全 文 ：南 方 林 业 科 学
South China Forestry Science
第 44卷第 3期
2016年 6月
Vol. 44， No.3
Jun., 2016
棱角山矾叶型变异分析与变异类型的分子甄别
温 强，黄建建，田 径，叶金山，黄小春，杜 强★
（江西省林业科学院省植物生物技术重点实验室，江西 南昌 330013）
摘 要：本研究以研究组初步筛选的 4个编号 I- IV的棱角山矾叶型变异类型为研究对象，开展其叶型变异分析及
基于 ISSR分子标记的变异类型分子甄别。叶型变异分析表明，4个类型的叶长、叶宽尺度均呈现Ⅰ型<Ⅱ型<Ⅲ型<Ⅳ型
趋势。Ⅰ型与Ⅱ型的叶型指数数值相近，这与两者具有相似的叶片形状一致。Ⅰ型叶型指数变异系数最小（7.57），同时
叶长与叶宽显著相关（r=0.908，p<0.01），说明该类型叶片生长过程中长与宽的扩展速度相对一致。变异类型的 ISSR分
子甄别显示 4个类型的基因多样度为 0.2562。利用 UBC843、UBC848及 UBC8453个分子标记可一次性鉴别 4个类型。
亲缘关系分析显示，Ⅰ型与其他 3个类型的亲缘关系最远，Ⅲ型与Ⅳ型亲缘关系最近；采用 UPGMA法按遗传距离进行
聚类，属于小叶型的棱角山矾Ⅰ型与Ⅱ型聚成一类，与大叶型的Ⅲ型与Ⅳ型成组分离，这与 4个类型的表型表现一致。
综合表型与分子数据，Ⅰ型可进一步作为棱角山矾小叶型品种进行培育。
关键词：棱角山矾；叶型变异；ISSR分析；分子甄别
分类号：Q944:Q949.775.4 文献标识码：A 文章编号：2095－9818(2016)03－0019－04
Analysis of leaf shape variation and molecular screening of variation
types in Symplocos tetragona
Wen Qiang, Huang Jianjian, Tian Jing, Ye Jinshan, Huang Xiaochun, Du Qiang★
(Jiangxi Provincial Biotech Key Lab for Plant, Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang Jiangxi 330013, China)
Abstract: The analysis of leaf shape variation and molecular screening of variation types based on ISSR (inter -simple
sequence repeat) molecular marker for four leaf type variation numbered type I-IV of Symplocos tetragona was carried out in
this study. The 4 types had a trend to elongate their leaves length and width followed by type I< type II < type III < type IV.
The leaf shape index values of type I and type II are similar, which is similar to both of the same blade shape. The variation
coefficient of leaf shape index of type I was the smallest (7.57), and the leaf length and leaf width were significantly
correlated (r=0.908, p<0.01), which is showed that the length and width of the growth process of this type of leaf blade are
relatively uniform. Variant type of ISSR molecular screening showed genetic diversity of 4 types was 0.2562. Using three
molecular markers of UBC843, UBC848 and UBC845, 4 types could be identified. The relationship analysis for 4 types
showed that type I was farthest to the other three, while types III was most similar to type IV. Using UPGMA (unweighted
pair group method using arithmetic averages) method, type I and type II can be clustered in one group，and type III and type
IV can be clustered in another. It was according with the relative morphologies of the 4 types. Comprehensive phenotypic and
molecular data, type I as a type of lobular type varieties could be cultivated.
