全 文 ：中国科学 C 辑 生命科学 20 0 5, 35 ( l ) : 13硬 l
拟南芥 c D N A 芯片和油菜 ·拟南芥比较作图相结合
筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因’
刘仁虎 赵建伟 肖 勇 孟金陵 *
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 国家农作物分子育种技术中心 , 武汉 43 00 7 0)
摘要 以拟南芥 c D N A 芯片筛选核盘菌侵染时甘蓝型油菜的局部抗 (耐)病相关基因 , 共获得在
病斑周围局部组织中受核盘菌胁迫后表达变化达 2 倍以上的基因 61 个 . 这些基因中 , 36 个基因
为上升表达 , 25 个基因为下降表达. R T 一P c R 和 N O d h e m 杂交验证了部分芯片杂交筛选的结果 ,
表明拟南芥 c D N A 芯片可用于甘蓝型油菜墓因转录谱的研究. 结合油菜一拟南芥基因组比较作图 ,
将一些 。D N A 芯片筛选得到的油菜菌核病抗性相关基因定位于甘蓝型油菜抗菌核病 Q T L 区间内.
取定位于 QT L 峰值区域的少数墓因为先验墓因 , 值得优先对这些墓因进行深入研究 .
关键词 核盘菌 基因组比较作图 基因芯片 防卫反应 植物和病原菌互作
拟南芥是双子叶植物的模式植物 , 己经建立起
的完备功能基 因组研究平 台极大地促进了拟南芥本
身及其近缘植物的功能基因组学研究 [ ’ ,2] . 甘蓝型油
菜是重要的食用油料作物 , 与拟南芥同属十字花科
芸苔族 , 基因组间有很高的同源性 13 ~5] . 为了探索将
拟南芥这一功能基因组研究平台应用于油菜科学研
究 , G ir ke 等人6l[ 率先将拟南芥 c D N A 芯片尝试性地应
用于油菜基因组表达研究并获得了较为理想的结果 ,
从而在实践上证明了拟南芥 c D N A 芯片可以应用于
油菜及其近缘植物的基因组表达研究 . 随后 , 又有报
道表明拟南芥 c D N A 芯片还可以应用于与其亲缘关
系更远的植物的转录谱研究 l7] , 例如重要的一年生禾
本科植物野燕麦( A ve an af t au ) 、 重要的经济林木美洲
黑杨 (P op ul us de l ot ids ie s) 以及多年生野生杂草乳浆大
戟 (E uP ho kr ia es “ al ) , 这些报道都大大激励 了研究者
将模式植物成熟的遗传研究工具应用于农作物的研
究中 .
菌核病是由核盘菌 (s c ze or t in ia s c ze or ri o ur m ( L ib . )
de B ar y) 引起的一种严重的真菌性病害 、 该病流行范
围很广 , 遍及整个亚热带及温带地区 . 该病原菌寄主
范围也非常广泛 , 能感染 45 0 多种不同的物种 l8,9 ]. 大
量研究证明 , 油菜中对菌核病的抗原十分稀少 , 不同
品系间只是对菌核病 的耐受性有差异 , 而未发现高
抗品种 I’ “ , ” ] . 一些证据显示真菌分泌的草酸是菌核病
2 0 4
一
05
一
21 收稿 2仪M 一07 一2 收修改稿
* 国家自然科学基金 (批准号 : 3 01 7 04 9 6) 和湖北省科学基金资助项 目
* * 联系人 , E 一m a i l : jm e n g @ m a i l . h z a u . e d u , e n
S C I E N C E IN C H IN A S e .r C L i fe S e i e n e e s
中国科学 C 辑 生命科学 第 35 卷
重要的致病因子 I’ 2 ]. 于是 , 一些科研人员利用草酸作
为底物在油菜中筛选具 有菌核病抗 (耐 )性的突变
体 [ ’ 3, ’ 4] , 筛选出的油菜品系宁 R S一 l 对菌核病具有较
高的抗 (耐 )性 【” , ’ 5 ] . 在进一步确认该品系对菌核病具
有较高抗性的基础上 , 我们曾以宁 R S 一 l 为抗性亲本 ,
H 5 2 0 0 为感病亲本构建了分离群体 , 定位 了 3 个对菌
核病苗期抗 (耐 )性有贡献 的数量性状位点 (QT )L 和 3
个对其成熟期抗 (耐)性有贡献的 QT L[ ’ 6, ” 」. 为了进一
步阐明这一抗 (耐 )性的分子遗传机理和克隆其抗 (耐 )
性相关基因 , 分析这些 Q T L 范围内的基因表达信息
将有重要意义 . 芯片技术是一种高通量 、 大规模分析
基 因表达的新兴生物技术 [ ’ “ , `9] . 但从芯片杂交筛选
得到的候选基因比我们希望的多得多 , 验证过程耗
时费力 . 为了提高效率 , 降低候选基因数 目 , 将芯片
技术与 Q T L 定位相结合来筛选先验 (a p ir or o基因被
证 明是一种非常有效的方法 120 ,2 ’ ] . 本研究就是利用
拟南芥 c D N A 芯片筛选 了宁 R S一 1 中与抗 (耐 )菌核病
相关的油菜基因 , 并将有关差异表达基因与 QT L 位
点相整合 , 来确定一些油菜菌核病抗 (耐 )性有关的先
验基因 .
