全 文 ：免疫学杂志 2013 年 3 月 第 29 卷 第 3 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 29 No. 3 Mar. 2013
·论 著· [文章编号]1000-8861（2013）03-0190-05
雪胆素乙对小鼠淋巴细胞体外活化及增殖的影响
王 遥，刘坤鹏，宋方茗，潘 浩，徐丽慧，欧阳东云，何贤辉 *
[摘 要] 目的 分析雪胆素乙（Cucurbitacin IIb, CuIIb）对丝裂原刺激的小鼠淋巴细胞体外活化、增殖及促炎因子表达的影
响，探讨其潜在的抗炎效应及作用机制。 方法 以 WST法检测 CuIIb对刀豆蛋白 A（Con A）刺激的淋巴细胞增殖的作用，利用流式
细胞术分析小鼠淋巴细胞活化抗原 CD69 和 CD25 以及促炎因子肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素 6（IL-6）表达的影响。
结果 CuIIb能明显抑制 Con A刺激引起的淋巴细胞的增殖作用， 并呈现剂量依赖性； 经 CuIIb处理后，T细胞早期活化标志分子
CD69 和中期活化分子 CD25 的表达受到明显抑制； 同时，CuIIb 以剂量依赖方式抑制 Con A 诱导的促炎因子 TNF-α 和 IL-6 在
CD3+T细胞中的表达。 结论 CuIIb对小鼠淋巴细胞的活化、增殖均具有明显抑制作用，同时减少炎症相关细胞因子的表达，提示
其通过对适应性免疫的调控发挥抗炎效应。
[关键词] 雪胆素乙； 淋巴细胞； CD69； 刀豆蛋白 A； 促炎因子
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A
The effects of cucurbitacin IIb on the in vitro activation and proliferation of
mouse lymphocytes
WANGYao1,LIUKunpeng1,SONGFangming2,PANHao1,XULihui3,OUYANGDongyun1,HEXianhui1,*
1. Department of Immunobiology, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510630,
China; 2. School of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 3. Department of Cell Biology,
College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510630, China
*Corresponding Author: HE Xianhui, E-mail: thexh@jnu.edu.cn
[Abstract] This study aimed to explore the potential anti -inflammatory effect and the underlying action
mechanism of cucurbitacin II b (CuIIb) by using concanavalin A (Con A)-activated mouse lymphocytes as a model.
The effect of CuIIb on cell proliferation was measured by a modified MTT assay. The expression levels of activated
antigens CD69 and CD25 as well as the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin
(IL) -6 in CD3 + T lymphocytes were evaluated by fluorescent staining together with flow cytometry. Our results
showed that CuIIb inhibited Con A-induced proliferation of lymphocytes in a dose-dependent manner. And CuIIb
also suppressed significantly the expression levels of CD69 and CD25 on the surfaces of CD3+ T cells. Meanwhile,
Con A-induced expression of TNF-α and IL-6 in CD3+ T cells was also inhibited in the presence of CuIIb. These
results demonstrated that CuIIb could inhibit the activation and proliferation of Con A-stimulated mouse lymphocytes,
and decrease the pro-inflammatory cytokines expression, suggesting that CuIIb might display anti-inflammatory activity
via modulating adaptive immunity.
