29B 的表达量差距达到 5 倍(图 3(d)). 另外突变体
中 KIN1/KIN2 的诱导峰值比野生型推迟 2 h 出现. 转
录因子 CBFs/DREBs 通过识别结合 RD29A 和 KIN1/
KIN2 基因启动子部位 cis-因子 (CRE/DRE)调节
RD29A 和 KIN1/KIN2 基因的表达[17,18]. 编码 CBFs/
DREBs 转录因子的基因本身就是胁迫相关基因, 同
样受到盐和 ABA 的诱导. 本研究也证实了这一点.
ABA 诱导仅 1 h 突变体和野生型中 DREB1A/DREB2A
的表达量就达到了峰值 , 虽然突变体中 DREB1A/
DREB2A 的整体转录水平不到野生型的 45%, ABA
诱导 2 h 后转录呈下降趋势(图 3(b)). 这一发现再一
次说明DREB类蛋白是RD/KIN基因的转录激活因子.


图 3 ABA 和盐胁胁迫下野生型 col-4 与 cipk14 突变体植株中胁迫应答基因的表达
(a) 将 15 天苗龄的野生型 col-4 与 cipk14 突变体植株分别用 100 μmol/L ABA 处理, 按处理时间的长短不同收取材料, 提取总 RNA,
RT-PCR 分析植株胁迫应答基因的表达情况. (b) 相应的柱状图, RNA 的表达量为 CIPK14/Actin 的相对强度. (c) 将 15 天苗龄的野生型
col-4 与 cipk14 突变体植株分别用 300 mmol/L NaCl 处理, 按处理时间的长短不同收取材料, 提取总 RNA, RT-PCR 分析植株胁迫应答基
因的表达情况. (d) 相应的柱状图, RNA 的表达量为 CIPK14/Actin 的相对强度. 结果取 3 次独立实验的平均值±标准误差