功地研究了拟南芥发育过程中光调节基 因的表达
谱 23[ ]和其中一些基因的调控关系 24[ ,25] . 一个 A R .g ZK
芯片有两个点阵 , 每个点阵为一个重复 , 含有 9 21 6
个拟南芥的表达序列 (E S sT ) , 涵盖了大约 6 120 个不
同的基因 .
1 材料与方法
L l 植物材料 、 接种和 R N A 的提取
植物材料为对菌核病有部分抗性的油菜品系宁
R S
一
1
. 幼苗在植物生长箱内培养 , 光照 14 h , 温度
25 ℃ , 黑暗培养 or h , 温度 20 ℃ , 同时 , 培养了感病
品系 H 5 2 0 0( 杂交油菜华杂 3 号的恢复系 )作为对照 .
菌株是 H丫 12 , 由华中农业大学的李国庆博士提供 ,
已被用于与菌核病抗性相关 Q T L 定位的研究 [`7] . 当
幼苗长到 5荀 片真叶时 , 用菌丝块接种三片较大的真
叶12 ] , 接种后的植株被转入气候培养箱内 , 相对湿度
保持在 or o % , 其他的培养条件不变 . 在接种 犯 h 以
后 , 取病斑周围鲜嫩的组织作为处理样品 , 而相邻未
接种的叶片作为对照 . 取 1 9 病斑周围环面组织用
irT
z ol ⑧试剂提取总 R N .A
1
.
2 c D N A 芯片
拟南芥 c D N A 芯片 A R .g ZK 从美国 alY e 大学 (h t tP :
刀k c c .k me .d y al .e de 川d n~
y劝购买 . 应用 A R .g ZK 已成
1
.
3 c D N A 探针合成
探针的标记主要参照 aT K a R a RN A 荧光标记试
剂盒说明书 (D T X 80 1) , 取 10 0 林g 总 RN A , 与 C y 3 或
e y s
一
d e T P混合标记探针 , 纯化后溶于 10 林L 2 x S S C ,
取 1 林L 在 1%琼脂糖凝胶上电泳来检测逆转录质量 ,
逆转录质量好的 c D N A 在琼脂糖凝胶上呈现出 20 0 一
150 bP 的连续条带 , 而逆转录质量差的 c D N A 会得
到小于 25 0 bP 的连续条带 .
1 .4 芯片杂交 、 量化和表达谱分析
D N A 芯片杂交采用 26 匹 杂交液 (4 . 16 林L 20 x
S SPE
,
1
.
0 4 林L 10% S D S , 1 . 0 4 林L 50 x D e n h a r d t ’ s , 1 . 0
匹 3 0 0 m o比 0 119 0 一 dA l s , 0 . 4 匹 10 9几 s s D N A 和适当
d d H ZO )与 8 林L 探针混合 . 杂交温度为 5 ℃ , 其他步
骤参考 M a 等人 123 ]的实验程序 . 杂交信号采集使用
G M s 4 l s 芯片扫描仪 , C y 3 信号用 5 3 2 n m 的波长扫描
得到 , c ys 信号用 635 n m 波长扫描得到 . 为了减小芯
片杂交固有的误差 , 确保芯片结果的可靠性 , 该杂交
做了两次生物学重复 , 每次重复中用的 RN A 是分别
独立提取的 . 因为一个芯片有两个重复阵列 , 所以每
个基因有 4 次重复 . 芯片杂交结果首先用 Im a g e ne .4 0
分析 , 然后在 M ic or so ft Ecx el 中对结果进行进一步处
理 , 首先 , 剔除所有没检测到信号和信号较弱的点 ;
其次 , 调整 c y3 和 c ys 的总信号到同一水平 , 计算每
个点在 c y s 和 C y3 通道平均信号的比率 ; 第三 , 合并
在 4 次重复中都检测到的基因数据 ; 第四 , 每个生物
学重复内取平均值 ; 最后 , 在两次生物学重复中都上
升或下降表达变化两倍以上的基因被认为是阳性基
因 , 与油菜菌核病局部抗 (耐 )性有关 .
1
.