[Key words] Cucurbitacin IIb; Lymphocyte; CD69; Concanavalin A; Pro-inflammatory cytokine
雪胆素乙（Cucurbitacin IIb, CuIIb）是从葫芦科
雪胆属植物雪胆（Hemsleya amalils Diels）中提取的一
种四环三萜类产物，是葫芦素家族的一个成员，化学
名为 23,24-双氢葫芦素 F[1]。 雪胆是我国西南地区各
民族常用的中草药、民族药，具有清热解毒、抗菌消炎
的功效，广泛用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁
桃体炎等[2-3]。 从雪胆块根中提取制备的雪胆素片（含
雪胆素甲和乙） 已在临床用于治疗菌痢和肠炎等疾
病， 但其抗炎作用的细胞和分子机制尚未完全阐明。
前文以 LPS激活的 RAW264.7 细胞为模型， 分析了
雪胆素甲抗炎作用机制，显示其能够破坏微丝结构诱
导 LPS活化的 RAW264.7 细胞凋亡[4]，这与雪胆素甲
及葫芦素 B在肿瘤细胞中诱导微丝骨架破坏的研究
一致[5-6]。 然而，有关雪胆素乙（CuIIb）的研究较少，现
基金项目：国家自然科学基金（81173604）；中央高校基本科研业务费
专项资金（21612411）
作者单位：510630 广州， 暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系
（王 遥，刘坤鹏，潘 浩，欧阳东云，何贤辉）；530021 南宁，广西医科大
学药学院（宋方茗）；510630 广州，暨南大学生命科学技术学院细胞生
物学系（徐丽慧）
*通信作者：何贤辉，Tel：020-85220679，E-mail：thexh@jnu.edu.cn
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DOI:10.13431/j.cnki.immunol.j.20130043
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有的研究主要针对其抗肿瘤活性的分析 [7]，其抗炎作
用的机制未见报道。 本研究以体外活化的小鼠淋巴
细胞为模型， 分析了 CuIIb对小鼠淋巴细胞活化、增
殖和炎症相关的细胞因子表达的影响， 探讨其抗炎
效应的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料 清洁级 Balb/c小鼠， 雌性，6~8周龄，
体质量（20±2） g，购自南方医科大学实验动物中心。
CuIIb（纯度 98%）购自上海顺勃生物技术公司。 刀豆
蛋白 A （Concanavalin，Con A）、佛波醇酯（phorbol 12，
13-dibutyrate，PDB)、离子霉素（ionomycin，Ion）、莫能
菌素 （monensin）和二甲基亚砜 （dimethyl sulfoxide，
DMSO）购自 Sigma-Aldrich 公司。 RMPI-1640、胎牛
血清（fetal bovine serum，FBS）、L-谷氨酰胺和 β-巯
基乙醇购自 Gibco/Invitrogen公司。 WST-1试剂盒购
自罗氏公司 。 FITC-抗 CD3 mAb、PE-抗 -CD69
mAb、 抗-CD25 mAb 及抗 TNF-α mAb 和抗 IL-6
mAb 购自 eBioscience 公司。 CuIIb 用 DMSO 配制成
0.02 mol/L的储存液，-20 °C保存待用。
1.2 小鼠淋巴细胞分离培养 颈髓脱臼处死小鼠，无
菌分离小鼠颈部、腋下以及腹股沟淋巴结，置于盛有
预冷的 PBS的无菌平皿中，除去被膜，以 200目尼龙
网滤过，收集的细胞用 PBS 洗涤 2 遍（1 500 r/min，
5 min），用 RPMI-1640 完全培养基（25 mmol/L 的 L-
谷氨酰胺、100 U/ml 的青霉素、100 μg/ml 的链霉素、
50 μmol/L的 β-巯基乙醇和 0.1 ml/ml 的 FBS） 调整
细胞数为 2×106/ml，接种于 24孔板中（每孔 500 μl）。
在 37 ℃、5% CO2条件下培养。
1.3 WST-1 法检测细胞增殖 细胞以 2×106/ml 种于
96孔板内，每孔 100 μl，加入 5 μg/ml 的 Con A，用药
组同时加入不同浓度的 CuIIb，于 37 ℃、5% CO2的培
养箱内培养 24 h或 48 h。 然后每孔加入 10 μl WST-
1 试剂，37 ℃孵育 0~4 h， 每隔 30 min 用酶标仪在
450 nm波长下测量吸光值(A450nm)，参考波长为 630 nm。
空白组只含有培养基而无细胞， 增殖率=(实验组
A490 nm-空白 A490 nm)/(对照组 A490 nm-空白 A490 nm)×100。
1.4 细胞表面 CD69 和 CD25 表达的检测 5 μg/ml
Con A刺激的淋巴细胞，在不同浓度 CuIIb处理 24 h
后，离心收集细胞于流式管中，以 PBS（含 0.1% NaN3
和 1% FBS）重悬，1 500 r/min离心 5 min，重悬于 50 μl
PBS 中， 分别加入 FITC-抗 CD3 mAb、PE-抗 CD69
mAb或 PE-抗 CD25 mAb，混匀后于 4 ℃冰箱避光放
置 20 min，然后用 2 ml PBS洗涤 1次，最后以 300 μl
的 4%多聚甲醛（配于 PBS中）固定后，上流式细胞仪
（FACSCalibur）分析。
1.5 细胞内细胞因子染色 实验设置空白组（细胞悬