Key words: Symplocos tetragona; variation of leaf type; ISSR analysis; molecular screening
DOI 编码：10.16259/j.cnki.36-1342/s.2016.03.005
收稿日期：2015-12-2；2015-12-16修回
基金项目：中央财政林业科技推广示范项目“优良抗污染景观绿化树种棱角山矾培育技术推广与示范”（项目编号：JXTG［2013］10号）。
作者简介：温强，男，博士，副研究员，研究方向：林木种质资源与分子标记辅助育种。
★通信作者：杜强，男，高级工程师，主要从事林木种质资源收集与利用。
棱角山矾（Symplocos tetragona）是山矾科（Symp-
locaceae）山矾属常绿乔木，其主干明显，四季青翠，树
冠呈圆锥状，外形优美，叶片油绿有光泽，极具观赏价
值，有“留春树”的美誉，是优良的庭院绿化和风景林
树种。 除具有良好的景观效果，棱角山矾林丛林带可
用作隔离噪音的绿色幕墙，有很好的隔音作用 ［1］，此
外该树种对二氧化硫、氟化氢等混合大气污染物表现
出较强的抗性［2］，是非常好的厂区、城市道路绿化树种。
近年来， 作为观赏及生态应用价值俱佳的树种，
棱角山矾被大力推广应用于园林绿化。但在目前生产
南 方 林 业 科 学 第 44卷
应用中该树种现有苗木生产主要以实生苗木及一般
苗木无性扦插繁殖为主， 品种或品系选育未见报道。
当前有关棱角山矾的研究集中在大气污染抗性机理［3］、
播种繁殖技术［4］、扦插繁殖技术及生根机理［5］等方面。
园林植物器官性状的遗传变异是品种选育的重
要基础［6］。 尤其如叶片作为植物的重要营养器官，既
是光合作用的基础，也是生理生化、遗传育种等研究
所涉及的重要内容之一［7-8］。 棱角山矾在栽培过程中，
常会发生一些自然或人工变异，尤其叶型变异较为显
著，而叶片性状对于棱角山矾的观赏及生态价值可产
生直接的影响。 ISSR （inter-simple sequence repeat）
分子标记技术作为植物品种鉴别，属、种、品种等不同
分类单元的亲缘关系分析等研究的常用手段已广泛
被开展应用［9］。 为加快棱角山矾的品种化进程，本研
究按其叶型特点，初步筛选并无性系固定了 4 个叶型
变异较大的类型，在对大田苗进行叶型变异分析的同
时，结合 ISSR分子标记技术，开展棱角山矾叶型变异
类型的分子甄别， 探讨其遗传变异的特异性与稳定
性，以期为棱角山矾新品种的选育提供理论依据与技
术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料与样地概况
棱角山矾 4 种变异类型来源于普通的棱角山矾
子代实生苗，编号 I～Ⅳ，叶型特点见图 1，其特点描述
见表 1。 试验圃地于江西省九江市永修县恒丰镇牛头
山恒丰农场黄金山分场， 属中亚热带季风湿润气候，
雨量充沛，日照充足，四季分明。 年平均气温 17.1 ℃，
极端最低气温－10.1 ℃， 年均降雨量 1 765.8 mm，年
均无霜期 245 d。 年均日照时数 1 774.6 h，≥10 ℃年
均积温为 4 480 ℃～4 590 ℃；地势平缓，平均海拔 43
m，土壤为酸性红壤，质地为沙壤土，土壤养分较好。
图1 棱角山矾4种变异类型叶型对比
Fig. 1 Comparison of the leaf style of four types of S. tetragona
注：图中自左而右，两两一组，分别为编号Ⅰ～Ⅳ的 4 种棱角山
矾叶型变异类型的叶面与叶背的对照。
1.2 叶型变异的测定方法
调查棱角山矾 4 种变异类型的当年生小枝的叶
片长度、叶宽、叶型指数等性状指标。 叶长、叶宽用数
显游标卡尺测量。 叶型指数=叶长/叶宽。 每株按树冠
上部采 10个标准小枝进行测量，叶长、叶宽计算其平
均值作为该植株的性状指标。 各指标值按公式计算：
CV=s/M×100，其中的 CV 变异系数，s 为标准差，M 为
平均值。 R=RMAX－RMIN，其中 R为极差，RMAX为最大值，
RMIN为最小值。
1.3 棱角山矾变异类型的 ISSR甄别体系建立
采用改进的 CTAB 高盐法提取 ［10］棱角山矾 4 个
类型的无性系植株幼叶总基因组 DNA。 针对 Mg2＋、
dNTPs、DNA 模板、Taq 酶、引物、退火温度等 6 个影
响 PCR 扩增关键因子，进行单因子多水平梯度筛选，
优化建立棱角山矾的 ISSR-PCR 反应体系，总反应体
积为 20 μL。 从 100 条 UBC 系列引物中筛选出可用
来甄别棱角山矾 4 种类型的 ISSR标记。 引物由生工
公司合成，所用酶及试剂来自于宝生生物公司。 PCR
扩增反应在 PTC—200 温度梯度 PCR 仪（Bio-Rad 公
司） 上进行。 采用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产
物，以 100 bp DNA Marker（Formentas life sciences 公
司）为分子量标准，用 BIO-RAD凝胶成像仪观察拍照。
1.4 ISSR数据统计分析
扩增谱带按 1/0 进行数字化处理，显带记为“1”，
缺失或模糊不清记为“0”，得到的 1/0 矩阵。 统计谱
带，据分子量大小标准获得可用于比较各类型差异的
特征谱带。 利用 Popgen32 软件［11］计算基因多样度及
Shannon 信息指数等遗传参数 。 采用 NTSYSpc
Version2.10软件 ［12］的 SIMQUAL（Similarity forQualitative