5 R -T P C R 和 N o rt h e r n 杂交
用稀释的 c D N A 第一链为模板 , 以同源的拟南芥
基因的 D N A 序列设计引物进行 R -T PC R 反应体系为
2 林m o比 左右引物 , 0 . 2 m m o比 d N T P, I U 肠 q D N A
S C IE N C E IN C H】N A S e .r C L i fe S e i e n e e s
第 1期 刘仁虎等: 拟南芥 。 D N A 芯片和油菜一拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因
聚合酶 , 2 . 0 m m o比 M g C I: 和 l 倍 p C R 缓冲液 , 加水
调节到 2 0 林L . 由于不同基因的扩增需要不 同的循环
数 , 为了优化扩增条件 , 我们尝试了 20 到 45 之间的
不同循环 . 确定最佳循环数以后 , 每个反应都进行了
2 次以上重复 . N o hrt e m 杂交采用以油菜 c D N A 为模
板扩增的产物作为探针 , 10 林g 油菜总 RN A 在 1% 的
甲醛琼脂糖胶上电泳 , 转膜 , 然后在含 5 0% 甲酞胺的
2 倍 s S C 缓冲液中与 3 2P 一 d c T P 标记的 。 D N A 探针杂
交过夜 . 杂交温度 42 ℃ . 首先用 2 倍 S S C 缓冲液和
1% 的 SD S 洗膜两次 , 温度 4 2℃ , 再用 0 . 1 倍 S S C 和
0
.
1% s D S 在常温下洗膜两次 , 最后在一 80 ℃下放射自
显影 .
-
今 - - H 5 2 0 0
· …… 宁 R S一 1
孟… …否二
日。、州侧澎惧
3 2 4名
接种时间小
6 4 8 0
图 1 接种核盘菌后宁 R S一 1 和 H 5 2 O0 叶片上的病斑扩展
曲线
1 .6 油菜和拟南芥的比较作图
根据 已定位的与菌核病抗性相关的 Q T L[ `7 ]两端
的 R FL P 探针序列 , 我们采用电子定位的方法将这些
R FL P 标记与 D N A 芯片中筛选得到的基因一起定位
于拟南芥染色体上 . 油菜 R FL P 探针序列来自于
o s b o m 实 验 室 (h t t p : lo s b o nr lab . a g r o n o m y . w i s e 、 e d u ) ,
拟南芥探针序列 由拟南芥信息资源中心 (ht tP : lw w .w
ar bi d
o p s i s
.
o嗯 )查得 . 电子定位在 M a p v i e w 网页 (h tP :
l w w w
.
a r a b id o p s i s
.
o嗯zs e vr l e t s m/ a p p e r ) 上进 行 , 各基
因在连锁群上的遗传距离根据相邻拟南芥重组近交
系群体上的遗传标记算得 .
推测植物和病原菌的互作已进入关键阶段 , 植物体
关键的防卫基因已被启动 , 因为此后病斑扩 展速度
有所减慢 . 本实验仅仅探索了宁 R S一 l 中基因的表达
变化 , 不包括 H 5 2 0 . 为了得到病斑周围局部基因的
表达变化 , 我们分别从病斑 周围的鲜嫩组织和与其
邻近未接种的真叶中提取 R N A , 标记后与芯片杂交 ,
从而得到基因表达量的相对变化 .
2 结果
.2 1 病斑扩展
本实验分别在接种后 8 , 16 , 32 ,4 8和 9 6 h测量了
宁 R s一 1和 H 5 2 O0 的病斑大小 (图 1) . 在每个时间点 ,
至少测量 了 巧 个病斑 . 接种后大约 s h 左右 , 菌丝体
顶端形成的侵染钉开始侵入叶面蜡质层 、 角质层和
表皮细胞 , 在叶片表面形成针尖大小的小孔 (未发表
资料 ) , 16 h 后 , 从菌丝块上长出的不同侵染钉侵染的
病斑汇集成一个 肉眼可见的病斑 . 此后 , 菌丝从被腐
生的叶片组织中吸取营养 , 病斑快速长大 , 到 32 h 后病
斑显著增大 , 从 32 到 48 h , 病斑的扩展速度有所减慢 ,
48 h 后 , 病斑扩展速度又有一定程度的加快 . 本研究
主要分析了接种 32 h 时病斑邻近组织的基 因在表达
水平上的变化 , 因为在此阶段 , 菌丝侵染能力最强 ,
.2 2 基因表达谱分析
处理和对照 RN A 分别用 C y3 和 C ys 标记 , 同时
杂交于 A R g . Z K 芯片上 , 图 2 显示了两个生物学重复
中原始杂交信号的强度 . 与拟南芥 一拟南芥同源基因
片段杂交的信号 (平均约 Z 0 0 0 0) 26I )相比较 , 多数油菜
基因与拟南芥基因异源杂交的信号较弱 ( < 10 0 0 0) . 根
据两次独立提取的 R N A 样品的 4 个重复的杂交结果 ,
筛选得到 了 47 个上升表达 2 倍以上的 E s T 克隆和 25
个下降表达 2 倍以上的 E S T 克隆 , 分别代表了 36 个
上升表达的基因和 25 个下降表达的基因 (见附表 ) . 这
些基因在两次独立 的杂交中 , 均有两倍以上的表达
变化 . 在那些受病原菌诱导上升表达最强烈 的基因
中 , 有许多是 已证 明的与抗病相关的基 因 , 如内源
几丁质酶基因 、 细胞色素 P 45 O相关蛋 白基因和谷胧
甘肤转移酶基因等 , 此外 , 还包含有植物凝集素基
因和 be m l乃“必 抑制基因等与植物抗病相关的报道
较少的基 因 . 在下降表达的基 因中 , 最受抑制的基
因包括膜通道蛋 白基因 、 D N A 结合蛋 白基因和与光
系统 n 相关的基因 . 所有这些筛选到的基因中 , 10 个
基因与氧胁迫有关27[ 」, 5 个基因受一氧化氮信号分子
W w w
.