液）和对照组（细胞悬液 PDB+Ion），药物组加入不同
浓度的 CuIIb (终浓度 2.5、5、10 μmol/L)与细胞预孵
育 1 h后，加 PDB (10-7 mol/L)和离子霉素(0.5 μg/ml)，
所有组别中均加 2 μmol/L 莫能菌素， 在 37 ℃、5%
CO2条件下培养 5 h，离心收集细胞，重悬细胞于 100 μl
PBS 中，加入 FITC-CD3 mAb，混匀后于 4 ℃冰箱避
光放置 20 min，随后用 2 ml PBS 洗涤 1 次，以 4%多
聚甲醛 4 ℃固定 20 min，同上洗涤后，加 2 ml通透液
（PBS含 0.1% Saponin、0.1% NaN3和 1% FBS）， 室温
避光放置 10 min，离心去上清，加 PE-抗 TNF-α mAb
或 PE-抗 IL-6 mAb，4 ℃冰箱避光放置 20 min，1 ml
通透液洗 2 次，4%多聚甲醛固定后， 上流式细胞仪
分析。
1.6 统计学分析 所有数据以均数±标准差表示，用
GraphPad Prism4.0 软件进行单因素方差分析， 组间
比较采用 Newman-Keuls 检验，P < 0.05 为差异有统
计学意义。
2 结果
2.1 CuIIb 对淋巴细胞增殖的影响 如图 1 所示，
Con A（5 μg/ml）可明显诱导小鼠淋巴细胞增殖，在不
同浓度的 CuIIb 作用下，Con A 诱导的淋巴细胞增殖
受到显著抑制，其抑制效应具有剂量依赖性。
2.2 CuIIb 对小鼠 CD3+ T 淋巴细胞 CD69 及 CD25
表达的影响 双荧光染色流式细胞仪分析结果如图 2
所示，Con A 刺激组 CD69 和 CD25 表达率比对照组
（Control）显著提高（P < 0.01），CuIIb 在终浓度为 2.5、
5、10 μmol/L 时均能明显抑制 Con A 诱导的 T 细胞
表达早期活化标志 CD69（图 2 a，b）和中期活化标志
CD25（图 2 c，d），与 Con A 组相比差异明显，并具有
n=3; ##P < 0.01, vs Con A+ CuIIb- group; ** P < 0.01, vs Con A+
CuIIb- group. CuIIb: cucurbitacin II b.
图 1 CuIIb对 Con A诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响
Fig 1 The effect of CuIIb on Con A-induced cell proliferation of
mouse lymphocytes
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剂量依赖性。
2.3 CuIIb对小鼠 CD3+ T淋巴细胞表达 TNF-α 及
IL-6 的影响 如图 3 所示， 静息状态下的淋巴结 T
细胞基本不表达 TNF-α和 IL-6，在 PDB和离子霉素
（Ion） 共同刺激后，CD3+TNF-α+、CD3+IL-6+细胞所占
CD3+ T细胞百分比分别上升为 36.24%和 17.24%，与
对照组有极显著差异（P<0.01）。 5 μmol/L和 10 μmol/L
的 CuIIb 能够明显抑制 CD3+ T 细胞表达 TNF-α，而
2.5 μmol/L 以上的 CuIIb 能够显著抑制 IL-6 的表达
（P<0.01），并表现剂量依赖性。
3 讨论
淋巴细胞在适应性免疫应答中发挥核心作用，
淋巴细胞的活化、 增殖及促炎因子的释放等细胞行
为是免疫应答基础和关键事件，在免疫防御、免疫调
节、炎症发生及自身免疫疾病中都发挥重要作用。 本
研究以体外培养的小鼠淋巴细胞为对象，在丝裂原刺
激下活化、增殖并表达促炎因子，模拟淋巴细胞在适
应性免疫应答过程中的细胞行为，探讨 CuIIb的抗炎
作用机制，结果显示 CuIIb能够抑制 T淋巴细胞的活
化、增殖和促炎因子的表达，表明其可能通过调控适
应性免疫应答发挥抗炎效应。
CD69 分子为 T 淋巴细胞早期活化的标志性分
子，是一种细胞表面磷酸化同二聚体蛋白[8-9]。 静息 T
淋巴细胞极少表达 CD69，而活化后的 T淋巴细胞通
过编码基因的转录活化， 在细胞表面表达 CD69，并
产生 IL-2和高亲和力的 IL-2R。 IL-2和 IL-2R结合
后选择性支持经抗原刺激而活化的 T淋巴细胞进行
扩增， 因此 CD69 可作为 T 细胞早期活化的标志分
子。 而 CD25则是非 CD4+调节性 T淋巴细胞的中期
活化的标志 [9]，是组成高亲和力 IL-2R 的 α 亚基，是
淋巴细胞接受其自身分泌的 IL-2 信号所必需的受
体。 我们的结果显示，CuIIb能有效抑制 CD69、CD25
分子的表达， 从而干扰 IL-2的自分泌效应而影响淋
巴细胞的增殖，提示 CuIIb可以通过抑制活化抗原的
表达而抑制 T淋巴细胞的增殖和适应性免疫应答的
n=3; ##P < 0.01, vs control group; *P< 0.05, **P < 0.01, vs Con A group. a) Dot plots of CD3+ lymphocytes expressing CD69; b) Histogram of the
percentages of CD3 + lymphocytes expressing CD69; c) Dot plots of CD3 + lymphocytes expressing CD25; d) Histogram of the percentages of CD3 +
lymphocytes expressing CD25.