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不同的是, 盐胁迫下突变体中 DREB1A/DREB2A的诱
导峰值比野生型延迟 4 h 出现(图 3(d)).
有趣的是在 ABA 和盐诱导下, cipk14 突变体中
SOS2/SOS3 的表达量与野生型相比也显著降低(平均
减少量达到 60%)(图 3), 这一结果预示着 CIPK14 可
能参与拟南芥 SOS2/SOS3 相关胁迫信号途径的调节
作用.
2.4 拟南芥 cipk14突变体对胁迫的敏感性分析
为了进一步证实 CIPK14 基因在拟南芥胁
迫/ABA 信号传导途径中的作用, 从表型上分析了
cipk14 突变体对胁迫的敏感性. 将 cipk14 突变体和野
生型 col-4 的种子同时播种在含不同浓度梯度 ABA,
盐(NaCl), 葡萄糖(Glucose)和甘露醇(Mannitol)的同
一 MS 培养基上进行全日照培养, 连续 6 天统计萌发
率和观察幼苗生长情况. 结果表明, cipk14 突变体对
所有测试胁迫条件敏感, 胁迫作用下突变体的萌发
要比野生型延迟 2~3 天(图 4(b)). 在含 0.35 μmol/L
ABA 的培养基中, 突变体的萌发严重受阻, 光照培
养的第 6 天, 野生型的萌发率为 93%, 而突变体只有
45%. 150 mmol/L NaCl 培养基条件下, 光照培养的第
2 天野生型的萌发率就达到 35%, 而突变体延迟 4 天
才接近这个萌发率(图 4(b)); 第 6 天野生型的萌发率
达到 89%. 另外, 突变体对 6%葡萄糖的反应与野生
型相似, 而 0.25 mol/L 甘露醇几乎完全抑制 cipk14 的
萌发(相同条件下野生型的萌发率为 25%)(图 4).
为了分析盐、葡萄糖和甘露醇胁迫下 cipk14 突
变体萌发受阻是否与植株体内 ABA 代谢发生变化有
关. 将 ABA 合成抑制剂哒草伏[12,19]加入含各种渗透
剂的 MS 培养基中, 在普通 MS 培养基中加入哒草伏
后突变体与野生型的萌发率都没有受到影响. 然而,
在含盐的培养基中加入 ABA 合成抑制剂则部分恢复
了突变体的表型(与盐胁迫对照相比突变体的萌发率
提高了 4 倍). 相反在 6%葡萄糖和 0.25 mol/L 甘露
醇中加入哒草伏没有恢复突变体的表型(图 4(c)), 预
示着 CIPK14 同时还可能参与除 ABA 相关信号途径
以外的其他胁迫信号途径. 鉴于 cipk14突变体的种子
萌发对 ABA, NaCl, 葡萄糖和甘露醇敏感, 我们接着
检测突变体根系伸长对 ABA 的敏感性. 将 2 天苗龄
的突变体和野生型幼苗分别移栽到含 0, 20, 30,
40 μmol/L ABA 的 MS 培养基上培养 2 周, 然后比较
两者的根长. 结果表明, 突变体的根系伸长对外源
ABA 较敏感(图 4(d)).
2.5 外源钙对 CIPK14基因转录水平的影响
Ca2+作为胞内信号分子在许多植物激素信号传
导途径中起作用. 越来越多的证据说明 Ca2+是胁迫
和 ABA 信号传导途径中的第二信使. 保卫细胞内的
Ca2+在 ABA 应答过程中出现增高和降低的反复波动,
出现所谓的 Ca2+钟摆效应调节作用 [20]. 不同个体
CBLs 的钙亲和力有较大差异, CBL/CIPK 互作和酶
活性对钙的依赖性也各不相同. 钙依赖的 CBL/CIPK
互作研究得还不够详尽. 为了分析 CIPK14 在胁迫应
答过程中的钙依赖性, 将 15 天苗龄的野生型和突变
体植株处于不同外源钙条件下的 ABA(0.25 μmol/L)
和盐胁迫(125 mmol/L NaCl)中, 分析 2 种株系中
CIPK14 的表达情况. 结果发现, 非胁迫条件下外源
钙浓度低于 0.1 mmol/L 或者达到 100 mmol/L 时
CIPK14都能被强烈诱导表达, 说明CIPK14的功能是
钙依赖性的(图 5(a)). 有趣的是, 较高的 Ca2+浓度都
能加强 ABA 胁迫信号, 相反极端浓度, 尤其是低浓
度Ca2+条件下CIPK14对盐胁迫更敏感. 说明CIPK14
在 ABA 和盐胁迫应答中是钙依赖性的(图 5(b)).
ABA 和盐胁迫下给予不同浓度的外源钙处理,
分析 cipk14突变体中胁迫应答基因的表达情况, 有助
于进一步阐明 CIPK14 在胁迫信号传导中的钙调节属
性 . 研究发现 , 野生型中 RD29A 的表达情况与
CIPK14 相似, 而突变体中 RD29A 的转录都维持在较
低水平. 同时由于CIPK14功能缺失导致ABA胁迫下
RD29A 对钙的敏感性降低; 盐胁迫下 RD29A 对低浓
度和高浓度的钙离子都很敏感. 这一结果进一步支
持了 CIPK14 在 ABA 和盐胁迫应答中是钙依赖性的
推断(图 5(a)).
2.6 ABA和盐胁迫下拟南芥 cipk14突变体种子萌
发和根伸长对外源钙的敏感性分析
为了进一步了解 CIPK14基因缺失是否影响拟南
芥钙依赖性胁迫应答反应, 继续对在 ABA 和盐胁迫
条件下, 拟南芥 cipk14突变体种子萌发和根伸长对外
源钙离子的敏感性进行了分析. 研究发现, 非胁迫条




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图 4 cipk14 突变体对 ABA 和渗透胁迫敏感
(a) col-4 和 cipk14 突变体在分别含 0.35 μmol/L ABA, 6%葡萄糖, 150 mmol/L NaCl，0.25 mol/L 甘露醇的 MS 培养基中的萌发情况, 23℃连
续光照培养 6 天时的照片. (b) 不同胁迫条件下转入光照培养后连续 6 天的萌发率统计图. (c) ABA 合成抑制剂百草伏恢复突变体对胁迫
的敏感表型. 图为处理 6 天后的统计结果. NFZ: 百草伏. (d) 将光照培养 2 天的突变体和野生型幼苗分别移栽到含 0, 20, 30, 40 μmol/L
ABA 的 MS 培养基上继续培养 2 周后测量根长并进行分析统计. 结果取 3 次独立实验的平均值±标准误差