s e i e h in a
.
e o m
中国科学 C 辑 生命科学 第 35 卷
基 因调控和信号传导相关 , 表达谱的这种分布规律
与前人研究的氧胁迫诱导表达 的基 因分布规律相类
似 26[ ] . 在受抑制的基因中 , 最多的是与新陈代谢相关
的基因 , 其 次是与转录 因子相 关 的基 因 . 用工 具
w u
一
B L A s T 搜索拟 南芥 信息 资源 中心 网站 (ht tP :
l/ w w .w ar ab 记 op is s . o gr )中的芸苔属数据库进行序列比
对 , 发现 61 个上升表达和下降表达的基因中有 4 6 个
能找到与芸苔属 (大多数是甘蓝型油菜 )同源的 E S T,
序列同源性在 67 %和 9 6%之间 , 平均同源性为 85 % .
图 2 两次生物学重复中芯片上所有基因的杂交信号散点
图
横坐标代表各基因与处理样品的杂交信号强度 , 纵坐标代表各基因与
对照样品的杂交信号强度 , 红色和蓝色分别代表两次生物学重复
的调节 128 ] . 活性氧和一氧化氮都是植物启动抗病反
应的重要信号分子 , 这些基因的发现预示着活性氧
途径和一氧化氮途径在油菜抵抗菌核病入侵中有重
要作用 . 根据 国际上基因分类方法 , 这些受诱导的和
受抑制的基因可以分为 6 个组 (见附表 ) . 受诱导的基
因大部分与细胞拯救 /防御反应 、 代谢 、 环境互作 、
2
.
3 R -T P C R 和 N o r th e r n 杂交验证
由于 A R g . ZK 芯片购自美国 aY l e 大学 , 我们没有
印在芯片上的原始 E S T 克隆 . 为了证实从芯片中获
得的数据 , 我们从中选择 了 13 个基因 , 根据其拟南
芥序列设计引物 , 通过 R -T P C R 来分析它们在油菜中
的表达变化 (表 1) . 不同引物对扩增时采用不 同的模
板量和不同的扩增循环数 (2 0碎 5 循环 )来使扩增差异
最 明显 , 每个基因都重复扩增多次以验证差异的稳
定性 . 结果显示多数 R -T PC R 扩增结果与芯片杂交结
果有较好一致性 , 扩增产物长度也与拟南芥中的预
表 1
基因 左引物 ( 5` 一 3 , )
R-T P C R 引物和扩增结果
右引物 ( 5 ,一 3 , ) 反转录 CP R 产物的比率 妞)
受诱导的基因
A r 59 5 04 60
A T 59 2 0 5 2 0
A】, 39 16 5 3 0
A t l g 6 8 19()
A t lg 34 4 6()
A t2 94 3 5 90
A T 59 2 7 3 8 0
A t lg 7 2 3 7 0
A T 4 g() l 8 50
受抑制的基因
A r 39 2 9 2 7 0
A t lg 7 9 () 抓)
八T 4 g l 5 9 50
A t 29 38 5 40
对照
A C t in
一
2
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一
uT b l i
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c c a t g gac g c c at g
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g c c t g a g a a a a g g a a g a a g a
c tC g c a c c a a a c c t a a e t e e
t g a c g at g ac n
c e a a a t a e e
t c t a g t t t t c g gt c c c a g t
a g c a g C a a c a c a c a at ac c c
c a c gg a C t c g t c g t g g t
t g t e a g g a t gat g t g t g e e
e a t e t g a g t c t g t g a ac g
a a g g
a g t g g c a c c g a c g a t g a t
g g a a a a c t g ag ac g a a g c a a a
te c c g ac t c t g tC t g a a c c
g a g g g a g gg a c a a a a t g a g a
t c g e t c t c a t c t c t c a t e
c c a c C g t a c at
c c甜 c c
c c a a a a c c a g c t g c a a c g
t e at e t e a t e e t e t g g c t
g g t g g g t c t g c c t g a g
1
.
4 5 112 7 4
2
.
8 3 16乃9 12 . 64
2
.
9 0 11 88
3
.
4 5 14 刀7
4
.
1 3 2/
.
19
无扩增产物
无扩增产物
无扩增产物
1
.