Data）法计算种间及种内水平的遗传相似系数（F），其
中 Nei的遗传相似系数计算公式为：F= 2Ny/（ Ni+Nj）
（式中：Ny为试样 i 和 j 公共的条带数，Ni 为试样 i 的
总带数，Nj 为试样 j 的总带数）。 遗传距离 D= -lnF。
并采用该软件的 SAHN （Sequential Agglomerative
Hierarical Nested cluster analysis）功能，根据 UPGMA
（Unweighted pair group method using arithmetic
averages）法进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 棱角山矾 4种变异类型的叶型比较
统计棱角山矾 4 个变异类型的叶型参数，Ⅰ型与
Ⅱ型属于小叶型棱角山矾，其中尤其Ⅰ型与其他 3 个
类型的叶形态差异最大；Ⅲ型叶色较深，叶型较接近
于普通的棱角山矾；Ⅳ型叶色较浅，表现为黄绿色，同
植株内新叶与老叶颜色变化不大。 4 个类型的叶长、
叶宽大小均呈现Ⅳ型>Ⅲ型>Ⅱ型>Ⅰ型趋势。 叶型指
数则显示Ⅱ型最小（2.74），Ⅰ型次之，Ⅲ型与Ⅳ型数
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第 3期
值相似表现最大， 这与Ⅰ型与Ⅱ型叶片近卵形一致。
从 4 个类型的叶型指数变异系数来看， 数值 7.57～
37.11，Ⅰ型叶型指数变异系数最小，显示该类型叶片
形状大小比例较为均一，从实际表现来看，该类型叶
长与叶宽显著相关（r=0.908，p<0.01），即同等大小叶
片形状差异较小。
表 1 棱角山矾 4 种变异类型的叶片性状主要指标值统计分析
Tab. 1 Analysis of main indexes of leaf traits of four types of S. tetragona
编号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
总体描述 叶长披针形，叶面黄绿色，
统计项目
叶长
/ mm
叶宽
/ mm
叶长
/ mm
叶宽
/ mm
叶长
/ mm
叶宽
/ mm
叶长
/ mm
叶宽
/ mm
叶型
数
平均值 72.70 24.38 3.00 99.74 36.54 2.74 154.84 43.21 3.82 147.99 40.38 3.82
标准差 11.20 4.16 0.23 9.54 3.71 0.28 21.21 9.59 1.42 16.75 6.81 1.22
变异系数 15.40 17.07 7.57 9.56 10.16 10.05 13.70 22.20 37.11 11.32 16.86 31.83
最大值 92.78 32.82 3.38 114.15 43.84 3.12 186.85 50.22 9.67 176.91 46.93 8.83
最小值 50.01 19.18 2.61 80.76 27.05 2.40 119.50 13.85 2.41 122.54 17.23 3.01
极差 42.77 13.64 0.77 33.39 16.79 0.72 67.35 36.37 7.26 54.37 29.70 5.82
叶型
指数
叶型
指数
叶型
指数
叶长披针形，叶面深绿色叶长卵形，叶面深绿色小叶卵形，叶面深绿色
2.2 棱角山矾 ISSR扩增条件及多态性引物筛选
通过单因素优化试验， 筛选出适合棱角山矾
ISSR-PCR 的最佳反应条件为：在总体积为 20 μL 的
体系中，DNA 模板为 50 ng，Mg2+浓度为 2.5 mmol/L，
dNTPs 浓度为 0.2 mmol/L， 引物浓度为 0.5 μmol/L，
Taq 酶用量为 1 U。 优化扩增程序为：94 ℃预变性 5
min；94 ℃变性 30 s，引物相应退火温度退火 45 s，72
℃延伸 90 s，反应 38个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
表 2 ISSR 标记 8 个多态性引物扩增结果
Tab. 2 Amplified results of 8 polymorphic primers on
ISSR marker
*R = （A，G），Y = （C，T），H = （A，C，T），V = （A，C，G）
从 100 条 ISSR UBC 系列引物中， 经初步筛选，
共获得 26条谱带清晰、产物丰富的引物；经进一步复
筛， 从 26条引物中选取 8条适合棱角山矾扩增的多
态性引物。为避免误判，适当地将位点数据进行调整，
统计位点信息， 利用 8 条引物共扩增出总位点数 60
个，其中物种水平的多态位点数 51个，多态位点百分
比为 85%。 各引物序列参数及扩增位点数见表 1。
2.3 棱角山矾 4种变异类型的 ISSR甄别
用表 1 所示 8 条 ISSR 多态性引物对棱角山矾 4
个类型的 DNA 进行 PCR 扩增 ， 其中 ISSR 引物
UBC843、UBC848 及 UBC845 电泳谱带可各自独立将
4个类型一次性区分出来， 扩增的 DNA指纹见表 3，
PCR 扩增电泳检测见图 2。 扩增结果用 Popgene32软
件进行统计分析。 分析结果表明，紫花含笑种内水平
的基因多样度为 0.2562，Shannon 多样性指数为
0.3701， 说明棱角山矾类型间存在一定的遗传多样
性。 4 个类型遗传距离相比，Ⅰ型与其他 3 个类型的
