全 文 ：果 树 学 报 2010，27（4）: 631～635
Journal of Fruit Science
4个石榴基因型的 SRAP鉴定
薛华柏 1，郭俊英 1，司 鹏 1，王俊娜 2，吴国良 2，曹尚银 1*
（1中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009； 2河南农业大学园艺学院，郑州 450002）
摘 要： 为了便于对生产上主要推广的 4 个石榴（Punica granatum L.）基因型进行苗木纯度检测，维护育种者和果农
的利益，用 225 对 SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism）引物组合对其幼嫩叶片 DNA 进行了分析。 结果发
现其中 19 对 SRAP 引物组合的 23 个差异迁移位点的扩增条带稳定、清晰，可以将 4 个石榴基因型完全区分开，作为
其鉴别的标记。 将这些条带进行数据化记录和分析，发现仅用 ME8/EM11 和 ME9/EM18 位点的共计 3 个差异迁移位
点的数据即可将供试的 4 个材料区分开。 将这些数据输入 Excel 数据表格，获得了由系统自动生成的 4 个石榴基因
型“分子身份证” 号码，可作为这 4 个石榴基因型间的鉴定依据。
关键词： 石榴； SRAP； 分子标记； 品种鉴定； 分子身份证
中图分类号：S665．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2010)04－631－05
Identification of 4 pomegranate genotypes using SRAP
XUE Hua-bo1， GUO Jun-ying1，SI Peng1，WANG Jun-na2，WU Guo-liang2，CAO Shang-yin1*
（1Zhengzhou Fruit Research Institute，CAAS，Zhengzhou，Henan 450009 China； 2College of Horticulture，Henan Agricultural University，
Zhengzhou，Henan 45002 China）
Abstract: For the convenience of checking on the nursery stock purity of four pomegranate （Punica granatum L.） genotypes
which were popularized in production and for the protection of the benefit of breeders and growers， two hundred and twenty-
five SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism） primer pairs were used to analyze the DNA from the tender leaves of
these four pomegranate genotypes. Amplification products were analysed by electrophoresis on 8％ Non-denaturing polyacry-
lamide gel and then checked by silver staining. The results suggested that twenty-three discrepant alleles amplified by nine-
teen SRAP primers were stable and clear， which could be used to identify the four pomegranate genotypes. The results also
showed that only using three alleles amplified by ME8/EM11 and ME9/EM18 could differentiate this four materials. The data
from the three alleles were entered into an Excel program and then the system automatically create the molecular identity card
numbers of four pomegranate genotypes which could be used to identify the four genotypes.
Key words: Punica granatum L.； SRAP； Molecular marker； Cultivar identification； Molecular ID
收稿日期： 2009－08－11 接受日期: 2010－04－17
基金项目： 河南省科普项目
作者简介： 薛华柏，男，助研。 主要从事果树育种及分子生物学研究。 E-mail: x_bh@163.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 0371-65330963，E-mail: s.y.cao@163.com