1 1 11 4 0 11 2 1
c g c g a t g a a g c at c g a g t
g g c t g c ct
a g t g a t g e t at
ct t g at ggc g a g at gt g tgt
c a a c a g c a t a g c C a a g ac g
a
c g te c a g c tC g t
a g a g c a
c t g ag c e a a g c a c t g t g t
g a g a a g g c a a g a c g c a at
tag e a t e a t e t c a e e g t g c
一5
.
8 8 卜2 . 54
一 4
.
8 6 八 1 . 66 -/ 16 . 7 0 -/ 2 . 5 3 -1 9 . 64
一2 1 /一 2 . 13
无扩增产物
g g a a g g a t C t g t a c g g t a a e
t e at a t c c a a g g e g g t e a t g t g
t g t g a a c g at
c c t g g a c c t
c c a t g e c tC 让 c t g t g t a c c a a
1
.
0 5-/ 1
.
0
1
.
09 八 1 . 11
a) 用不同的热循环数和退火温度 , 每个基 因重复扩增 2 次以上 , 用 1%琼脂糖凝胶电泳后在 G el ~ P r o A n al yez r 4 .0 软件中将其量化
S C IE N CE IN C H 】N A S e .r C L ife S e ie n e e s
第 1 期 刘仁虎等 : 拟南芥 c D N A 芯片和油菜一拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因
期长度一致 . 然而 , 一些基因 (例如 A t 2 9 4 3 5 9 0 , A t s g
27 3 80
,
iA l g 7 2 3 7 0 和 A t 2 9 3 85 4 0 )通过拟南芥序列设计
引物并没有扩增产物 .
以油菜的 c D N A 作为模板扩增探针 , 通过 N O川五e m
杂交 , 我们跟踪 了 A lt g 79 04 0 基因的表达规律 (图 3) .
为了更清楚地了解该基因的表达规律 , 我们在 N o n五e m
分析中增加了不同时间点在活体和离体叶片中提取
的 NR A
. 结果显示 , 在接种犯 h 以后 , iA l g 79 040 的
表达受到很大抑制 , 这与芯片和 R -T P CR 结果非常一
致 , 另外在没被接种的离体叶片中 , 这个基因也呈下
降表达趋势 , 但在接种叶片中该基因抑制更快 . lB as t
结果显示 , 该基因是光合系统 n 中的一个多肤基因 .
图 3 N o hrt e m 分析基因 A lt g 79 04 0 对应的油菜同源基因在
油菜中的表达规律
l 示活体叶未接种样品 R N ;A 2 示离体叶接种 12 ;h 3 示接种 16 h 后同
植株邻近未接种的叶片 ;4 示活体接种 16 b叶片;5 示接种 32 h 后同植
株邻近未接种的叶片 ; 6 示活体接种 32 h 叶片 ;7 示离体叶接种 32 ;h 8
示离体 3 2 h 的未接种叶片 ; 9 示活体接种 4 8 h 的叶片 ; (a) 用 eG l一氏。
A n al yz er .4 0 量化后的相对表达量柱状图 ; (b) N 。曲e m 杂交的 x 光胶片
图 ; (c) 等量总 R N A 电泳图
.2 4 油菜 ·拟南芥比较作图
采用 电子定位的方法 , 根据 我们 以前工作中定
位的 6 个菌核病抗 (耐 )性相关的 Q T L 区域中所有
RF L P 探针序列 , 将这些区域中的探针和采用拟南芥
芯片筛得的候选基因一起定位在拟南芥连锁群上 ,
发现油菜第 3 连锁群的 QT L 区域与拟南芥的第 3 染
色体具有共线性 , 而油菜的第 7 连锁群与拟南芥的第
1 染色体具有共线性 (图 4) . 其中 , 拟南芥第 3 染色体
上有 3 个候选基因落在油菜第 3 连锁群上 Q T L 的峰
值区域 , 拟南芥第 1染色体中有 5 个基因落在油菜第
7 连锁群上的 QLT 峰值区域
.
3 讨论
本研究的首要任务是将模式植物中的分子生物
学工具运用到农作物研究中 . 己有实验表明 , 拟南芥
c D N A 芯片可 以成功地应用于芸苔属作物的基因表
LG 3 A C 3 L G7
P a l 4 5
Pa3 1
W gZ d s Wg s g 3
W g 6 h l
A t 19 19 69 0
P a 10
Pa3 1
A t 19 2 11 10
Wg l e 3
A 3t 9 03 7 8 0
人日 9 064 0
A 3t 9 085 8 0
A 3t g 09 科 0
P a l 4 5
A 3t g l 6 5 30
A 3t 92 3 8 0 1
A t3 g 2 9 00()
2 3
.