遗传距离差距最大，显示Ⅰ型与其他 3 个类型的亲缘
关系最远，这与其特异的表型一致；而两两相比，Ⅰ型
与Ⅲ型遗传距离最大为 0.6931，Ⅲ型与Ⅳ型遗传距离
最小仅 0.1431。 可见 DNA水平的差异与形态差异相
对一致。4个类型遗传距离聚类见图 3，显示 4个类型
分成两大类，Ⅰ型与Ⅱ型聚成一组，Ⅲ型与Ⅳ型聚成
另一组。
图 2 部分 ISSR 引物在棱角山矾 4 个类型中的 PCR 扩增
Fig. 2 Electrophoresis results of ISSR-PCR to genome
DNA of S. tetragona
引物 引物序列 总带数
多态
带数
退火温
度(TM)
UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 9 8 53
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 6 5 53
UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 6 4 54
UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 9 6 52
UBC841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 7 6 52
UBC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 6 6 54
UBC845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG 8 8 54
UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 9 8 54
温强等：棱角山矾叶型变异分析与变异类型的分子甄别 21
南 方 林 业 科 学 第 44卷
注：编号 1-4 分别对应棱角山矾Ⅰ-Ⅳ型变异，自左向右，4 个
一组分别对应为 ISSR 引物为 UBC843、UBC848 及 UBC845 的
PCR 扩增。 M 为 100 bp Marker。
表3 棱角山矾4个类型的DNA指纹
Tab. 3 Identifying pattern of ISSR fingerprint for
varieties of S. tetragona
图3 棱角山矾4种变异类型的Nei遗传距离UPGMA聚类图
Fig. 3 UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic distance
within four types in S. tetragona
3 讨论
棱角山矾是重要的园林绿化树种。作为重要的常
青树种，叶片形态是其主要的观赏价值来源。 在长期
的人工栽培过程中，棱角山矾表现出外部形态的多样
化，尤其叶型、叶色的变异较为明显。因而依据较为特
异的叶片形态， 选择棱角山矾的观赏特异新品种，是
棱角山矾品种选育的重要内容。本研究首次开展棱角
山矾叶型变异类型的筛选研究，据叶片的主要性状为
主要特征，筛选出 4 个类型并进行无性系固定。 4 个
棱角山矾类型中Ⅰ型与Ⅱ型属于典型的小叶型。 从 4
个类型的叶片变异系数来看，Ⅰ型与Ⅱ型叶型指数的
变异系数均低于 15， 其中Ⅰ型叶型指数变异系数最
小（7.57）。 有研究表明当变异系数数值低于 15 时为
低度变异，而变异系数高于 30时则为高度变异［13］。比
较数据，棱角山矾Ⅰ型叶型性状处于较低水平的遗传
变异。 此外，本研究发现棱角山矾Ⅰ型叶片性状中叶
长与叶宽存在极显著性正相关，说明叶片生长过程中
长与宽的扩展速度相对一致。 综合表型数据，说明棱
角山矾Ⅰ型叶型形状较为特异，同植株内叶片变异较
小，叶型大小较为均一。
针对棱角山矾的 4 个变异类型，本研究开展了基
于 ISSR分子标记的类型甄别。 研究结果显示，4 个类
型的基因多样度为 0.2562， 表现出较高的遗传多样
性；可用 UBC843、UBC848 及 UBC845 三个分子标记
一次性鉴别 4 个类型，同时遗传聚类显示属于小叶型
的棱角山矾Ⅰ型与Ⅱ型有较近的遗传关系，与叶型较
大的Ⅲ型与Ⅳ型分组聚类，而Ⅰ型与其他 3个类型的
亲缘关系最远，Ⅲ型与Ⅳ型由于表型接近，两者关系
最为接近， 结果表明形态上的差别是 DNA水平差异
的外在表现。表型的特异性与遗传背景的独立性是品
种选择的重要依据， 据叶型特征并结合分子标记数
据，可初步推断小叶型的Ⅰ型与Ⅱ型，遗传性状稳定，
表型变异特征突出，尤其表现更为特异的Ⅰ型叶片小
巧精致，叶色深绿，整体树形具一定美感，在将来可进
一步作为小叶型棱角山矾新品种进行培育。
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引物扩增位点 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
UBC843 0110011 111011 110111 110110
UBC845 01100111 01011111 11001110 01001110
UBC848 001010111 010010110 110110110 101111110
棱角山矾Ⅰ型
棱角山矾Ⅱ型
棱角山矾Ⅲ型
棱角山矾Ⅳ型
genetic distance
0.52 0.43 0.33 0.24 0.14
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