秦玉芝等: 钙传感蛋白互作激酶 CIPK14 参与拟南芥盐和 ABA 胁迫应答调节


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件下 cipk14 突变体种子的萌发受到外源钙离子浓度的
影响不大(图 6(a)), 光照培养 6 天以后, cipk14 突变体
种子在各种钙离子浓度下的萌发率相当. 野生型种子
在钙离子浓度低于 1 mmol/L (0.1, 0 mmol/L)或高于 10
mmol/L (50 mmol/L)的条件下光照培养 2~3 天后才开
始萌动. 有趣的是, 当不同的钙离子浓度条件下加上
0.45 μmol/L ABA 后, 在含 1, 10 和 50 mmol/ L Ca2+的
培养基中, 野生型光照培养 6 天以后的萌发率分别为

图 5 ABA 和盐胁迫条件下 CIPK14 和胁迫应答基因的表达受外源钙的影响
(a) RT-PCR 分析 0.25 μmol/L ABA 和 125 mmol/L NaCl 胁迫条件下不同外源钙(0, 0.1, 1, 10, 100 mmol/L)对 CIPK14 基因表达的影响. (b)
比较分析野生型和突变体经 0.25 μmol/L ABA 和 125 mmol/L NaCl 胁迫条件下不同外源钙(0, 0.1, 1, 10, 100 mmol/L)处理 30 h 后, RT-PCR
分析 RD29A 的表达情况. Actin 作为分子内标



图 6 ABA 和盐胁迫下拟南芥 cipk14 突变体种子萌发和根伸长对外源钙的敏感性分析
(a) 将野生型和突变体的种子播种在含不同钙离子浓度并分别含 0.45 μmol/L ABA 和 150 mmol/L NaCl 的 MS 培养基中同时设置对照, 光
照培养 6 天统计萌发率. (b) 将野生型和突变体的种子播种在含 0.15 μmol/L ABA 和不同钙离子浓度的 MS 培养基中光照培养 6 天统计主
根长度. 结果取 3 次独立实验的平均值±标准误差