5—
A 4 5 2 10
T g l e s WgZ d s A 7 6 2 7 0
A t l g4 9 7 3 0
W g sg 3
A t l g 6 0 6 5 0
A t l g 62 3 8 0
P a ] 14
W g l e 3
A 3t 9 59970
A t l g 6 6 2 7 0
A t l g 6 8 5 2 0
A t l g 7 6 7 9 0
Pa4
A t l g 79 0 4 0
A t l g 79 1 8 0
图 4 在油菜菌核病抗(耐 )性相关 QT L 区域油菜和拟南芥基因组比较图
L G 3 示油菜第 3 连锁群上的菌核病抗 (耐 )性相关 QLT ; LG 7 示油菜第 7 连锁群上的菌核病抗 (耐)性相关 Q T ;L
A cl 示拟南芥第 l 染色体 ; A c 3 示拟南芥第 3 染色体 ; 该连锁图用 M ap D ar w v 2 . 1 软件绘制 128 1
w w w
.
s e ie h i n a
.
e o m
中国科学 C 辑 生命科学 第 35 卷
达谱研究 16, 7] . 然而与拟南芥一拟南芥同源片段杂交相
比较 , 在相 同的杂交条件下 , 油菜 一拟南芥异源片段
杂交的信号大大减弱 . 为了得到适当强度的杂交信
号 , 我们把杂交温度从 65 ℃降到了 5 ℃ , 但这样也
可能会导致基因间非特异性杂交增多 , 这可能也是
我们两个生物学重复间相关系数相对较低的原因之
一 因此 , 为了在挑选候选基因时减少 1 型误差 , 我
们在比率计算时没有消减背景信号 , 而使用了平衡
化后各点每通道上总信号来计算比率 . 尽管这样计
算可能会低估 比率的值 , 但能降低基因表达变化 比
率的误差变异 , 据此 , 我们相信本试验中还有很多局
部抗性相关基因未被检测到 . 根据我们最近的杂交
经验 , 在 c D N A 探针的合成中采用浓缩的 oP ly A RN A
为标记底物能显著改善杂交信号的强度和质量 . 本
研究的另外一个目标 , 是从寄主中筛选出一些最有
可能抑制核盘菌侵染的基因 . 我们之所以筛选局部
响应基 因而不是那些系统反应基因 , 主要是出于 以
下考虑 : 首先 , 在多数防御反应中 , 系统反应基因通
常都有共同的作用方式并且被研究得较为清楚 , 而
局部响应基因专一性相对更强 , 随着病原菌的不同
而发生变化 ; 其次 , 系统获得抗性一般仅仅是对逆境
所产生的普通防御反应 , 不能有效地 阻止病原菌特
别是腐生性真菌的入侵 , 而局部组织直接面对病原
菌的挑战 , 可能激发其最有效的能力去抵抗入侵 . 因
此 , 这种局部的抗性响应对于寄主生物来说可能更
经济有效 .
在我们芯片实验中筛选 到的上升表达基 因中 ,
有些 己有大量证据表 明是受多种病原菌诱导的 , 如
几丁质酶基因和细胞色素 4P 50 基因等 . 几丁质酶基
因是植物 中普遍存在的抗真菌类病害基因 , 总会被
真菌侵染所激活 129 ,30 ]. 许多几丁质酶基因已被克隆 ,
在植物叶片中超量表达后均在不同程度上增强了植
物的抗病性 3[ ’ .32 ] . 细胞色素 P 4 5 0 是一组氧化酶 , 参
与细胞 内一些 内源物质和外源化合物的氧化代谢 ,
这些物质包括类固醇 、 脂肪酸 、 药物 、 致癌剂以及诱
变剂等 3[ ,34 ]. 细胞色素 P 4 5 0 蛋 白 c 端保守的半肤氨
酸残基参与结合血红素的第 5个配位点 3[ ], 它们通常
是复杂 的电子传递链中的终末氧化酶 , 被称为细胞
色素 4P 5 0 单加氧酶系统 . 大量证据显示 , 它们与对
真菌病害的抗性密切相关 135 ,36 ] . 本实验中 , 细胞色素
P 4 5 0 可能有降解核盘菌分泌的毒性物质的作用 .