石榴（Punica granatum L.）为石榴科（安石榴科）
（Punicaceae）石榴属（Punica L.）落叶灌木或小乔木[1]。
石榴果实营养成分丰富 [2]，除鲜食外，还可加工成果
汁、酒、露等，发展前景广阔。 近几年，石榴种植面积
迅速扩大，苗木品种混杂现象特别严重，给生产造成
了极大的混乱。进行品种鉴定，确保品种的真实性和
纯度，对加快石榴良种化进程，促进产业发展，维护
育种者和生产者的利益具有重要意义。
分子标记技术的发展为果树品种鉴定提供了更
为快速准确的途径。 SRAP （sequence-related ampli-
fied polymorphis） 是一种新型的基于 PCR 的标记系
统，其上游引物核心序列为“GGCC”，下游引物核心
序列为“AATT”，反映的是不同基因型启动子、内含
子和间隔序列间的长度多态性[3]，是一种显性标记系
统。 SRAP技术因其简单、快速、稳定性强，无需预知
序列信息、多态信息含量丰富等优点，反应体系已在
柑橘[4]、荔枝[5]、樱桃[6]、柿子[7]、龙眼[8]、石榴[9]等果树中
建立并得到广泛应用。 昝逢刚等 [5]利用 22 对 SRAP
引物研究荔枝种质遗传多样性， 产生的多态性条带
占总带数的 97.73%。李莉等[10]利用 19对 SRAP引物
对 26 份枣材料进行研究， 结果发现多态率达到
98.28%。 张春雨等 [11]利用 SRAP 技术研究新疆野苹
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2010.04.029
果 树 学 报 27 卷
表 1 SRAP 引物序列
Table 1 Sequences of SRAP Primers
正向引物 Forward primers 反向引物 Reward primers
名称 Name 序列 Sequences（5→3） 名称 Name 序列 Sequences（5→3）
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
ME7
ME8
ME9
ME10
ME11
ME13
ME14
ME16
ME17
ME18
TGAGTCCAAACCGGATA
TGAGTCCAAACCGGAGC
TGAGTCCAAACCGGAAT
TGAGTCCAAACCGGACC
TGAGTCCAAACCGGAAG
TGAGTCCAAACCGGTTG
TGAGTCCAAACCGGTGT
TGAGTCCAAACCGGTCA
TGAGTCCAAACCGGTCT
TGAGTCCAAACCGGAGT
TGAGTCCAAACCGGACA
TGAGTCCAAACCGGACG
TGAGTCCAAACCGGAGG
TGAGTCCAAACCGGAAA
TGAGTCCAAACCGGAAC
EM1
EM2
EM3
EM5
EM9
EM10
EM11
EM12
EM13
EM14
EM15
EM16
EM17
EM18
EM19
GACTGCGTACGAATTAAT
GACTGCGTACGAATTTGC
GACTGCGTACGAATTGAC
GACTGCGTACGAATTAAC
GACTGCGTACGAATTACG
GACTGCGTACGAATTTAG
GACTGCGTACGAATTTCG
GACTGCGTACGAATTGGT
GACTGCGTACGAATTCGG
GACTGCGTACGAATTCAA
GACTGCGTACGAATTCAC
GACTGCGTACGAATTCAG
GACTGCGTACGAATTCAT
GACTGCGTACGAATTCTA
GACTGCGTACGAATTCTC
果遗传多样性，发现多态率为 98.58%。张四普等[9]利
用 7 对 SRAP 引物对 23 个石榴基因型遗传多样性
进行了分析，共扩增出 1380 个条带，其中多态性条
带为 662 个，多态率为 48%；鉴于其电泳检测用的
是分辨率较低的琼脂糖凝胶，而非聚丙烯酰胺凝胶，
实际的多态率可能会高一些，SRAP 技术应该可以
用于石榴的遗传多样性和分子身份识别系统的研
究。
突尼斯软子石榴是河阴石榴产区目前的石榴主
栽品种，中农红软子石榴、红如意软子石榴和中农黑
子甜石榴则是该区比较有发展前景的几个石榴基因
型。近年来，这 4个石榴基因型每年投入市场的苗木
数量巨大 （仅突尼斯软子石榴和中农红软子石榴每
年投入市场的苗木数量就超过 100 万株）， 相互混
杂、抵充的现象时有发生。笔者利用 SRAP标记对这
4 个发展潜力巨大的基因型进行鉴定，并利用 Excel
建立这 4个基因型的分子身份识别系统， 以期为石
榴种质的分子鉴定提供借鉴， 为净化石榴苗木市场
尽绵薄之力， 并为在更大的范围内建立石榴的分子
身份识别系统做一些有益的尝试。
1 材料和方法
1.1 材料
所用材料为中农红软子石榴、红如意软子石榴、
突尼斯软子石榴、 中农红黑子甜石榴等 4 个石榴基
因型的叶片， 叶片由 1 a 生休眠枝在光照培养箱中
水培获得， 枝条于 2009年 3月 10日取自中国农业
科学院郑州果树研究所石榴资源圃。
1.2 仪器和设备
实验使用的主要仪器有： 电泳仪 （北京六一，
DYY-12），高速冷冻离心机（Hettich，MICRO 200R），