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62%, 45 %和 24%; 含 0 和 0.1 mmol/L Ca2+培养基中
的萌发率为 32.3%和 54%(图 6(a)). 这一结果正好与
同一条件下 CIPK14 基因的表达变化趋势相似, 说明
较高或较低的钙离子浓度下拟南芥对 ABA 胁迫信号
的敏感性增加. 不同的是 cipk14突变体的萌发率都维
持在 45%~55%之间. 这一现象可能是由于 Ca2+的钟
摆效应影响到拟南芥苗期 CIPK14 对 ABA 胁迫应答
的结果. 在 150 mmol/L NaCl 处理下当 Ca2+浓度低于
1 mmol/L 时, 野生型种子几乎不萌发(图 6(a)), 少数
萌发的突变体和野生型种子都不能最后成苗. 这与
之前的报道 [21,22]和本研究结果极其一致: 增加外源
Ca2+能减低 NaCl 的毒性.
我们同时比较了含 0.15 μmol/L ABA和不同钙离
子浓度的 MS 培养基中野生型和突变体根伸长情况.
图 6(b)结果支持 CIPK14 在 ABA 和盐胁迫应答中是
钙依赖性的结论, 与 cipk14 突变体相比, 野生型根系
伸长对外源低浓度钙离子更敏感.
3 讨论
许多细胞外信号包括光、生物因子、非生物胁迫
因子等都能引起植物内源 Ca2+离子浓度的变化[23~25].
分子生物学研究发现, ABA 依赖的信号途径和不依
赖 ABA 的信号途径之间往往可以通过一些特定的信
号分子相互联系在一起 [26,27]. 钙离子是目前已经被
广泛认可的能介导这种互作的信号分子. 人们在分
析特定的胁迫信号时, 经常会去关注这个信号是否能
引起胞内 Ca2+浓度变化，还是会受到 Ca2+信号的调控.
处于 Ca2+信号下游的因子往往能影响到胞内 Ca2+的释
放. 如保卫细胞在进行 ABA 应答时胞内会发生 Ca2+
浓度升高与下降频繁交替出现的特异现象, 也就是所
谓的 Ca2+钟摆效应-信号输出的主要调节方式[20, 28].
通过对拟南芥不同组织器官以及不同生长发育
期 CIPK14 基因表达特异性分析, 发现 CIPK14 基因
在花器中的转录水平最高, 根部次之. 生长过程中苗
期检测到高通量 CIPK14 基因的表达, 结合 cipk14 突
变体幼苗生长滞后的外部表型, 推测 CIPK14 可能与
拟南芥早期发育及根伸长有关. CIPK14 是否与开花
相关联还有待进一步研究.
通过分析 ABA(100 μmol/L)和盐(300 mmol/L)胁
迫条件下拟南芥野生型中 CIPK14 基因的表达情况,
发现 CIPK14 的转录水平在胁迫处理后 2 h 便迅速增
加, 并随处理时间延长不断提高. 说明 CIPK14 基因
的转录受到环境胁迫的诱导; DREB1A/DREB2A 作为
COR/RD/KIN类基因的转录激活因子本身也是胁迫应
答基因, 有趣的是, ABA 胁迫下它们的转录水平也因
为 CIPK14 基因的功能缺失而降低. RA29A, RD29B 和
RAB18 的启动子部位都含有 ABRE 调节元件[29~31],
能被 ABA 诱导表达. 研究中比较 CIPK14 T-DNA 插
入突变体和野生型经 ABA 和盐处理后 RA29A,
RD29B, RAB18 的表达情况发现, 这些基因的转录水
平全都不同程度地降低或表达滞后. 另外, RD22 受
到MYC/MYB 类转录因子调控[32,33], 同样盐胁迫下突
变体中 RD22 的表达也受到影响 . 以上结果显示
CIPK14 可能位于胁迫相关基因转录调节因子的上游,
与特异性转录调节因子的活化有关. 之后通过比较在
各种不同浓度渗透剂(NaCl, ABA, 蔗糖, 葡萄糖, 果
糖, 甘露醇)处理下突变体和野生型的种子萌发和根伸
长情况发现, CIPK14 突变体的种子萌发和根伸长对各
种渗透胁迫敏感 , 并且 ABA 合成抑制剂白草伏
(Norflurazon)能部分恢复突变体的对 ABA、盐等的敏
感表型. 进一步证实 CIPK14 是胁迫应答相关基因.
为了确定 CIPK14激酶活性是否受到胞内钙离子
浓度的影响, 通过考察外源钙对 CIPK14 基因表达的
影响发现, CIPK14 的转录受到极端浓度下外源钙的
激活, 说明外源钙调节 CIPK14 基因的表达; 进一步
比较 CIPK14 T-DNA 插入突变体和野生型在 0.25
μmol/L ABA 或 125 mmol/L 盐胁迫条件下, 处于不同
浓度的外源钙离子处理 30 h, 之后分析胁迫应答基因
RD24A 的表达情况发现, 突变体中 RD29A 基因的表
达量受钙影响程度明显低于野生型, 说明 CIPK14 基
因功能缺失使得受钙调节的胁迫相关基因对钙的敏感
性降低. 同时突变体种子萌发和根伸长与野生型相比
对外源钙离子的敏感性也相应降低, 胁迫条件下施与
不同浓度的外源钙离子处理后, 突变体种子的萌发率
维持在 45%~55%之间的范围内, 相反, NaCl 处理下
Ca2+浓度低于 1 mmol/L 时野生型种子几乎不萌发. 进
一步说明 CIPK14 基因接受钙信号调节, 激活胁迫相
关转录因子, 作用于拟南芥胁迫应答信号途径.




秦玉芝等: 钙传感蛋白互作激酶 CIPK14 参与拟南芥盐和 ABA 胁迫应答调节


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致谢 感谢林辰涛教授 (University of California, Los Angeles, USA) 对该研究工作的全力支持与悉心指导！
感谢何跃辉博士(National University of Singapore, Singapore)和邓子牛博士(湖南农业大学)在英文撰写
方面的热情帮助!
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