试验还发现 , 那些编码钙依赖性的蛋白激酶的
基因被显著抑制了 . 由于前人 的研究已经证明核盘
菌分泌 的草酸能鳌合寄主 中的 C a +Z 137 ] , 该发现可能
也反映 了核盘菌致病的部分机理 , 即病菌通过分泌
草酸鳌合 C a +2 , 降低了防御反应途径中钙依赖蛋白激
酶基因的活性 , 从而损坏植物的防御体系 . 近来一些
研究还表明 , 草酸可以通过抑制寄主细胞 的氧爆发
而促进真菌的侵染 37[ ] . 氧爆发是激活植物组织反抗
病原菌入侵的早期重要信号途径之一 , 而 M yb 相关
的转录因子又能被氧爆发所诱导 , 如一些被 H 20 : 诱
导的基因的启动子就有 M yb 的结合位点 126 1. 然而本
试验却检测到 M yb 转录因子相关基因受到普遍抑制 ,
反映了寄主的氧化爆发可能受到了抑制 . 另一方面 ,
本试验中其他许多抗病基因的诱导表达也表明植物
还有另外的抗病机制 , 但是很难直接从这些基因的
表达变化中理清它们的关系 . 尽管如此 , 这些发现为
进一步研究这些基因在核盘菌侵染中的作用以揭示
其抗病机理 , 提供了一个很好的着眼点
将芯片技术与 QT L 定位结合是时下正悄然兴起
的一种在 QT L 候选基因中确定先验基因的方法 20[ ,2 ’ ],
它可以显著降低候选基 因的数目 , 提高后续工作的
效率 . 通过本方法 , 我们也在众多抗 (耐 )菌核病相关
基因中筛选出了几个先验基 因以用于后续研究 , 比
如那些位于 QT L 峰值区间内的基因和与其紧密连锁
的基因 , 例如本试验中得到的 iA 3 g 16 5 3 0( 编码植物
凝集素 ) , iA 3 9 2 3 8 10 (编码 S一腺昔高半肤氨酸酶 ),
A t 3 g 2 9 0 0 o (编码钙依赖蛋白激酶 ), A 4t 9 2 0 8 5 0 (编码三
肤肤酶 ) , ^ 哄 9 2 2 6 9 0 (编码细胞色素 4P 5 0 ) , A t 4 9 2 3 5 3 0
(编 码 未 知 产 物 ) , A t l g 4 9 7 3 o (编 码 蛋 白 激 酶 ) ,
A t l g 7 9 0 4 0 (编 码光系统 11多肤 )和 A t l g 7 9 18 o (编码
M Y B 63 )
, 这些基因中很多己被证明与抗真菌性病害
有关 , 但有些也还不曾报道过 . 继续深入研究这些先
验基因在抗菌核病方面的功能将有重要意义 .
致谢 感谢邓兴旺教授和吴平教授帮助购买拟南养
S C IE N C E 】N C H】N A S e .r C L i fe S e i e n e e s
第 1期 刘仁虎等 : 拟南芥 cD N A 芯片和油菜一拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因 19
c D N A 芯片; 感谢傅廷栋教授和江苏农业科学院傅寿
仲研究员提供植物材料宁 R s一 1 和 H 52 0 ; 感谢王石
平教授 、 张启发教授及其课题组成员提供的技术帮助
及芯片杂交和分析仪器 .
参 考 文 献
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刘仁虎 , 孟金陵 . M aP D ar w , 在 E xc el 中绘制遗传连锁图的宏 .
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22 (洲)
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2 0中国科学 C 辑 生命科学 第 35卷
附表 拟南芥 。D NA 芯片筛选的油菜菌核病抗性相关基因及其与油菜对应基因的同源性
预测的功能 ES T克隆号
拟南芥
基因位点 诱导倍数 芸苔属中的同源序列
“ )
重复 1重复 2 G en Ban 上编号 物种 同源性 E值 w u一 L BA S T分值
细胞拯救 / 防卫反应
内源几丁质酶
细胞色素 P4 5 O单加氧酶
细胞色素 P4 5 0类似蛋白 . )
细胞色素 P4 5 0类似蛋白 “ )
谷光甘肚 S 一转移酶 . ),b)
谷光甘肤合成酶
糖磷脂酞肌醉锚定蛋白
谷光甘肤 s 一转移酶 . .b)
热休克蛋白 7 0
热休克蛋白 7压 3 a)
环境调节与互作
S
一腺昔高半胧氮酸酶
儿茶酚 一 0 一甲基转移酶
S
一腺普高半耽氨酸水解酶
0
一甲基转移酶
亚甲基四氢叶酸还原酶
倍号传导
植物凝集素 ” )
钙调蛋白类似蛋白 . )
1
一氨基环丙烷小狡酸 ( A c c )氧化酶 “ )
通用胁迫蛋白
跨膜蛋白激酶
转录调节
激素调节蛋白“ )
能 t 代谢 /叶绿体相关
A T P酶
细胞的建成和发生
b , I乃“必 抑制因子
蛋白迁移复合体 Sce 61
AT P转运蛋白
荟础代谢
磷酸甘油酸脱氢酶
S
一腺普蛋氮酸合成酶
(邻 )氨基苯甲酸合成酶因子前体
葡萄糖荃转移酶
谷氨酸脱氢酶 “ )
S
一腺昔蛋氨酸合成酶
蛋氨酸合成酶
腺普酞磷硫化激酶
未知功能
T 8 8 192
T7 5 94
T4 2 7 16
T4 6 19 3
N 97 (姆 3
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N 9 7 2 5 4
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A 4t 9 37 33 0
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A 5t 9 2 7 38 0
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.
8 b i ts )
B
.
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2 E
一
109 2 5 5 3 (3 8 9
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1 b i t s )
B
·
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一
8 2 15 9 8 (24 5 8 b ist )
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B
.