图 2 CuIIb对 Con A诱导小鼠淋巴细胞活化的影响
Fig 2 The effect of CuIIb on Con A-induced activation of mouse lymphocytes
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始动，这与其抑制 T淋巴细胞增殖的结果一致。 除了
通过抑制 CD69 和 CD25 等活化标志分子的表达而
影响淋巴细胞的增殖以外，CuIIb 还可能通过其它机
制抑制 Con A诱导的淋巴细胞增殖。 我们以往的研
究显示，CuIIb及其它葫芦素能通过诱导肿瘤细胞的
肌动蛋白聚集， 破坏微丝骨架， 阻滞肿瘤细胞于 G2/
M，从而抑制肿瘤细胞的生长[7, 10, 11]。 但是这一机制是
否是 CuIIb抑制淋巴细胞增殖的原因，尚需进一步的
研究证实。
促炎因子（包括 TNF-α 和 IL-6）无论在抗感染
免疫和病理性炎症反应中都发挥重要作用。 TNF-α
主要由活化的巨噬细胞产生，在适当刺激下，T细胞、
B细胞和 NK细胞等也可产生该因子。TNF-α作为重
要的促炎因子，是炎症反应的始动者，能有效激活其
他炎症因子释放的级联反应，诱发产生 IL-1β、IL-6、
IL-8 等，进一步产生次级炎症介质，如前列腺素、白
三烯、NO 等的合成 [12]。 IL-6 由 T 淋巴细胞、内皮细
胞、单核细胞等产生，对 T细胞、B细胞和巨噬细胞有
广泛的作用，包括促进单核细胞的分化，增加血液循
环中血小板的数目，促进肝中急性期反应蛋白的表达
等是炎症反应的促进因子[13]。 因此，利用细胞内细胞
因子染色（intracellular cytokine staining, ICS）技术检
测 CuIIb 对小鼠 T 淋巴细胞表达 TNF-α、IL-6 的影
响。 结果表明，CuIIb以剂量依赖方式抑制 CD3+ T淋
巴细胞表达促炎因子 TNF-α和 IL-6，提示其能够通
过抑制炎症相关细胞因子的表达而下调炎症反应。
与 TNF-α 相比而言，CuIIb 对 IL-6 表达的抑制作用
似乎更加明显， 这说明 IL-6 的调控因子对于 CuIIb
的作用可能更为敏感。 然而，CuIIb抑制 T 淋巴细胞
表达促炎因子的确切机制尚待进一步的研究阐明。
总之，CuIIb能够明显抑制体外培养的小鼠淋巴
细胞活化、 增殖以及促炎因子 TNF-α 和 IL-6 的表
达，这可能是 CuIIb 发挥抗炎效应的重要机制，也提
示其在治疗肠炎等炎症相关疾病中可能涉及对于适
n=3; ##P< 0.01, vs control group; *P< 0.05, **P < 0.01, vs PDB+Ion group. a) Dot plots of CD3+ lymphocytes expressing TNF-α; b) Histogram of the
percentages of CD3 + lymphocytes expressing TNF-α; c) Dot plots of CD3 + lymphocytes expressing IL -6; d) Histogram of the percentages of CD3 +
lymphocytes expressing TNF-α.
图 3 CuIIb对 CD3+ T细胞 TNF-α和 IL-6表达的影响
Fig 3 The effect of CuIIb on TNF-α and IL-6 expression in CD3+ T cells
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应性免疫的调控。 然而，CuIIb抑制淋巴细胞增殖、活
化和促炎因子的表达，涉及细胞内多个信号通路，尤
其是体内的抗炎作用机制，还需要更为深入的研究。
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（编辑 汤玉瑜）
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