凝胶成像系统（培清，JS-680B），PCR 仪（Bio-Rad，
S1000）， 核酸蛋白分析仪 （Eppendorf，BioPhotome-
ter）， 移液器 （Eppendorf，Research）， 冰箱 （海尔，
BCD-215YD E）。
1.3 引物和试剂
选取已公布的 SRAP 上、 下游引物各 15 条，组
成 225对引物组合，由上海赛百胜生物有限公司合成。
引物名称及序列见表 1。 所用试剂除 Taq 酶购自
Takara外，其余试剂均购自郑州奥瑞吉生物有限公司。
1.4 方法
1.4.1 DNA 提取 DNA 提取采取微量 CTAB法[12]。
1.4.2 SRAP 扩增 SRAP 扩增总体系为 10 μL，其
中 10×buffer （Mg2+ free） 1 μL，Mg2+ 2 mmol·L-1，dNTP
mixture 0.8 mmol·L-1， 上下游引物各 0.2 μmol·L-1，
DNA 模板为 60 ng， Taq DNA 聚合酶 0.6 U。 扩增程
序是: 95℃变性 5 min； 95℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃
1 min，5个循环；95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，
30个循环；72℃延伸 5 min。
1.4.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 取 2.5 μL 的
扩增产物，在 300 V 电压下电泳 1.5 h，银染后照相
记录。
1.4.4 数据记录 选择在 4个石榴品种中表现出明
显差异的迁移位点进行记录， 根据条带的有无分别
记做“1”和“0”。
1.4.5 石榴品种分子身份识别系统数据表建立 按
照扩增条带稳定清晰、多态信息含量丰富、区分度高
的原则， 选择可将 4个石榴品种完全区分开的引物
组合，将其差异迁移位点特征条带的数据输入 Excel
表格，建立石榴分子身份识别系统。表格的字段由品
632
4 期 薛华柏等: 4 个石榴基因型的 SRAP 鉴定
表 2 石榴分子身份识别
Table 2 Identification table of pomegranate molecular IDs
基因型
Genotype
分子身份编号
Molecular ID
特征条带 Alleles
ME8/EM11
280bp
ME8/EM11
460bp
ME9/EM18
680bp
ME7/EM19
300bp
中农红软子 Zhongnonghongruanzi
红如意软子 Hongruyiruanzi
突尼斯软子 Tunisiruanzi
中农黑子甜 Zhongnongheizitian
0001
0100
1001
0011
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
1
0
1
1
图 1 ME8/EM11 引物组合扩增的结果
M. marker； 1. 红如意软子石榴； 2. 突尼斯软子石榴； 3. 中农红子籽
石榴； 4. 中农红黑子甜石榴
Fig. 1 Products of ME8/EM11 primer pairs
M. Marker；1. Hongruyiruanzi； 2. Tunisiruanzi；3. Zhongnonghongruanzi；
4. Zhongnonghongheizitian
种名称、分子身份编号和特征条带构成，其中特征条
带字段数目由差异迁移位点数目决定， 而品种的分
子身份编号则由特征条带各字段的数据按照字段顺
序由系统自动生成。 而数据查询则可方便地利用
Excel 数据表格“编辑（E）”菜单中的“查找（F）”功能
实现。若需要对品种进行介绍或标注，还可以增加诸
如备注等新的字段。
2 结果与分析
2.1 4个石榴品种的 SRAP扩增结果
在 4个石榴基因型中， 中农红软子石榴分别在
ME1/EM17 位点的 200、400 bp 处，ME1/EM18 位点
的 600 bp 处 ，ME7/EM9 位点的 150 bp 处 ，ME7/
EM19 位点的 300 bp 处，ME16/EM5 位点的 150 bp
处 ，ME16/EM19 位点的 200 bp 处有带 ， 除 ME1/
EM17位点的 200 bp 处条带外， 其余条带均可作为
其区别于中农红软子石榴的特征带。
红如意软子石榴分别在 ME16/EM14、ME16/
EM12、ME8/EM9、ME9/EM19、ME16/EM9、ME8/EM11
和 ME8/ EM13 等位点 400、350、310、300、500、400、
470 bp 处有特异扩增条带 ； 在 ME7/EM9、ME7/
EM19、ME16/EM5、ME16/EM19、ME1/EM17 等 位 点
的 150、300、150、200、400 bp 无条带，这些可以作为
红如意软子石榴与其他 3 个石榴基因型区分的标
记。
突尼斯软子石榴分别在 ME1/EM18、ME3/EM1
和 ME8 ／ EM11 引物位点的 280、230、120 bp 处有特
异扩增条带；在 ME1/EM17、ME8/EM16 位点的 150、
200 bp处缺失条带， 可以作为突尼斯软子石榴与其
他 3个石榴基因型区分的标记。