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一
118 2 7 4 5 (4 17
·
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e a 8 6% 4 7 E
一
2 3 8 5 3 8 7 (8 1 4
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·
o le ar
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.
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B
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一
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.
2 5
2
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3 2 5 19 6 8 9
无
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B
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B
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.
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.
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B
.
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B
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一
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B
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一
106 1 17 6 ( 18 2
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.
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一
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无7T 64 6 1
T 4 5 6 7
N 9 7 2 99
A 5t 9 2 05 20
A 5t 9 5 04 60
A t390 8 5 80
3
.
97
3
.
6 3
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3
.
9 7
3
.
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2
.
1 B
.
o le ar c e a 5
.
OE
一
150 34 2 ( 52 2乃 bi t s )
W 4 3 1 88
H 3 6 6 99
N 6 5 6 20
H 3 67 7 7
H 3 77 5 0
T 4 2 4 3 0
N 9 69 6 9
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A t4 9 3 4 2X()
A 4t 9 0 18 50
A 5t 9 0 5 7 30
A t2 9 3 5 6 50
A st 四 7科0
A t l g 0 2 5X()
A t3 90 3 7 80
A 4t 9 3 99 4 0
2
.
9 9
2
.
95
2
.
7 1
2
.
68
2
.
6 6
2
.
27
2
.
27
2
.
14
3
.
0 7
2
.
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2 6 9
2
.
7 5
2 64
2
.
2 7
2
.
3 1
2
.
2 7
2 6 7 67 19 9
7 9 0 97 7
3 2 5 14 5 3 5
2 6 9 92 2 9 1
15 (洲只 9 8 3
7 9 0 97 7
3 2 5 13 9 5 9
2 7 04 9 16 9
B
.
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c ea 8 7% l
.
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一
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B
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7 E
一
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6 bi st )
B
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4 bi st )
.
B刀 le ar c e a 8 5% 2 3 E一8 4 19 4 (3 0 5
.
2 bi st )
B
.
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aP us 8 9% 3
.
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一
2 20 4 9 9 2 (7 5 5
.
1 bi t s )
B
.
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.
6 bi st )
B
.
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.
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一
10 5 2 4 4 8 (3 7 3
.
3 bi t s )
B
.
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.
0 E
一
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无
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.
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2
.
3 5
3 4 1
2
.
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2 3 6 17 7 9 87 3 9 B
.
o le r a c e a 80 % 3
.
S E
一
4 1 10 7 ( 17 2
.
1 bi t s )
S C IE N C E IN C H】N A S .er C L i fe S e i e n e e s
第 1 期 刘仁虎等 : 拟南芥 c DNA 芯片和油菜 一拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因 2 l
续附表
预测的功能 S E T克隆号 拟南芥基因位点 诱导倍数 芸苔属中的同源序列
c)
重复 1 重复 ZGe n Ban k编号 物种 同源性 E值 wU 一 BL A S T分值
细胞拯救 / 防卫反应
p
一节萄糖昔醉
环境调节与互作
膜通道蛋白
低温诱导蛋白
信号传导
受体样蛋白激酶
钙依赖性蛋白激酶
转录调节
A DN结合蛋白
A R N结合蛋白
B
一
b o x锌指蛋白
转录因子 (M Y B 63)
能 , 代谢 /叶绿体相关
光系统 n l 一型叶绿素确 结合蛋白 . )
光系统 1 多肤习
类囊体腔 17 . 4 kD 蛋白, 叶绿体前体
细胞的建成和发生
非特异脂质转运蛋白 . )
原叶绿素酸脂还原酶前体
谷础代谢
p
一丙氮酸一丙酮酸脂转氨酶
甘氮酸脱氢酶
三肚肚醉
木聚搪普酶
木荀聚精转菊糖昔酶
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一
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8 b i t s )
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.
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B
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B
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.
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一2 . 4 5
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.
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.
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一
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无
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- 2
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.
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一2 . 4 1
一2 . 3 8
一 2 . 17
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无
2 35 5 18 9 9
无
B
.
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一
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4 b i t s )
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A t2 93 8 5 30
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一 2 . 3 1
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一2 . 22
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.
2
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.
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.
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3 25 0 7 0 14
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B
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2 4 33 ( 37 1
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1 b i t s )
2 10 6 ( 32 2
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未知蛋白
未知蛋白
未知蛋白
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T 4 50 2 6
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一
113 2 6 28 (4 0 0
.
4 b i t s )
a) 与受氧胁迫调节的基 因表达规律一致 t圳 . b) 与一氧化氮调节的荃因表达规律一致【271 . c) 在拟南芥资源信息中心伍tP : lw/ .w ar a b id叩51
. 。叼
w ub la
s叭 n d e xZ .js )P 搜索到的芸苔属对应基因与拟南芥基因的同源性 w u 一B L A sT 得分小于 1《x洲〕的忽略不计
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