中农黑子甜石榴在 ME9/EM18 位点的 680 bp
处有特异条带，在 ME17/EM2 位点的 450 bp 处缺失
条带， 可以作为中农黑子甜石榴区别于其他 3 个石
榴基因型的标记。此外，中农黑子甜石榴和中农红软
子石榴在 ME1/EM18 位点的 600 bp 处有条带，在
ME2/EM15 位点的 280 bp 处无条带，这些也可以作
为中农黑子甜石榴和中农红软子石榴与另外 2 个石
榴基因型区分的标记。部分引物位点的电泳图见图 1。
2.2 石榴品种分子身份识别系统建立
经过筛选， 仅用 ME8/EM11 和 ME9/EM18 等 2
个引物组合进行 SRAP 扩增即可将供试的 4 个石榴
基因型分开。 将 4个石榴基因型在 ME8/EM11 位点
280 bp 和 460 bp 处的数据、ME9/EM18 位点 680 bp
处的数据和 ME7/EM19 位点 300 bp 处的数据输入
Excel数据表格，即获得了含有系统自动生成的 4 个
石榴基因型分子身份编号的石榴分子身份识别表
（表 2）。 该表信息含量丰富，简洁明了，品种（基因
型）名称和分子身份编号相对应，并且包含了引物组
合信息和迁移位点条带大小信息， 可方便地应用于
石榴分子鉴别。
3 讨 论
传统的形态学方法进行品种鉴定往往主观因素
影响较大，不够准确，而且苗期往往不容易鉴定，周
期较长。 DNA 分子标记反应的是基因组水平的内在
遗传信息，进行品种鉴定可以不受环境条件的影响，
可以大大提高鉴定的准确性和效率。截至目前，应用
分子标记指纹图谱技术进行品种鉴定的报道已经很
多，但多数仍然使用的是早期的特征谱带法 [13]，比对
633
果 树 学 报 27 卷
过程却仍然属于效率低下的手工劳动过程， 鉴定的
品种多了便出现弊端。从长远看，利用相对比较大的
品种群体从一批引物中筛选出部分稳定、清晰、多态
信息含量足够丰富的核心引物 [14]，构建一套通用性
好、稳定、准确的品种分子身份识别系统，将可方便
地进行品种鉴定和杂种后代鉴定，极大地节约人力、
物力和财力投入。 研究仅从近期需要出发鉴定了 4
个在生产上发展潜力较大、 市场上苗木数量较多的
石榴新品种， 似乎除了尝试并无建立分子身份证的
必要，但若建立了分子身份证，将来要从该 4 个品种
中鉴定其中之一， 仅需要对这一个品种依既定引物
顺序扩增、记录后进行查询即可，无需再与其余 3 个
品种的指纹图谱进行比对，高效而又经济，这就是构
建品种分子身份识别系统的意义所在。
已有的建立品种分子身份证的报道多采用共显
性的 SSR 标记，如张彦等 [15]利用 10 对 SSR 引物对
21 个水稻材料进行分子指纹分析，并将结果数据化
为相关水稻材料的分子身份证号码。 艾呈祥等 [16]从
38对 SSR引物中筛选出仅有 2 个等位基因，能够扩
增出稳定带型且不同材料之间差异明显的 10 对引
物对 24 个甜樱桃品种进行分子指纹分析， 并将结
果数据化为甜樱桃品种的分子身份证号码。 高运来
等 [17]以黑龙江 83 份大豆品种为材料，43 对 SSR 引
物中筛选出 9对引物构建了一套黑龙江省大豆品种
的分子身份证。 本研究利用显性的 SRAP 标记尝试
构建了石榴品种的分子身份识别系统。 与共显性标
记相比， 利用显性标记构建品种的分子身份识别系
统需要选择稳定而易于辨认的特定迁移位点的等位
基因（allele）进行记录，而非对同一位点的所有等位
基因都进行记录。 在数据记录上也仅区分 “有”和
“无”，分别用“1”和“0”赋值。 假设记录 n 个等位基
因， 且不排除某一品种在所有等位基因位点均无产
物的情况，那么总共可以区分的品种就是 2n 个。 若
按照国内目前不到 300份的石榴品种资源保有量计
算， 理想状况下仅需筛选 9个等位基因的数据就足
以将所有资源区分开。 研究所建立的石榴分子身份
识别系统只采用了 3对引物组合的 4个差异迁移位
点的数据， 用于在供试 4个基因型之中进行精确鉴
定；鉴于 SRAP 丰富的多态性，若要将鉴定扩大到更
多的石榴基因型上， 在更大范围的石榴群体中进行
SRAP 标记的筛选， 对该系统进行相应的数据补充
应该也是可行的（目前这部分工作正在进行中）。
此外， 在多数构建品种分子身份识别系统的
研究中， 均采用或开发特定的程序软件来管理数
据[13-15]。 本研究将数据直接输入 Excel，利用 Excel自
带的函数可方便地编程， 实现分子身份识别系统所
需功能，也完全能够满足数据管理的需要。 而 Excel
本身的数据容量、简易高效的编程实现能力，足以满
足石榴等样本较小的树种构建分子身份识别系统的
需要，可以省却大量的编程工作量。
4 结 论
SRAP 标记能够用于石榴品种的分子鉴定，研
究从 19 对 SRAP 引物组合扩增出的 23 个稳定、清
晰的差异迁移位点中仅用 ME8/EM11 和 ME9/EM18
引物组合的共计 3个差异迁移位点的数据即可以将
中农红软子石榴、 红如意软子石榴、 突尼斯软子石
榴、 中农红黑子甜石榴等 4个石榴基因型完全区分
开。 把这些数据输入 Excel数据表格，获得了由系统
自动生成的 4 个石榴基因型“分子身份证” 号码，表
明 SRAP 技术可以用于构建石榴的分子身份识别系
统。
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